Krüppeli-sarnane faktor 6 – vahendatud BCAA katabolismi kadumine aitab kaasa neerukahjustustele hiirtel ja inimestel
Feb 25, 2022
Muutunud rakkude ainevahetusneerudproksimaalsete tuubulite (PT) rakkudel on akuutses võtmerollneerukahjustus (AKI). Transkriptsioonifaktor Krüppeli sarnane faktor 6 (KLF6) indutseeritakse kiiresti ja jõuliselt PT varajases staadiumis pärast AKI-d. Leidsime, et PT-spetsiifiline Klf6 knockdown (Klf6PTKD) kaitseb AKI janeerudfibroos hiirtel. Kombineeritud RNA ja kromatiini immunosadestamise sekveneerimisanalüüs näitas, et Klf6PTKD hiirtel säilis hargnenud ahelaga aminohappe (BCAA) kataboolseid ensüüme kodeerivate geenide ekspressioon, kusjuures KLF6 hõivas nende geenide promootorpiirkonna. Seevastu indutseeritav KLF6 üleekspressioon pärssis BCAA geenide ekspressiooni ja süvendasneerukahjustusja fibroos hiirtel. In vitro oli KLF6 üleekspresseerivatel vigastatud rakkudel sarnane BCAA kataboolse geeniekspressiooni langus ja nad olid vähem võimelised BCAA-d kasutama. Veelgi enam, BCKDHB, mis kodeerib BCAA katabolismis kiirust piirava ensüümi ühte alaühikut, põhjustas ATP tootmise vähenemine, samas kui ravi BCAA katabolismi võimendajaga BT2 suurendas ainevahetust. Analüüsneerufunktsioon, KLF6 ja BCAA geeniekspressioon inimese kroonilises vormisneeruhaiguspatsientidel ilmnes oluline pöördkorrelatsioon KLF6 ja mõlema vahelneerufunktsioon ja BCAA ekspressioon. Seega võib BCAA katabolismi KLF6-vahendatud pärssimise sihtimine olla AKI ja AKI peamise terapeutilise sihtmärgina.neerudfibroos.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Kroonilineneeruhaigus(CKD) põhjustab märkimisväärset haigestumust ja suremust ning selle levimus USA täiskasvanud elanikkonnas on ∼ 15 protsenti. CKD võib tuleneda korduvatest ägedatest haigushoogudestneerukahjustus(AKI), mis on tingitud keskkonna- või toksiliste solvangutest või on sekundaarsed muude haiguste või nende ravi tõttu. Enamikul juhtudel on proksimaalne tuubul (PT) AKI esmane kahjustuskoht, kuna PT-rakkude kõrge metaboolne aktiivsus muudab need vastuvõtlikuks isheemilisele vigastusele ning nende roll ravimite ja toksiinide eritumisel nõuab potentsiaalselt kahjustavate ainete voogu. PT-rakkude kaudu (1). Üks selline aineklass on DNA-d kahjustavad kemoteraapiad, mis akumuleeruvad PT-rakkudes, põhjustades AKI ja nefroni kadu. Pärast vigastust PT-rakud diferentseeruvad ja eritavad lahustuvaid tegureid, nagu Wnt ja Hedgehog pereliikmed ning tsütokiinid (1–4). Ellujäänud dediferentseerunud PT-rakud võivad uuesti siseneda rakutsüklisse ja vohada, et parandada vigastatud PT-d, millele järgneb uuesti diferentseerumine täielikult funktsioneerivateks PT-rakkudeks (2). Kuid rakud, mis läbivad G2/M kontrollpunktis rakutsükli seiskumise, ei pruugi taastuda, mis põhjustab atroofiat ja profibrootilise signaaliülekande ülesreguleerimist (5), mis kutsub esile fibroosi, stimuleerides residentsete fibroblastide diferentseerumist müofibroblastideks, mis sekreteerivad rakuvälist maatriksi valke, ja immuunrakkude, näiteks makrofaagide ja T-rakkude värbamine (1).
Märksõnad:neerud; äge neerukahjustus; proksimaalne tuubul; transkriptsioonifaktor; hargnenud ahelaga aminohapped
Lisaks patogeensete signaaliradade esilekutsumisele näitavad vigastatud PT-rakud ka drastiliselt muutunud raku metabolismi. Vigastamata PT-rakud sõltuvad ATP tootmiseks suuresti mitokondriaalsete rasvhapete oksüdatsioonist, trikarboksüülhappe (TCA) tsüklist ja oksüdatiivsest fosforüülimisest. Vigastuse korral on rasvhapete oksüdatsioon siiski alla surutud ja glükolüüsi kompenseeriv ülesreguleerimine on mõõdukas, nii et üldine ATP tase väheneb vigastatud PT korral (6). Lisaks põhjustas rasvhapete oksüdatsiooni pärssimine in vitro tubulaarsete epiteelirakkude dediferentseerumist ja apoptoosi ning in vivo halvenes.neerukahjustuspärast foolhappega töötlemist (6). Huvitav on see, et mitokondriaalse rasvhapete oksüdatsiooni või peroksisomaalse rasvhapete oksüdatsiooni (FAO) ülesreguleerimine võib kaitsta selle eest.neerukahjustus(6, 7), mis viitab sellele, et raku metabolismi säilitamine võib olla AKI terapeutiline sihtmärk. Inimese kroonilise neeruhaigusega neerubiopsiate transkriptoomilised uuringud ja pärast isheemia reperfusioonikahjustust (IRI) hiirtel näitavad nii rasvhapete kui ka aminohapete metabolismi reguleerimata jätmist (6, 8). Kuigi PT rasvhapete oksüdatsiooni rolli on AKI-s varem kirjeldatud, tuleb PT aminohapete metabolismi rolli AKI-s veel uurida. Lisaks on seni kirjeldatud PT vigastuse mehhanisme suures osas uuritud hiiremudelite abil, millel on üksikute signaalimolekulide väljalülitamine ja üleekspressioon, kuid mehhanismid, mille abil globaalsed teed, nii fibrootilised/põletikulised kui ka metaboolsed, ning lülitus normaalse taastumise ja atroofia vahel. on AKI-s reguleeritud, ei ole hästi iseloomustatud.
Transkriptsioonifaktorid toimivad põhiliste bioloogiliste protsesside peamiste regulaatoritena tänu nende võimele reguleerida mitme allavoolu sihtmärgi ekspressiooni ja moodustada tagasisideahelaid. AKI-s on hästi uuritud transkriptsioonifaktorid, nagu FOS ja JUN pereliikmed, kõrgelt reguleeritud. Hiljutised uuringud molekulaarsete reaktsioonide kohta IRI-le inimproovides ja PT translatsiooniprofiilide koostamine pärast ühepoolset ureteri obstruktsiooni (UUO) hiirtel tuvastasid ka tsink-sõrme transkriptsioonifaktori Krüppeli-taolise faktori 6 (KLF6) sarnase varajase vigastuse vastuse geenina (9, 10). ). KLF-id hõlmavad tsink-sõrme transkriptsioonifaktorite perekonda, millel on väga konserveerunud C-otsa DNA-d siduvad domeenid ja varieeruvad N-otsad, mida ekspresseeritakse laialdaselt, sealhulgasneerud(11). KLF6-l on roll mitmetes protsessides, nagu rakkude proliferatsioon ja diferentseerumine, apoptoos, DNA kahjustuse reaktsioonid ja mitokondriaalne funktsioon (12) ning on kindlaks tehtud, et see mängib rolli maksa-, südame- janeerudfibroos, kontekstist sõltuvate mõjudega (13, 14). Piirkonnasneerud, KLF6 ekspresseeritakse glomerulaarsetes podotsüütides ja see on oluline mitokondriaalse funktsiooni regulaator fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosi (FSGS) taustal (15). Lisaks ekspressioonile glomerulaarsetes podotsüütides ekspresseerub KLF6 varieeruvalt ka PT-s, kuid selle rolli PT-rakkudes, kas normaalses funktsioonis või pärast vigastust, ei mõisteta. KLF6 üleekspressioon HK-2 rakkudes põhjustas dediferentseerunud fenotüübi koos vähenenud E-kadheriini ja suurenenud vimentiini ekspressiooniga ning suurendas ka makrofaagide põletikulise valgu -3 ekspressiooni (16). Lisaks suurenes KLF6 ekspressioon vastusena kõrgele glükoositasemele ja see toime blokeeriti TGFB1 hävitamise või TGF{11}} neutraliseeriva antikehaga töötlemisega. Otsene töötlemine TGF- 1-ga indutseeris samuti KLF6 ekspressiooni, mis viitab võimalikule positiivsele tagasisideahelale HK-2 rakkudes (16). Samuti on näidatud, et KLF6 indutseeritakse vähirakkudes in vitro DNA-d kahjustava kemoterapeutilise ravimi tsisplatiini subapoptootiliste annustega (17). PT KLF6 rolli määramiseks vastuseks DNA kahjustustele kasutasime looduslikult esinevat toksiini aristolochic acid I (AAI). AAI-ga seotud nefropaatia on kliiniliselt oluline (18) ja AAI toksilisus on PT suhtes väga spetsiifiline, võimaldades seega uurida PT KLF6 rolli spetsiifiliselt vastusena PT vigastusele. Lisaks põhjustab AAI erinevalt enamikust tsisplatiini režiimidest hiirtel usaldusväärselt nii AKI-d kui ka üleminekut fibroosile (19). AAI siseneb PT-rakkudesse basolateraalsete orgaaniliste anioonide transporterite (OAT) 1 kuni 3 kaudu ja sellel on nii genotoksiline toime aristolaktaami (AL)-DNA aduktide moodustumise kaudu kui ka tsütotoksiline toime, põhjustades mitokondriaalseid kahjustusi, mis tekitavad reaktiivseid hapniku liike, ja pärsib spetsiifiliselt normaalset PT funktsioonid, nagu retseptori vahendatud endotsütoos (18–20). Siin demonstreerime KLF6 ekspressiooni moduleerimise kaudu spetsiaalselt PT-s funktsioonivõime suurendamise ja funktsiooni kadumise uuringute kaudu hiirtel, et KLF{35}}vahendatud hargnenud ahelaga aminohapete (BCAA) katabolism aitab kaasa AKI-le. ja sellele järgnevneerudfibroos.
Tulemused
AAI ravi suurendab neerude PT Klf6 ekspressiooni. Kuna mitu KLF perekonna liiget ekspresseeritakse epiteelirakkudesneerud(21) tegime nende epiteeli Klf-ide jaoks algselt qRT-PCR-ineerudajukoores koguti 24 tundi pärast PT-spetsiifilise toksiini AAI ühekordset annust, võrreldes kandjaga (dimetüülsulfoksiid [DMSO]) C57BL/6 hiirtel. Klf4, Klf5 ja Klf6 olid oluliselt ülesreguleeritud, samas kui Klf15 oli oluliselt allareguleeritud (joonis 1A) ja need muutused geeniekspressioonis toimusid enne seerumi kreatiniinisisalduse olulist tõusu (joonis 1B). Et teha kindlaks, kas Klf6 ülesreguleerimine on mööduv või pikaajaline, manustati AAI-d mitme süstina, 3 korda kas kahe süsti või 3 nädala jooksul (aktiivne faas) või 3 nädala jooksul, millele järgnes 3 nädalat ilma AAIta (remodelleerumisfaas) (joonis 1C). . PT jäi puutumatuks 24 tundi pärast ühte süsti, kuid pärast kahte süstimist läbisid PT-rakud rakusurma ja hiirtel, keda raviti mitme AAI annusega, kadus PT, põletikulised infiltraadid ja valk
kiibid ja fibroos remodelleerumisfaasi lõpus (joonis 1D). Klf6 ekspressioon püsis kahjustuse aktiivses ja ümberkujunemise faasis märkimisväärselt kõrgenenud (joonis 1E), mis viitab KLF6 rollile kogu vigastuse ägedas ja fibrootilises faasis. KLF6 ekspresseeritakse glomerulaarsetes, tubulaarsetes ja põletikulistes rakkudes ning et määrata kindlaks PT-spetsiifilise Klf6 ekspressiooni panus neerukoore Klf6 ekspressiooni täheldatud suurenemisse, viisime läbi RNA sekveneerimise (RNA-seq) mikrodissekteeritud S2/S3 PT segmentides 24 h pärast ühte AAI süstimist, enne PT-rakkude kadumist. Klf6 oli tugevalt ülesreguleeritud tasemel, mis on võrreldav tuntud varajase vastuse transkriptsioonifaktoritega Fos ja Jun, mis näitab, et Klf6 messenger RNA (mRNA) ekspressiooni varajane indutseerimineneerudon tingitud selle ekspressioonist PT-rakkudes (joonis 1F). Need leiud on kooskõlas hiljuti avaldatud ühe raku / tuuma RNA-seq andmetega, mis näitavad Klf6 ülesreguleerimist vigastatud hiire ja inimese PT-rakkudesneerud(22, 23). Lõpuks andmekaeve ekspressiooni massiivid alates varem teatatud IRI ajakursuse uuringud (8) kinnitas varakult induktsiooni KLF6 ekspressiooni 2 tunni jooksul AKI, sarnaselt Fos ja juuni (joonis 1G). Need andmed viitavad sellele, et Klf6 on varakult indutseeritav vigastusvastuse geen pärast ravi PT-spetsiifilise toksiiniga AAI ja pärast IRI-d ning jääb vaatamata AAI lõpetamisele kõrgendatud tasemele.
KLF6 PT-spetsiifiline kadu nõrgendab neerukahjustusi aktiivses ja ümberkujunemise faasis pärast AAI-ravi.Et teha kindlaks PT-spetsiifilise KLF6 panus AAI-indutseeritud vigastustesse, genereerisime Klf6 (Klf6PTKD) PT-spetsiifilise knockdowniga hiired, ristades Klf6fl/fl hiired (24) Pepck-Cre hiirtega (25). Klf6PTKD hiired olid elujõulised ja viljakad, PT-spetsiifilise KLF6 valgu ekspressiooni olulise knockdowniga, kuid ei muutunud Klf6 mRNA ekspressioonis maksas, võrreldes Klf6fl/fl hiirtega (SI lisa, joonis S1 A-C). Selles ei olnud ilmseid erinevusineerudhistoloogia või funktsioon Klf6fl/fl ja Klf6PTKD hiirte vahel vanuses 24 nädalat (SI lisa, joonis S1 D ja E) ja OAT-de 1 kuni 3 (Slc22a6, Slc22a7 ja Slc22a8) ekspressioonitasemed, AAI PT sisenemise tee, ei olnud oluliselt erinevad (SI lisa, joon. S1F).
Kontroll- (Klf6fl/fl) ja Klf6PTKD hiiri raviti vehiikuliga (DMSO) või 3 mg/kg AAI-ga intraperitoneaalselt iga 3 päeva järel 3 nädala jooksul ja eutaniseeriti 3 päeva pärast viimast AAI süsti, et hinnata vigastuse aktiivset faasi või 3 nädalat pärast viimane AAI süstimine, et hinnata vigastuse remodelleerumisfaasi (joonis 1C). Klf6fl/fl ja Klf6PTKD hiirtel olid sarnased kogused AL-DNA adukte nii pärast ühte süsti kui ka aktiivse ja remodelleerumisfaasi lõpus (SI lisa, joonised S1 G ja H), mis viitab sarnasele AAI PT omastamisele ja AL paranemisele. -DNA aduktid Klf6fl/fl ja Klf6PTKD hiirtel. Süstimise ajal kaotasid AAI-d saanud hiired kaalu võrreldes DMSO-d saanud hiirtega, nii Klf6fl/fl kui ka Klf6PTKD hiirtel vähenes AAI viimase süstimise ajal ligikaudu 18 protsenti algtasemest, millele järgnes sama suur kehakaal ( SI lisa, joon. S2A).Neerkaalud võrreldes algse kehakaaluga (päev 0) olid aktiivse faasi lõpus DMSO ja AAI-ga töödeldud Klf6fl/fl ja Klf6PTKD hiirtel sarnased (SI lisa, joonis S2B). Ümberkujundamise etapis,neerudAAI-ga töödeldud Klf6fl/fl hiirtel kaalusid oluliselt vähem kui DMSO-ga töödeldud hiirtel, kuid AAI-ga töödeldud Klf6PTKD hiirtelneerudkaalud säilitati (SI lisa, joon. S2B).Neerufunktsioonhinnati seerumi kreatiniini (joonis 2A) ja uurea lämmastiku (joonis 2B) kontsentratsioonide mõõtmisega. Nii seerumi kreatiniini kui ka uurea lämmastiku kontsentratsioonid olid AAI-d saanud hiirtel DMSO-ga võrreldes oluliselt kõrgemad; siiski oli tõus Klf6PTKD hiirtel oluliselt väiksem kui Klf6fl/fl hiirtel (joonis 2 A ja B). Histoloogiline analüüs, kasutades hematoksüliini ja eosiini ning perioodilise happega Schiffi värvimist, näitas, et nii AAI-ga ravitud Klf6fl/fl kui ka Klf6PTKD hiirtel tekkisid tuubulid koos jäänukbasaalmembraanidega, põletikulised infiltraadid, mis paiknesid valdavalt
välimine ajukoor ja mitu valguvalu nii ajukoores kui medullas (joonis 2 C ja D). Need tunnused olid aga Klf6PTKD hiirtel leebemad kui Klf6fl/fl hiirtel, kusjuures säilisid tuubulid ja väiksemad põletikulised infiltraadid. PT ala analüüs viidi läbi, kasutades fluorestseeruvat Lotus lektiini värvimist, et tuvastada terved PT pintsli piirid täielikult diferentseerunud PT rakkudes ja immunofluorestsentsi tsütokeratiini -20 (KRT-20) jaoks, et tuvastada vigastatud PT-sid (8). Võrreldes DMSO-ga ravitud hiirtega oli nii AAI-ga ravitud Klf6fl/fl kui ka Klf6PTKD hiirtel märkimisväärne küpse PT kadu, mida näitas Lotus lektiini värvumise kadu ja KRT-20 ekspressiooni indutseerimine, mis näitab PT kahjustust mõlemas aktiivsed ja ümberkujundamisfaasid (joonis 2E ja SI lisa, joonis S2C). AAI-ga ravitud Klf6PTKD hiirtel oli küpse PT märkimisväärne säilivus võrreldes Klf6fl/fl hiirtega, millega kaasnes sarnased KRT- 20 induktsiooni tasemed nii aktiivses kui ka remodelleerumisfaasis. Remodelleerimisfaasi trikroomvärvimineneerudnäitas fibrootilise materjali ulatuslikku ladestumist Klf6fl/fl hiirtel, oluliselt vähem fibroosi Klf6PTKD hiirtel (joonis 2F, sinine värvumine; SI lisa, tabel S1). Immunofluorestsentsi abil tuvastatud fibrootilise maatriksi komponendi kollageen I ladestumine (joonis 2G ja SI lisa, joonis S2D) näitas, et kollageen I suurenes oluliselt AAI-ga Klf6fl/fl hiirtel, kuid mitte AAI-ga Klf6PTKD hiirtel võrreldes DMSO-ga aastal. aktiivne faas. Ümberkujundamise faasis suurenes kollageen I märkimisväärselt AAI-ga Klf6fl/fl ja Klf6PTKD hiirtel, AAI-ga Klf6PTKD hiirtel oli pindala oluliselt väiksem kui AAI-ga Klf6fl/fl hiirtel. Klf6fl/fl-is esines interstitsiaalseid põletikurakke, mis koosnesid CD68 pluss makrofaagidest ja GR-1 pluss müeloidsetest monotsüütidest
ja Klf6PTKD hiirtel, keda raviti AAI-ga, kuid neid oli Klf6PTKD hiirtel nii aktiivses kui ka remodelleerumisfaasis oluliselt vähem (joonis 2H). Seega kaitseb PT-spetsiifilise KLF6 kadu AAI-indutseeritud PT vigastuse, fibroosi ja põletiku eest, hoolimata AL-DNA aduktide sarnasest kogusest võrreldes AAI-ga ravitud kontrollhiirtega. KLF6 PT-spetsiifiline kadu vähendab põletikuliste signaalide edastamist ja säilitab raku ainevahetust pärast AAI-ravi. Püüdsime mõista mehhanisme, mille abil PT KLF6 kadumine kaitseb vigastuste eest, ja seetõttu võtsime ette RNA-seqneerudcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- või<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">
KLF6 poolt potentsiaalselt otseselt ja kaudselt reguleeritavate radade määramiseks analüüsisime täiendavalt erinevalt ekspresseeritud geene, klassifitseerides need KLF6 sidumissaitide olemasolu ja asukoha alusel, kasutades KLF6 kromatiini immunosadestamise järjestuse (ChIP-Seq) andmeid projektist Encyclopedia of DNA Elements. . Klassi 2 geenid määratleti kui vähemalt 1 KLF6 sidumissait ±1 kb raadiuses transkriptsiooni alguskohast (TSS), klassi 1 geenidel aga vähemalt 1 KLF6 sidumissait vahemikus ±1 kuni 10 kb. TSS ja klassi 0 geenid, millel puudub KLF6 sidumissait ±10 kb raadiuses TSS-ist. Seal oli 538 geeni, mis olid nii Klf6fl/fl hiirtel ülesreguleeritud kui Klf6PTKD aktiivses faasis Klf6fl/fl hiirtel oluliselt allareguleeritud. Nende 538 geeni raja rikastamise analüüs näitas, et kaasasündinud immuunsüsteemi (nt TYROBP, fagosoomi ja makrofaagide) ja raku adhesiooniga (nt integriin, fokaalne adhesioon) seotud rajad olid oluliselt rikastatud (joonis 3A). Geenide klassifitseerimine KLF6 sidumissaitide järgi näitas, et enamikul DEG-dest (428/538) ei olnud KLF6 sidumissaite (klass 0), ning klassi 2 geenide (72) ja klassi 0 geenide rikastusanalüüs eraldi. näitas, et nende radade olulisust mõjutasid tugevalt klassi 0 geenid, mis näitab, et nende geenide madalam ekspressioon Klf6PTKD hiirtel oli tõenäoliselt PT-spetsiifilise Klf6 knockdowni tagajärjel tekkinud väiksema PT vigastuse kaudne mõju (joonis 3A).
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Seal oli 388 geeni, mis olid nii Klf6fl / fl hiirtel alla reguleeritud kui ka oluliselt säilinud (ülesreguleeritud) Klf6PTKD versus Klf6fl / fl hiirtel. Raja rikastamise analüüs näitas, et need geenid esindasid metaboolseid radu, kusjuures aminohapete metabolism ja rasvhapete metabolism on silmapaistvad (joonis 3B ja SI lisa, joonis S4). 2. klassi geenide (1{{10}3) ja 0. klassi geenide (246) rikastusanalüüs näitas, et vaatamata sellele, et ainult ~25 protsendil geenidest on KLF6 sidumissaidid TSS-ist ±1 kb raadiuses ( klass 2), oli see geenide alamhulk nende radade väga oluliste P väärtuste juht. Hämmastavalt olid spetsiifilised aminohapete (Val, Leu ja Ile [BCAA] ning Gly, Ser ja Thr) metaboolsed rajad võrdselt olulised, kui analüüsiti ainult klassi 2 geene, mis viitab nende radade võimalikule otsesele reguleerimisele KLF6 poolt (joonis 3B). . Seevastu rasvhapete metaboolsete radade ja PPAR-i signaaliülekande radade suurt tähtsust ajendasid suures osas klassi 0 geenid, mis viitab nende radade kaudsele säilimisele PT-spetsiifilise Klf6 knockdowni tagajärjel. Geenide komplekti rikastamise analüüs spetsiifiliste Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) metaboolsete radade jaoks (rasvhapete lagunemine, aminohapete metabolism, TCA tsükkel ja glükolüüs), kasutades kõiki erinevalt reguleeritud geene, kinnitas, et need on oluliselt ülesreguleeritud (säilinud) Klf6PTKD versus Klf6fl/fl hiired (joonis 3C).
KLF6 esilekutsumine süvenebNeerukahjustusja pärsib BCAA kataboolseid geene pärast AAI ravi. Et teha kindlaks, kas KLF6 üleekspressioonil oleks vastupidine mõju, kasutasime "tet-on" süsteemi, et luua hiire mudel doksütsükliiniga (DOX) indutseeritava inimese KLF6 ekspressiooniga (hKLF6OE; topelttransgeenne CAG-rtTA, TRE-hKLF6 hiired) (SI lisa, joonis S5A). hKLF6OE hiirtel oli hKLF6 ekspressiooni tugev indutseerimine pärast dieedi lisamist DOX-iga 7 päeva jooksul ilma oluliste erinevusteta hiire Klf6 ekspressioonis (SI lisa, joonis S5B) janeerudei näidanud ilmset histoloogilist vigastust ega kaotustneerufunktsioonpärast pidevat ravi DOX-ga 15 nädalat (SI lisa, joonised S5 C ja D) võrreldes kontrollhiirtega (DOX-raviga TRE-hKLF6). Siiski, et teha kindlaks, kas hKLF6 indutseerimine PT-s süvendas AKI janeerudfibroosi, hKLF6OE ja kontrollhiiri raviti väiksema annusega 1 mg/kg AAI või DMSO-ga iga 3 päeva järel 2 nädala jooksul, millele järgnes eutanaasia pärast 3 päeva (aktiivne faas) või 2 täiendavat nädalat (ümberkujunemise faas) (SI lisa, joonis 1). S6A). Kontroll- ja hKLF6OE hiired, kes said AAI-d, kaotasid sarnases koguses kehakaalu (SI lisa, joonis S6B) janeerudkaalud olid kõikides rühmades sarnased (SI lisa, joonis S6C). hKLF6OE hiirtel oli pärast aktiivses faasis ravi AAI-ga võrreldes kontrollhiirtega oluliselt kõrgem seerumi kreatiniini- ja uurealämmastikusisaldus (joonis 4 A ja B). Sellega kaasnes küpse PT kadumine suurema KRT-20-positiivse PT osakaaluga, mis halvenes hKLF6OE hiirtel mõlemal ajahetkel (joonis 4 C–E ja SI lisa, joonis S6D) ja suurenes. fibroos mõlemas faasis (joonis 4F ja SI lisa, joonis S6E). BCAA metaboolses rajas ensüüme kodeerivate geenide qRT-PCR analüüs näitas BCAA geenide supressiooni pärast AAI-ravi kontroll- ja hKLF6OE hiirtel ning hKLF6OE hiirtel võrreldes kontrollhiirtega veelgi supressiooni (joonis 4G). Lisaks vähenes ka mitme BCAA geeni ekspressioon oluliselt (Hibch) või näitas hKLF6OE madalamat ekspressiooni võrreldes kontrollhiirtega isegi ilma AAI-ravita (DMSO-ga töödeldud) (joonis 4G). Need andmed viitavad sellele, et hKLF6 indutseerimine täiskasvanud hiirtel muudabneerudvastuvõtlikum AKI-le ja võimalikule fibroosile koos BCAA katabolismi kodeerivate geenide olulise düsregulatsiooniga.
KLF6 indutseerimine pärsib BCAA katabolismi, mis on oluline substraat ATP tootmiseks in vitro.Mitokondriaalne BCAA katabolism võib kaasa aidata oksüdatiivsele fosforüülimisele atsetüül-CoA ja suktsinüül-CoA tootmise kaudu (SI lisa, joonis S4B). Uurimaks, kas KLF6 reguleerib BCAA-d ja raku metabolismi in vitro, hindasime esmalt BCAA metaboolsete geenide ekspressiooni HK-2 rakkudes koos KLF6 (KLF6-OE) üleekspressiooniga, koos AAI-raviga või ilma. Nagu hKLF6OE hiirtel, põhjustas KLF6 üleekspressioon ainuüksi HK-2 rakkudes suundumust mitmete BCAA ensüüme kodeerivate geenide, eriti BCKDHB allasurumisele. Kontroll-KLF6-Con-rakkude töötlemine 25 μM AAI-ga 6 tunni jooksul pärssis oluliselt mitme ensüümi ekspressiooni ja neid pärssiti veelgi AAI-ga töödeldud KLF{13}}OE-rakkudes (joonis 5A). To
Joonis 3. KLF6 kadumine pärsib profibrootilisi radu ja säilitab metaboolsed rajad pärast AAI-ravi. (A) Klf6fl/fl hiirtel pärast AAI-d ülesreguleeritud, kuid Klf6PTKD hiirtel pärast AAI-d oluliselt vähem ülesreguleeritud geenide klassifikatsioon ja raja rikastamise analüüs vastavalt sidumissaidi klassile: klass 2, kus KLF6 sidumissait on suurem või võrdne sellega. ±1 kb TSS-i; klass 1, mille KLF6 sidumissait on suurem või võrdne ±1 kuni 10 kb kaugusel TSS-ist; ja klass 0 ilma KLF6 sidumissaidita ± 10 kb raadiuses TSS-ist. (B) Klf6fl/fl hiirtel pärast AAI-d allareguleeritud, kuid Klf6PTKD hiirtel pärast AAI-d oluliselt vähem reguleeritud (st säilinud) geenide klassifitseerimise ja raja rikastamise analüüs vastavalt sidumissaidi klassile: klass 2, mis on suurem või võrdne 1 KLF6 sidumissait ±1 kb raadiuses TSS-ist; klass 1, mille KLF6 sidumissait on suurem või võrdne ±1 kuni 10 kb kaugusel TSS-ist; ja klass 0 ilma KLF6 sidumissaidita ±10 kb raadiuses TSS-ist. (C) Geenikomplekti rikastamise analüüsi diagrammid, kasutades kõiki erinevalt ekspresseeritud geene, KEGG rasvhapete lagunemise (FA DEGRAD), aminohapete metabolismi (AA METAB) ja TCA tsükli (KEGG{35}}TCA) jaoks.
kindlaks teha, kas see BCAA geeniekspressiooni pärssimine AAI juuresolekul põhjustas muutusi BCAA katabolismis, mõõtsime rakusiseseid BCAA kontsentratsioone. Pärast AAI-ga töötlemist näitasid KLF6- Con rakkudes BCAA vähenemist, mis on kooskõlas BCAA suurenenud katabolismiga, mis võib potentsiaalselt kompenseerida FA oksüdatsiooni kadu (joonis 5B). See efekt aga kadus KLF6-OE rakkudes, mille rakusisene BCAA ei vähenenud pärast AAI-ravi, mis on kooskõlas vähenenud võimega kataboliseerida BCAA-d (joonis 5B), ja see korreleerus mitokondriaalse ATP tootmise vähenemisega. võrreldes AAI-ga töödeldud KLF{5}}Con rakkudega (joonis 5C).
Standardne ATP tootmise mõõtmiseks kasutatav sööde sisaldab kõrges kontsentratsioonis glükoosi (10 mM glükoosi, 1 mM glutamiini ja 2 mM püruvaati) ning selleks, et teha kindlaks, kas KLF6 üleekspressioon üksi võib muuta erinevate energiaallikate kasutamist, viisime selle asemel läbi analüüsid. hapnikutarbimise määr (OCR) piiratud energiatarbimisega söötmes (seerumivaba sööde 1 mM glükoosi, glutamiini ja püruvaadita). KLF6-OE rakkudel oli vähenenud mitokondriaalne OCR (määratletud kui esialgne OCR miinus mittemitokondriaalne OCR, mis määrati pärast rotenooni/antimütsiin A manustamist), kuid neil oli sarnane kompensatsioon pärast glükolüüsi blokeerimist 2-desoksüglükoosiga (2-). DG) ja sarnane FAO (OCR vähenemine pärast FAO blokeerimist etomoksiiriga) (joonis 5 D ja E). Kuna mitokondriaalne reaktsioon glükolüüsi kadumisele ja FA oksüdatsioonist tulenev OCR ei muutunud KLF6-OE rakkudes, viitas see sellele, et mitokondriaalne funktsioon ei olnud mõjutatud, vaid pigem võimetus kasutada BCAA-d allikana. Arvestavad mitokondriaalse OCR-i algtaseme vähenemist nendes energiapiiranguga tingimustes. Et teha kindlaks, kas BCAA katabolismi kadumine võib viia mitokondriaalse ATP tootmise vähenemiseni, genereerisime HK-2 rakud koos BCKDHB katkestamisega (SI lisa, joonis S7). BCKDHA ja BCKDHB kodeerivad suure valgukompleksi hargnenud ahelaga ketohappedehüdrogenaasi (BCKDH) kahte subühikut, mis katalüüsib esimest pöördumatut ja kiirust piiravat etappi BCAA katabolismis ning mida inhibeerib BCKDH kinaasi (BCKDK) fosforüülimine (28). Kontroll-BCKDHB-SCR ja BCKDHB-sh rakkude nihutamiseks mitokondriaalse ATP tootmise suunas eelinkubeeriti neid 2-DG-s, et blokeerida glükolüüs 1 tund enne ATP tootmiskiiruse testi läbiviimist. BCKDHB hävitamine põhjustas ATP tootmise märkimisväärse vähenemise, mis näitab, et BCAA-d kasutatakse ATP tekitamiseks inimestelneerudrakud (joonis 5F). Ja vastupidi, et
Joonis 4. hKLF6OE hiirtel on ägenemineneerukahjustusBCAA geenide supressiooniga. (A ja B) Seerumi kreatiniini (A) ja uurea lämmastiku (B) kontsentratsioon kontroll- ja hKLF6OE hiirtel, keda raviti aktiivses faasis DMSO või AAI-ga. n=4 kuni 9 rühma kohta; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" versus="" sama="" genotüüp="" dmso-ga;="" **p="">< 0.01="" versus="" juhtseade="" aai-ga;="" ühesuunaline="" anova="" sidaki="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" (c="" ja="" d)="" tüüpilised="" histoloogilised="" kujutised,="" mis="" on="" värvitud="" hematoksüliini="" ja="" eosiini="" (c)="" ning="" perioodilise="" happe="" schiffi="" (d)="" plekkidega.="" kollased="" nooled:="" tuubulite="" eraldumine;="" mustad="" nooled:="" keldrimembraanide="" jäänused;="" kollased="" nooleotsad:="" valgud;="" ja="" mustad="" nooleotsad:="" põletikulised="" infiltraadid.="" (skaalavardad,="" 100="" μm.)="" (e)="" immunofluorestsentsvärvimine="" tsütokeratiini-20="" (krt-20)="" kui="" vigastatud="" pt="" (punane)="" markerina="" koos="" lotus="" lektiiniga="" (ll)="" värvimisega.="" )="" vigastamata="" pt="" markerina="" (roheline).="" (skaalavardad,="" 250="" μm.)="" (f)="" immunofluorestsentsvärvimine="" -sma="" jaoks="" (roheline)="" koos="" kostvärvimisega="" edu="" jaoks="" (magenta).="" (skaalaribad,="" 100="" μm.)="" (g)="" bcaa="" geenide="" mrna="" ekspressioon="" kontroll-="" ja="" hklf6oe="" hiirtel,="" keda="" raviti="" aktiivses="" faasis="" dmso="" või="" aai-ga.="" n="5" kuni="" 9="" rühma="" kohta;="" $p="">< 0,01,="" $="" $="" p="">< 0,001="" versus="" kontroll="" dmso-ga;="" kõik="" hklf6oe="" koos="" aai-ga="" on="" p="">< 0,001="" versus="" hklf6oe="" dmso-ga;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" sama="" raviga="" kontroll;="" mitu="" t-testi="" valetuvastuskiiruse="" korrektsiooniga,="" kasutades="" benjamini,="" kreigeri="" ja="" yekutieli="" kaheastmelist="" astmelist="" mudelit.="" andmed="" on="" keskmised="" ±="" sem,="" kusjuures="" n="" näitab="" bioloogiliste="" korduste="">
BCAA katabolismi tugevdamiseks ravisime HK-2 rakke BT2-ga, mis inhibeerib BCKDK-d, blokeerides seega BCKDH inhibeeriva fosforüülimise. Piiratud energiatingimustes suurendas BT2-ga töötlemine OCR-i DMSO-ga töödeldud rakkudes, mis püsis pärast glükolüüsi inhibeerimist ja mitte FAO või mittemitokondriaalse OCR-i muutumise tõttu (joonis 5 G ja H). Need leiud näitavad, et KLF6-vahendatud BCAA katabolismi pärssimine vähendab mitokondriaalset ATP tootmist, mis tõenäoliselt süvendab PT vigastusi rakustressi taustal, kus FAO ohu tõttu eksisteerivad sarnased energiapiiranguga tingimused.
BCAA geeniekspressioon on erinevatel hiirtel ja inimestel vähenenudNeerukahjustused. Et teha kindlaks, kas BCAA geeniekspressiooni kadumine toimub enne PT kadu ja kreatiniini taseme tõusu AAI põhjustatud vigastuse korral, teostasime qRT-PCR-i C57BL/6 hiirtel, keda raviti ühekordse AAI annusega ja eutaniseeriti 24 tunni pärast. Bckdhb, Hibch ja Mccc2 olid sel ajahetkel juba märkimisväärselt alla reguleeritud, kusjuures teised geenid (nt Acadm) näitasid tugevat suundumust allareguleerimise suunas (joonis 6A). BCAA geeniekspressiooni uurimiseks teistel hiirtelneerukahjustusmudelite puhul teostasime qRT-PCR hiirtel, keda raviti tsisplatiiniga (joonis 6B) või UUO-ga (joonis 6C). Mõlemas mudelis oli Klf6 ekspressioon sõiduki / kontrollidega võrreldes tugevalt ülesreguleeritud. Tsisplatiiniga töödeldud hiirtel olid mitmed testitud BCAA geenid oluliselt allareguleeritud, kusjuures teiste geenide regulatsioonid vähenesid (joonis 6B). UUO-le allutatud hiirtel olid kõik testitud geenid oluliselt allareguleeritud nii 3 kui ka 7 päeva pärast UUO-d (joonis 6C), mis viitab sellele, et BCAA geenide allareguleerimine toimub varakult pärast vigastust.
Joonis 5. KLF6 üleekspressioon pärsib BCAA geeni ekspressiooni, ATP tootmist ja BCAA kasutamist in vitro. (A) KLF6 ja BCAA metaboolsete geenide ekspressioon HK-2 rakkudes, mis ekspresseerivad stabiilselt kontroll- (Con) või KLF6 üleekspressiooni (OE) plasmiide ja mida on töödeldud DMSO või AAI-ga. n=4 rühma kohta; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{101}="" {21}}01="" versus="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}5,="" $$p="">< 0,01,="" $$$p="">< 0,001="" võrreldes="" sama="" rakuliiniga="" dmso;="" kahesuunaline="" anova="" tukey="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" (b)="" bcaa="" üldkoguse="" kvantifitseerimine="" dmso="" või="" aai-ga="" töödeldud="" con-="" ja="" oe-rakkudes.="" n="6" rühma="" kohta;="" $p="">< 0,05="" versus="" con="" dmso;="" ühesuunaline="" anova="" sidaki="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" (c)="" mitokondriaalse="" atp="" tootmise="" kiiruse="" protsentuaalne="" muutus="" aai-ga="" töödeldud="" con-="" ja="" oe-rakkudes="" võrreldes="" dmso-ga.="" n="27" kuni="" 30="" rühma="" kohta;="" *p=""><0,05, ***p=""><0,001 versus="" dmso,="" $p=""><0,05 versus="" con="" aai;="" ühesuunaline="" anova="" sidaki="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" (d)="" ocr-i="" mõõtmised="" con-="" ja="" oe-rakkude="" jaoks="" piiratud="" söötmes.="" kui="" näidatud,="" lisati="" 2-dg,="" etomoksiir="" (eto)="" ja="" rotenooni/antimütsiini="" a="" (rot)="" kombinatsioon.="" n="16" rühma="" kohta.="" (e)="" basaalse="" mitokondriaalse="" ocr-i="" (algav="" ocr="" miinus="" pärast="" mädanemist="" ocr),="" mittemitokondriaalse="" ocr-i="" (post-rot="" ocr)="" ja="" muutuste="" ocr-is="" pärast="" 2-dg="" lisamist="" (mitokondriaalne="" kompensatsioon="" pärast="" 2-dg-d)="" kvantifitseerimine="" ja="" etomoksiir="" (fao).="" n="16" rühma="" kohta;="" **p="">< 0,01="" versus="" con;="" kahesuunaline="" anova="" tukey="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" (f)="" mitokondriaalse="" atp="" tootmiskiirus="" bckdhb-scr="" ja="" bckdhb-sh="" rakkudes.="" n="14" rühma="" kohta;="" **p="">< 0,05,="" paaritu="" t-test.="" (g)="" ocr="" mõõtmised="" hk-2="" rakkudes="" piiratud="" söötmes="" bt2="" puudumisel="" või="" olemasolul.="" kui="" märgitud,="" lisati="" 2-dg,="" eto="" ja="" rot.="" (h)="" basaalse="" mitokondriaalse="" ocr-i,="" mittemitokondriaalse="" ocr-i="" ja="" ocr-i="" muutuste="" kvantifitseerimine="" pärast="" 2-dg="" ja="" etomoksiiri="" lisamist="" hk-2="" rakkudesse="" bt2="" puudumisel="" või="" olemasolul.="" n="8" rühma="" kohta;="" *p="">< 0,05="" versus="" bt2="" puudumine;="" kahesuunaline="" anova="" tukey="" korrektsiooniga="" mitme="" testimise="" jaoks.="" andmed="" on="" keskmised="" ±="" sem,="" kusjuures="" n="" näitab="" bioloogiliste="" korduste="">
Samamoodi andmete kaevandamine varem teatatud ekspressioonimassiivist 36 inimese kroonilise neeruhaigusega patsiendi (hüpertensiivne ja diabeetiline) tubulointerstitsiaalsest kambrist.neeruhaigused) võrreldes kontrollpatsientidega (6) näitasid, et mitmed BCAA geenid olid allareguleeritud sarnaselt AAI-ga ravitud hiirtega (joonis 6D). Seoste edasiseks selgitamiseksneerufunktsioon, KLF6 ekspressiooni ja BCAA geenide ekspressiooni inimese kroonilise neeruhaiguse korral kasutasime avaldatud ekspressioonimassiivi tubu lointerstitsiaalsest sektsioonist 164 patsiendi seeriast, kellel oli mitmesuguseid haigusi.neeruhaigused (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 ml/min/1,73 m2) (P < 0,001="" kõigi="" geenide="" puhul),="" mis="" näitab,="" et="" need="" muutused="" geeniekspressioonis="" võivad="" ilmneda="" varakult="" seoses="" funktsionaalsete="" muutustega.="" need="" andmed="" viitavad="" ühiselt="" sellele,="" et="" bcaa="" katabolismi="" jaoks="" kriitiliste="" geenide="" klf6-vahendatud="" allasurumine="" võib="" mängida="" olulist="" rolli="">neerukahjustushiire mudelitesneerudnii fibroos kui ka inimese kroonilise neeruhaiguse korral.
Arutelu
Selles uuringus demonstreerime PT-spetsiifilise KLF6 in vivo rollineerukahjustus.KLF6 on PT alguses tugevalt ja järjekindlalt reguleeritud vastuseksneerukahjustus, kuid see on halvasti kohanev vastus, mida näitab PT Klf6 kadumise kaitsev toime pärast ravi kliiniliselt olulise ja väga PT-spetsiifilise toksiiniga AAI. Lisaks demonstreerime düsreguleeritud BCAA metabolismi potentsiaalset tähtsust vigastatud PT-s kui võimalikku AKI ja sellest tuleneva fibroosi soodustajat. Klf6 kadumine tõi kaasa BCAA kataboolse ensüümi ekspressiooni säilimise, kusjuures mitmetel neid ensüüme kodeerivatel geenidel on KLF6 sidumissaidid nende TSS-ide vahetus läheduses, mis viitab sellele, et KLF6 võib olla BCAA katabolismi transkriptsiooniline supressor. Kuigi varem on näidatud, et KLF perekonna teine liige, KLF15, reguleerib skeletilihaste hargnenud ahelaga aminotransferaas 2 (Bcat2) ekspressiooni (30), ei teatatud teiste BCAA ensüümide regulatsioonist. Me oletame, et KLF6 pärsib mitme BCAA ensüüme kodeeriva geeni ekspressiooni.
Vigastamata PT korral on Klf6 ekspressioon madal ja ekspresseerub varieeruvalt mõnes PT rakkudes, teistes mitte. Kiire ja jõuline ülesreguleerimine, mis tekib pärast mitut tüüpi vigastusi, viitab KLF6 füsioloogiliselt olulisele rollile. Fibroblastides näidati hiljuti, et KLF6 on ülesreguleeritud vastusena nii onkogeensele kui ka oksüdatiivsele stressile, mis viis raku vananemiseni, samas kui KLF6 vaigistamine viis DNA kahjustuse ja genoomse ebastabiilsuse markerite kuhjumiseni (31). Seega võib KLF6 füsioloogiline roll vigastuses olla raku vananemise indutseerimine, mis võimaldab parandada toksiliste või oksüdatiivsete/isheemiliste solvangute tagajärjel tekkinud DNA kahjustusi. Vigastatud PT-rakkudes näib aga Klf6 ülesreguleerimise teine tagajärg olevat BCAA katabolismi pärssimine, mis on eriti PT-rakkudes tõenäoliselt kahjulik. Huvitav on see, et hoolimata PT-spetsiifilise Klf6 osalisest katkestamisest Klf6PTKD hiirtel algtasemel, suutis see pärast vigastust siiski anda selge kaitsva toime. Sellel on oluline terapeutiline mõju, kuna see viitab sellele, et ainult väike manipuleerimine KLF6 taseme või aktiivsusega (nt väikese molekuli inhibiitori kasutamise kaudu) võib näidata terapeutilist efektiivsust. Tõepoolest, transkriptsioonifaktorid on tõenäolisemad kui teised geeniperekonnad
inimese genoomis, et olla annuse suhtes tundlik (32). Samamoodi on meie indutseeritava KLF6 üleekspressiooni hiiremudeli üheks piiranguks see, et see ei ole piiratud PT-rakud ja sellisena peavad tulevased uuringud keskenduma rakuspetsiifilise indutseeritava mudeli kasutamisele, et selgitada välja KLF6 raku kontekstist sõltuv roll.
Varem näitasime, et Klf6 kadumine glomerulaarsetes podotsüütides oli FSGS-i seadistamisel kahjulik, kuna see mängis rolli tsütokroom c oksüdaasi 2 (Sco2) sünteesi transkriptsioonilises aktiveerimises. Klf6 kadumine FSGS-is põhjustas hullema fibroosi koos sisemise apoptootilise raja suurenenud aktiveerumisega (15). Saadaolevate üherakuliste RNA-seq andmekogumite küsitlemine näitab, et tervetel hiirtelneerud,Klf6 ekspresseeritakse palju suuremas osas podo rakkudes kui PT-rakud ja palju kõrgemal tasemel (viide 33; https://susztaklab.com/). Seetõttu mängib KLF6 normaalsetes podotsüütides tõenäoliselt olulisemat füsioloogilist rolli kui PT-rakud, samas kui teisi teadaolevaid mitokondriaalseid põhiregulaatoreid (nt Ppara) ekspresseeritakse PT-rakkudes palju rohkem kui podotsüütides. Seega on Klf6 kadumisel podotsüütides tõenäoliselt kahjulikum mõju kui PT-rakkudes. KLF6 vastandlikud rollid erinevates rakutüüpidesneerudon paralleelne varasemate leidudega rakuspetsiifiliste mõjude kohta südames ja maksas. Seega nõrgendas Klf6 pärssimine hiirtel südame müotsüütides pärast angiotensiin II ülekoormust südamefibroosi, mis viitab KLF6 rollile fibroosi paljundamises, kuid Klf6 pärssimine südame müofibroblastides ei mõjutanud fibroosi (14). Vastupidi, maksas ei avaldanud Klf6 pärssimine hiire hepatotsüütides pärast kroonilist CCl4 manustamist maksafibroosile mõju, kuid KLF6 üleekspressioon maksa tähtrakkudes põhjustas fibroosi vähenemist, mis viitab sellele, et KLF6 on kaitsev (13).
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
FAO kaotus ajalneerukahjustuson praegu teadaolevalt oluline sündmus patoloogiasneerukahjustusja võib tõepoolest otseselt kaasa aidata fibroosi tekkele. FAO puudumisel, mis on vigastamata PT peamine energiaallikas, võivad muud potentsiaalsed energiaallikad omandada suurema tähtsuse. BCAA-d aitavad kaasa TCA tsüklile atsetüül-CoA ja suktsinüül-CoA tootmise kaudu. Hiljutine uuring näitas, et mitte ainult 13C-märgistatud BCAA ei aita kaasa TCA tsükli vaheühenditeleneerudkuidneerudoli pankrease, lihaste ja valge rasvkoe järel 13C kõrgeim osakaal testitud elundite TCA tsükli vaheühendites (34), mis viitab sellele, et BCAA võib olla TCA tsükli oluline panustaja. Siiski on BCAA katabolismi tähtsus TCA tsüklile kaasaaitamisel nii normaalsetel kui ka vigastatud inimestelneerud, pole varem uuritud. Näiteks ei ole teada, kas ainuüksi PT BCAA katabolismi kadumine põhjustaks muutusi PT homöostaasis ja/või paranemises ning need uuringud nõuavad uudsete hiiremudelite loomist, nagu PT-spetsiifilised Bckdhb knockdown hiired. Seadistamiselneerudvigastuse korral, kui FAO on tõsiselt alla surutud, täiendav mahasurumine
BCAA metaboolseid ensüüme kodeerivad geenid võivad jätta torukujulised rakud ilma olulisest alternatiivsest potentsiaalsest energiaallikast. Oluline on märkida, et BCAA geeni ekspressioon oli allareguleeritud juba 24 tundi pärast ühekordset süstimist, enne seerumi kreatiniini või PT kaotuse muutusi, mis näitab, et need allaregulatsioonid olid PT vigastuse spetsiifilised tagajärjed ega olnud seotud PT energiavajaduse vähenemisega. vähenenud GFR ja sellest tulenevalt vähenenud vajadus lahustunud aine omastamise järele. Need rajad säilitati Klf6PTKD hiirtel, kes olid vigastuste eest kaitstud ja hKLF6OE hiirtel, kellel oli halvem vigastus, veelgi allasurutud. Lisaks oli KLF6-OE rakkudel pärast AAI-ravi vähenenud mitokondriaalne ATP produktsioon võrreldes KLF6-Con-rakkudega ja samas kui intratsellulaarne BCAA vähenes KLF6-Con-rakkudes, mis on kooskõlas nende katabolismiga. , seda langust KLF6-OE rakkudes ei tuvastatud. Peale selle põhjustas BCKDHB vähenemine HK-2 rakkudes mitokondriaalse ATP tootmise vähenemise. Seega võib BCAA geenide säilinud ekspressioon Klf6PTKD hiirtel pakkuda kaitset vigastuste eest, pakkudes olulisi TCA tsükli vaheühendeid tugevalt vähenenud FA oksüdatsiooni taustal. Tulevased uuringud, milles kasutatakse BCAA katabolismi geneetilise manipuleerimise ja/või BT2-ga ravimisega hiiri, võimaldaksid meil uurida BCAA katabolismi ja FAO vahelist dünaamikat.neerukahjustus.
Oleme näidanud, et BCAA geenide ekspressiooni kadumine põhjustab mitokondriaalse hingamise ja ATP tootmise vähenemist ning see on üks mehhanism, mille abil BCAA katabolismi kadumine võib kaasa aidataneerukahjustus. Alternatiivne mehhanism võib olla BCAA kogunemine, millel võib olla toksiline toime. Tõepoolest, seda on näidatud südame IRI taustal. Näidati, et katabolismi kadumisest tingitud BCAA akumuleerumine pärsib mitokondriaalset püruvaadi kasutamist, inaktiveerides posttranslatsiooniliselt püruvaadi dehüdrogenaasi, eemaldades seega täiendava raku energiaallika ja süvendades vigastusi (35). See tühistati kas BCAA katabolismi suurendamisega, töödeldes hiiri BT2-ga, või suurendades glükoosi metabolismi GLUT1 üleekspressiooniga. Hiljutine uuring näitas ka südame IRI ägenemist BCAA katabolismi kadumise tõttu diabeetilistel hiirtel. Sellega kaasnes suurenenud oksüdatiivne stress ja see pöördus taas BCAA katabolismi taasaktiveerimisega (36). On teada, et BCAA ja eriti leutsiin aktiveerivad imetajate rapamütsiini (mTOR) kompleksi 1 (mTORC1) signaaliülekande sihtmärki. Polütsüstilise hiire mudelisneeruhaigus,milles tsüste ümbritsevatel rakkudel on mTOR aktiveeritud
signaalimine, täiendamine BCAA-ga aktiveeris veelgi mTORC1 signaaliülekannet, mis viis suurenenud proliferatsioonini (37). Hepatotsellulaarsete kartsinoomide transkriptsiooniline profileerimine näitas BCAA geeni ekspressiooni vähenemist, mis viis BCAA kuhjumiseni kasvajakoes. Seda seostati suurenenud mTORC1 signaaliülekande ja proliferatsiooniga, mida vähendas BCAA piiramine või BT2-ga ravimine, ning see halvenes hiirtel, kellele toideti kõrge BCAA-d sisaldavat dieeti (38). mTORC1 signaalimine on vajalik PT funktsiooni jaoks ja uuringud, milles kasutatakse mTOR inhibiitoreidneerukahjustuson näidanud vastuolulisi tulemusi, mis on tõenäoliselt tingitud erinevatest annustamisrežiimidest, ravi ajastustest ja vigastusmudelitest (39–42). mTORC1 signaaliülekanne põhjustab paljusid rakulisi vastuseid, sealhulgas rakkude kasvu ja proliferatsiooni, lipiidide sünteesi, mitokondriaalset sünteesi ja autofagia pärssimist (43). On tõenäoline, et mTORC1 signaaliülekande ala- või üleaktiveerimine võib olla kahjulik ja raku õigeks funktsiooniks on vaja tasakaalu. Näiteks võib mTORC1 signaaliülekande üleaktiveerimine PT vigastuse korral põhjustada autofagia kahjulikku pärssimist, mis on vajalik kahjustatud mitokondrite eemaldamiseks ja on osutunud oluliseks taastumiseks pärast PT-d.vigastus (39, 42, 44, 45). Seega võib leutsiini kogunemisel olla kahjulik rollneerukahjustusmTORC1 signaaliülekande üleaktiveerimise ja autofagia mahasurumisega. Kokkuvõtteks oleme näidanud, et Klf6 tugev ülesreguleerimine, mis toimub aastalneerukahjustuson kahjulik, mille puhul PT-spetsiifilise Klf6 kadumine säilitas BCAA geeniekspressiooni ja nõrgendas AKI-d ja võimalikku fibroosi. Vastupidiselt pärssis KLF6 indutseerimine hiirtel BCAA geeni ekspressiooni ja muutisneerudvastuvõtlikneerukahjustus.Lisaks on mitut BCAA ensüümi kodeerivatel geenidel KLF6 sidumissaidid, mis viitab sellele, et KLF6 võib olla BCAA katabolismi transkriptsiooniline regulaator. BCAA katabolismi in vitro reguleerimine KLF6 üleekspressiooni ja AAI-ga töötlemise või BCKDHB katkestamisegavähendada mitokondriaalset ATP tootmist. Ühiselt needandmed viitavad sellele, et terapeutiline eesmärk on säilitadaBCAA katabolism võib pakkuda alternatiivset mitokondriaalsetenergiaallikas keskkonnasneerukahjustusmilles FAOvähendatakse.
