Laccase-mediaator süsteem, mis kasutab melaniini värvi kaotamiseks valgendava ainena looduslikku vahendajat, 1. osa

Abstraktne: Selles uuringus töötati melaniini värvitustamiseks valgendava ainena välja laktaasi-mediaatorsüsteem (LMS), mis kasutas looduslikku vahendajat. Sünteetiliste vahendajate asendamiseks kasutati seitset looduslikku vahendajat, et edukalt ületada laktaasi madal redokspotentsiaal ja melaniini piiratud juurdepääs laktaasi aktiivsele saidile. Trametes versicolori (lacT) ja Myceliophthora thermophila (lacM) lakkaaside melaniini värvitustamise aktiivsust suurendati märkimisväärselt, kasutades looduslikke vahendajaid, sealhulgas atsetosüringooni, syringaldehüüdi ja atsetovanilooni, mis näitasid madalat tsütotoksilisust. Looduslike vahendajate metoksü- ja ketoonrühmad mängivad melaniini värvimuutuses olulist rolli. LacT ja lacM spetsiifilisuse konstandid melaniini värvitustamiseks suurenesid vastavalt 247 ja 334 võrra, kui vahendajana kasutati atsetosüringooni. Pitsi ja atsetosüringooni kasutav LMS võib samuti värvituks muuta tselluloosi hüdrogeelkiles oleva melaniini, mis jäljendab naha seisundit. Lisaks võib LMS värvituks muuta mitte ainult sünteetilisi eumelaniini analooge, mis on valmistatud türosiini oksüdeerimisel, vaid ka melanoomirakkude poolt toodetud looduslikku melaniini.

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant, põletikuvastanejaimmuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism cistanche janaha valgendaminepeitub cistanche antioksüdantses toimesglükosiidid. Melaniininimese nahas toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas, ja oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, seega muutuvad keha hapnikuvabad radikaalid oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Cistanche sisaldabtsistanosiid, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.

Klõpsake valikul Rou Cong Rongi eelised valgendamiseks

Lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Sissejuhatus

Lakaasid (EC 1.10.3.2, benseendiool: dihapniku oksidoreduktaasid) on multivaskvalgud, mis katalüüsivad erinevate fenoolsete ja mittefenoolsete ühendite oksüdatsiooni radikaali katalüüsitud reaktsioonimehhanismi kaudu, redutseerides molekulaarset hapnikku [1,2]. Lakaase on kasutatud biodegradatsiooniprotsesside biokatalüsaatoritena, nagu värvainete [3, 4], ravimite [5, 6], herbitsiidide [7] ja delignifitseerimise [8–10] bioremediatsioonis. Lakaase on kasutatud ka värvainete prekursorite ja orgaaniliste ühendite polümerisatsiooni katalüüsimiseks [11]. Eriti nende atraktiivsed omadused, nagu madal substraadi spetsiifilisus, hapniku kasutamine lõpliku elektroniaktseptorina, vee teke kõrvalsaadusena ja peroksiidide nõudluse puudumine (või tootmise puudumine), muudavad need biotehnoloogilises ja keskkonnaväljad [1,11,12].

Neli vase iooni aktiivses kohas osalevad laktaasi katalüütilises aktiivsuses. "Sinine" vask (T1 sait) oksüdeerib substraadi ja kolmetuumaline vase klaster (T2/T3) võtab vastu elektronid T1 saidilt, et redutseerida molekulaarset hapnikku [1,12,13]. Eelkõige peetakse T1 saidi Cu redokspotentsiaali peamiseks teguriks laktaaside katalüütilise võime määramisel [14]. Lakaasidel on suhteliselt madal redokspotentsiaal (0,4–0,8 V) võrreldes ligninolüütiliste peroksidaasidega (üle 1 V), nagu mangaanperoksüdaas ja ligniini peroksidaas. Lakaasid ei saa otseselt oksüdeerida mittefenoolseid substraate, mille redokspotentsiaal on üle 1,3 V [13,14]. Seetõttu lakkaasi piirangute ületamiseks lakkaasi vahendaja süsteemid (LMS), mis kasutavad väikemolekulaarseid ühendeid, nagu 2,20 -asinobis(3- etüülbenstiasoliin-6-sulfonaat) (ABTS), { {24}}hüdroksübensotriasool (HOBt), vioolhape (VLA), N-hüdroksüftaalimiid (HPI), N-hüdroksüatsetaniliid (NHA) ja TEMPO, mis toimivad redoksmediaatoritena, on pakutud [15–17].

Need vahendajad võimaldavad suuremahuliste ühendite oksüdeerimist erinevate oksüdatsiooniteede kaudu. Laccase-ABTS süsteem oksüdeerib substraate, tekitades elektronide ülekande (ET) mehhanismi kaudu katioonse ABTS-i radikaali. HOBt, VLA, HPI või NHA-ga LMS-id toodavad vesinikuaatomi ülekandemehhanismi (HAT) kaudu nitroksüülradikaale [1,12,17]. Lisaks reageerivad vahendajad nagu TEMPO ja selle analoogid ioonsete radade kaudu, tekitades oksoammooniumiioone [1,12,18]. Nende vahendajate kasutamine võib oksüdeerida mitmesuguseid ühendeid erinevates rakendustes, näiteks värvide lagunemisel [3, 4], ravimite lagunemisel [5, 6] ja ligniini lagunemisel [8–10]. Sellegipoolest on sünteetiliste vahendajate kasutamine tööstusvaldkondades piiratud nende potentsiaalse toksilisuse, kõrge hinna ja ensüüme inaktiveeriva toime tõttu. Hiljuti on hakatud kasutama ligniinist pärinevaid fenoolmolekule looduslike vahendajatena (nt süstaldehüüd, atsetosüringoon, vanilliin, atsetovanilloon, metüülvanillaat, feruulhape, sinapiinhape, p-kumaarhape jt), mis asendavad sünteetilisi vahendajaid [1,12] . Looduslike vahendajate eelisteks on odav hind ja madal toksilisus, kuna neid saadakse looduslikest ja taastuvatest allikatest [19].

Melaniin on looduslike pigmentide rühm, mida toodetakse melanogeneesi teel türosiini oksüdatiivse polümerisatsiooni teel melanotsüütide poolt. Loodusliku melaniini võib liigitada viide kategooriasse: eumelaniin, feomelaniin, kõik melaniinid, feomelaniin ja neuromelaniin [20]. Hiljuti on uuritud erinevaid meditsiinilisi ja elektrokeemilisi rakendusi, milles kasutatakse melaniini või melaniini prekursoreid [20,21]. Inimese nahavärvi määrab enamasti melaniini olemasolu. Kosmeetikatööstuses on nahka valgendavate ainete väljatöötamiseks pakutud melaniini otsest depigmentatsiooni ensüümide abil. Melaniini värvi eemaldamiseks on uuritud mitmeid peroksidaase. Woo jt. näitas, et sünteetilist melaniini saab otse värvituks muuta P. chrysosporium'i ligniini peroksidaas [22]. Keneko ja Mohorˇciˇc rühmad teatasid ka melaniini ensümaatilisest värvimuutusest seentest (Sporotrichum pruinose ja Phlebia radiata) eraldatud mangaanperoksidaasi toimel [23,24]. Kim et al. teatasid, et mangaanperoksidaasi, ligniini peroksidaasi ja laktaasi sisaldavad töötlemata ensüümide segud näitasid melaniini depigmentatsiooni aktiivsust [25]. Kui peroksidaasid eemaldavad melaniini värvi, vajavad nad vesinikperoksiidi (H2O2) kui kofaktorit, mis võib nahka ärritada. Seega lisati H2O2 kasutamise vähendamiseks ensüümide kombinatsioonisüsteemi glükoosoksüdaas või laktaas [26,27]. Lakaasid võivad melaniini värvituks muuta ilma vesinikperoksiidi kasutamata. Khammuang ja Sarnthima teatasid, et Lentinus polycarpous Lév'i lakkaas näitas melaniini värvimuutusaktiivsust, kasutades vahendajatena ABTS-i, vanilliini ja vanillhapet [28].

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid

2.2. Melaniini värvitustamine LMS-iga

Küllastunud melaniini lahus (1,4 mg/ml) valmistati 3 mg sünteetilise melaniini lahustamisega 1,3 ml 10 mM NaOH-s. Lahust tsentrifuugiti kiirusel 8500 p/min 5 minutit, et eemaldada lahustumata melaniin, ja supernatant lahjendati 0,1 M sidrunhappe fosfaatpuhvriga (pH 3, 4, 5, 5,5, 6 või 7) ja seda kasutatakse LMS-i substraadilahusena. Melaniini kontsentratsioon substraadi lahuses oli 63 µg/ml ja seda kinnitati spektrofotomeetriliselt 475 nm juures. 0,8 ml melaniini substraadi lahust segati 0,1 ml vahendaja lahusega (0–1 mM) 1,5 ml Eppendorfi tuubis. Melaniini värvitustamise reaktsioon käivitati, lisades 0,1 ml laktaasi lahust (15,8 µg (0,6 U) lacT või 19,2 µg (1,8 U) lacM) melaniini ja vahendaja segule temperatuuril 25 ◦ C loksutavas veevannis kiirusel 120 p/min. . Pärast reaktsiooni reaktsioonisegu tsentrifuugiti ja supernatandi neeldumist mõõdeti 475 nm juures. Värvusetustamise saagis ( protsenti ) arvutati järgmise võrrandi abil:

Värvusetus (protsent) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. LMS-i melaniini värvitustamise kineetiline uuring

2.4. Looduslike vahendajate tsütotoksilisus

LMS-i looduslike vahendajate tsütotoksilisuse määramiseks kasutati B16F10 melanoomi rakuliini (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea). Vahendajate tsütotoksilisuse mõõtmiseks viidi läbi neutraalse punase (NR) test [29]. NR mõõdab elusrakkude lüsosoomide elujõulisust. Melanoomirakud kontsentratsiooniga 3 × 104 rakku jaotati 96-süvendiga plaadi igasse süvendisse. Pärast 24-tunnist kultiveerimist töödeldi rakke looduslike vahendajatega (1, 2, 5, 10, 22 ja 46 mM). Pärast 2-päevast täiendavat kultiveerimist töödeldi rakke DMEM-is lahustatud 50 µg/ml NR lahusega ja inkubeeriti 3 tundi. Pärast supernatandi eemaldamist imemise teel kasutati värvi ekstraheerimiseks NR-i desorbeerimislahust (1% jää-äädikhapet, 49% etanooli ja 50% destilleeritud vett). Pärast ekstraheerimisprotsessi mõõdeti neeldumise muutust lainepikkusel 540 nm.

2.5. Melaniini/tselluloosi hüdrogeelkile valmistamine ja värvitustamine

LMS-i värvitustamise aktiivsuse mõõtmiseks melaniini / tsellulooskile jaoks lõigati valmistatud hüdrogeelkile 1 × 2 cm suuruseks leheks. Hüdrogeeli kile kasteti 4 ml 0,1 M sidrunhappe fosfaatpuhvris (pH 5,5); seejärel lisati puhvrile 0,5 ml 1 mM atsetosüringooni ja 0,5 ml pitsilahust (2,5 U). Värvusetustamise reaktsioon viidi läbi veevannis raputamisega temperatuuril 120 pm ja 25 °C 3 tundi. Pärast reaktsiooni pesti kilet destilleeritud veega ja kinnitati küveti siseküljele, et mõõta spektrite muutust vahemikus 400–800 nm, kasutades UV/Vis spektrofotomeetrit. Samades tingimustes viidi läbi ka kontrollreaktsioonid ilma lacM või vahendajateta. Reaktsioonitingimustes ei tuvastatud melaniini vabanemist kilest ega melaniini/tsellulooskile värvimuutust. Lisaks registreeriti kolorimeetriga (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Jaapan) pärast LMS-i värvitustamisreaktsiooni melaniini/tsellulooskile värviparameetrite (L*, a* ja b* väärtused) muutus. ∆L (meetriline heleduse erinevus), ∆E (kogu värvierinevus), YI (kollasuse indeks) ja WI (valgeduse indeks) väärtused saadi järgmiste võrrandite abil [30–32]:

2.6. Loodusliku melaniini valmistamine

Looduslik melaniin saadi B16F10 melanoomirakkudest. Rakke töödeldi melaniini tootmiseks alfa-melanotsüüte stimuleeriva hormooniga. Pärast 4-päevast inkubeerimist püüti rakud kinni trüpsiin-EDTA abil ja töödeldi ultraheliga 10 minutit. Supernatant saadi tsentrifuugimisega kiirusel 8000 p/min 10 minutit ja seejärel reguleeriti pH väärtuseni 1,5, kasutades 6 M HCl. Lahust keedeti 100 ◦C juures 4 tundi, et hüdrolüüsida jääkvalgufraktsioone. Looduslikku melaniini sisaldavat lahust pesti atsetooniga, seejärel kloroformi ja etanooliga ning seejärel deioniseeritud veega, et eemaldada jäägid, nagu rakud, söötme komponendid ja valgufraktsioonid [33, 34]. Kõik pesuprotseduurid viidi läbi rohkem kui kaks korda. Lõpuks saadi looduslik melaniin külmkuivatamise teel ja seda kasutati LMS-i substraadina.

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Vahendajate mõju melaniini värvitustamisele LMS-i abil

Erinevate vahendajate mõju melaniini värvitustamise reaktsioonile LMS abil uuriti, kasutades kahte T. versicolori (lacT) ja M. thermophila (lacM) laktaasi (joonis 1).Kui lacT-d kasutati melaniini värvitustamiseks ilma vahendajata, oli värvitustamise saagis pärast 5-tunnist reaktsiooni vaid 1%. Kui HOBt kasutati lacT vahendajana, suurenes värvitustamise saagis pärast 5-tunnist reaktsiooni veidi 2 protsendini. Erinevate sünteetiliste vahendajate, nagu HOBt, ABTS, VLA ja TEMPO, kasutamine fenoolsete või mittefenoolsete ühendite lakkaas-katalüüsitud oksüdatsioonis suurendas oluliselt reaktsioonikiirusi [10, 15]. Kui sihtühendite ligipääs laktaasi aktiivsele saidile on piiratud nende steerilise takistusega, võivad laktaasi poolt moodustatud vahendajaradikaalid sihtühendeid tõhusalt oksüdeerida elektronide ülekande või vesinikuaatomi ülekandemehhanismi abil [12]. HOBt on oma suure redokspotentsiaali (1,1 V) tõttu LMS-is üks sagedamini kasutatavaid sünteetilisi vahendajaid [6]. Kuid HOBt ei ole hea kosmeetiline koostisaine, kuna see on raku toksilisus ja võime inaktiveerida laktaasi. Seega valisime LMS-i abil melaniini värvitustamise reaktsiooni jaoks seitse looduslikku vahendajat, atsetosüringooni, süstaldehüüdi, p-kumaarhappe, vanilliini, vanilliinhappe, vanillüülalkoholi ja atsetovanilooni. Huvitaval kombel toimivad kõik looduslikud vahendajad tõhusamate vahendajatena kui HOBt melaniini puudumise tõttu. Kui kasutati atsetosüringooni, süstaldehüüdi ja p-kumaarhapet, olid värvitustamise saagised 5-tunnise reaktsiooni järel vastavalt 28%, 22% ja 18%. Need tulemused näitavad looduslike vahendajate kasulikkust melaniini värvitustamise reaktsioonis LMS-iga. LMS-i vahendajad oksüdeeritakse lakkaasi toimel vahendajaradikaalideks ja vahendajaradikaalid kutsuvad esile melaniini oksüdatsiooni ja värvimuutuse. Kui puudujääki kasutati ilma vahendajata melaniini värvitustamiseks piisava reaktsiooniaja jooksul, mis võis saavutada tasakaaluoleku, oli värvitustamise saagis pärast 24-tunnist reaktsiooni 7 protsenti. Looduslikud vahendajad, välja arvatud vanillhape, toimivad pärast 24-tunnist reaktsiooni melaniini värvitustamiseks lacT poolt tõhusamate vahendajatena kui HOBt. Värvusetustamise saagis pärast 24-tunnist reaktsiooni, kasutades vahendajana vanillhapet, oli madalam kui pärast 5-tunnist reaktsiooni. Selle põhjuseks võib olla vanilliinhappe oksüdeeritud radikaali vormi madal stabiilsus. Kui kasutati atsetosüringooni, süstaldehüüdi ja atsetovanilooni, olid värvitustamise saagised pärast 24-tunnist reaktsiooni vastavalt 34%, 30% ja 31%. p-kumaarhape oli esialgse reaktsioonikiiruse suurendamisel tõhusam kui atsetovanilloon, samas kui atsetovanilloon kutsus esile suurema värvitustumissaagise tasakaaluolekus kui p-kumaarhape.

Vahendaja mõju LMS-i värvitustamisreaktsioonile, kasutades lacM-i, oli samuti väga sarnane sellele, mis saadi LMS-iga, kasutades lacT-d. Kui pitsi kasutati melaniini värvitustamiseks ilma vahendajata, oli värvitustamise saagis pärast 5-tunnist reaktsiooni vaid 2 protsenti. HOBt kui lacM-i vahendaja ei suurendanud värvitustamise saagist 5-tunnise reaktsiooni ajal. Kõik looduslikud vahendajad, välja arvatud p-kumaarhape ja vanilliin, toimisid lacM-i poolt melaniini värvitustamise tõhusate vahendajatena. Kui kasutati atsetosüringooni ja süstaldehüüdi, olid värvitustamise saagised 5-tunnise reaktsiooni järel vastavalt 25% ja 22%. Mõlema jaoks kasutati tõhusate vahendajatena p-kumaarhapet ja vanilliini, kuid need ei suutnud pitsi abil LMS-is värvitustamise kiirust tõhusalt suurendada. Selle põhjuseks võib olla lacM madalam substraadi spetsiifilisus p-kumaarhappe ja vanilliini suhtes. Värvusetustamise saagised pärast 24-tunnist lacM reaktsiooni p-kumaarhappe ja vanilliiniga olid sarnased lacT abil saadud saagistega. See näitab, et p-kumaarhappe ja vanilliini oksüdeeritud vormid võivad melaniini tõhusalt värvituks muuta, kuigi nende oksüdatsioonikiirus lacM-ga oli palju madalam kui lacT-ga. Kui melaniini värvitustamiseks piisava reaktsiooniaja jooksul kasutati ilma vahendajata lacM-i, oli värvitustamise saagis pärast 24-tunnist reaktsiooni 5 protsenti. Looduslikud vahendajad, välja arvatud vanillhape, toimivad ka tõhusamate vahendajatena kui HOBt melaniini värvitustamiseks lacM poolt pärast 24-tunnist reaktsiooni. Kui lacM-i vahendajatena kasutati atsetosüringooni, süstaldehüüdi ja atsetovanilooni, olid värvitustamise saagised pärast 24-tunnist reaktsiooni vastavalt 34%, 28% ja 31%. Kui vanilliinhapet kasutati nii lacT kui ka lacM vahendajana, oli see madalaim värvitustamise saagis. Selle põhjuseks võib olla vanilliinhappe oksüdeeritud radikaali vormi madal stabiilsus. Khammuang ja Sarnthima teatasid, et vanilliini ja vanillhapet saab kasutada melaniini värvitustamise vahendajatena, kasutades Lentinus polycarpouse laktaasi [28]. Kuid need näitasid melaniini värvitustamise aktiivsust palju madalamal kui atsetosüringoonil, kui neid kasutati lacT ja pitsi vahendajatena.

Need tulemused näitavad, et looduslikud vahendajad on melaniini värvitustamiseks LMS-iga tõhusamad kui HOBt. HOBt on peetud tõhusaks laktaasi sünteetiliseks vahendajaks selle kõrge redokspotentsiaali ja HOBt N OH rühma katalüütilise rolli tõttu [5]. Vahendajate efektiivsus sihtsubstraatide oksüdeerimisel sõltub suuresti võimest moodustada stabiilseid radikaale ja steerilistest takistustest, mida põhjustavad suuremahulised alküülasendajad, mitte vahendajate redokspotentsiaalist [19,35]. HOBt oksüdeeritud vaheühendi madal stabiilsus on määratud tsüklilise voltammeetria abil [6]. Seetõttu võib HOBt-d kasutava LMS-i madala värvitustamise saagise põhjustada HOBt madal stabiilsus laktaasi reaktsioonitingimustes. Kuigi süstaldehüüdi redokspotentsiaal oli madalam kui HOBt-l, oli süstaldehüüdil suhteliselt suurem stabiilsus kui HOBt-l [6].

Nagu on näidatud joonisel 2, on selles töös kasutatud looduslikel vahendajatel benseenitsükli erinevates positsioonides erinevad asendajad (nt hüdroksüül-, metoksü-, karboksüül-, ketoon või aldehüüd) [12,19]. Kahe metoksürühmaga (atsetosüringoon ja süstaldehüüd) vahendajad näitasid suuremat värvimuutuse määra kui ühe metoksürühmaga vahendajad. Metoksürühmata p-kumaarhappega saadud värvitustumiskiirus sõltus lakaasi tüübist. LacT-ga p-kumaarhape näitas kõrgemat värvitustumiskiirust kui ühe metoksürühmaga p-kumaarhape, samas kui lacM-ga p-kumaarhape näitas 5-tunnise reaktsiooni madalaimat värvitustumiskiirust. Fillat et al. näitas ka sarnaseid tulemusi fleksograafiliste trükivärvide värvitustamisel looduslike vahendajatega seenlaktaaside poolt [36]. Fenoolsed looduslikud vahendajad (atsetosüringoon, metüülsüstal ja süstaldehüüd), mille tsüklis on kaks metoksüasendajat, oksüdeerusid laktaasi toimel kiiremini kui metoksürühmata p-kumaarhape. See näitab, et metoksürühmad mängivad elektronide doonoritena olulisemat rolli kui p-kumaarhappe külgahela kaksiksidem. Ühe metoksürühmaga vahendajate võrdlemisel suurenes värvitustamise saagis järgmises järjekorras: atsetovanilloon > vanilliin > vanillüülalkohol > vanilliinhape. Atsetovanilloon, millel on ketoonrühm, näitas suuremat värvimuutuse kiirust ja saagist kui aldehüüd-, hüdroksüül- ja karboksüülrühmadega vahendajad. Ketoonrühmaga atsetosüringoonil oli ka suurem värvitustamise kiirus ja saagis kui aldehüüdrühmaga süstaldehüüdil.

Järgmistes katsetes valiti LMS-i vahendajatena melaniini värvitustamiseks atsetosüringoon, süstaldehüüd ja atsetovanilloon, millel oli kõrge melaniini värvitustamisvõime. Vahendaja mõju LMS-i värvitustamisreaktsioonile uuriti aja jooksul (joonis S1). Värvusetustamise reaktsioon, milles kasutati lacT-d atsetosüringooni, süstaldehüüdi ja atsetovanilooniga, andis pärast 1-tunnist reaktsiooni vastavalt 21%, 18% ja 1% värvitustumissaagiseid. Värvusetustamise reaktsioon, milles kasutati lacM-i atsetosüringooni ja süstaldehüüdiga, andis pärast 1-tunnist reaktsiooni vastavalt 19% ja 18% värvitustamise saagiseid. Mõlemad lakkaasid näitasid sama vahendaja kasutamisel sarnaseid reaktsiooniprofiile. Atsetosüringoon ja syringaldehüüd suurendasid märkimisväärselt värvitustamise kiirust esialgse reaktsiooni ajal. Need tulemused näitavad, et atsetosüringoon ja süstaldehüüdi sisaldavad dimetoksürühmad suurendasid LMS-i algset värvitustamise kiirust tõhusamalt kui ühte metoksürühma sisaldav atsetovanilloon. Fillat et al. teatas ka, et vahendajate ringstruktuurides olevad metoksürühmad toimivad substraatide oksüdatsiooni kiirendajatena [36]. Teisest küljest oli värvitustamise saagis pärast 24-tunnist reaktsiooni atsetovanillooniga sarnane süstaldehüüdiga, kuigi atsetovanilloon suurendas mõõdukalt reaktsiooni kiirust.

Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501