Polütsüstiline neeruhaigus

ali.ma@wecistanche.com

Ⅱ osa: autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaigusega patsientide erütroidi eellasrakkudest genereeritud neeruorganoidid

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice jt.

Taust:Neerorganoidid on laialdaselt saadud kaubanduslikult saadavatest indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (iPSC); Siiski on olnud suur väljakutse tõhusalt toota neeruorganoidmudeleid autosomaalse domineeriva polütsüstilise haigusega patsientidel.neerudhaigus (ADPKD), mis võtab kokku nii embrüogeneesi kui ka tsüstogeneesi mehhanismid.

Klõpsake kõrvaltoimete ja neerudele kasulike mõjude vaatamiseks

Meetodid: vere erüteoidsed eellasrakud (EP-d) kahest ADPKD-st (autosoomne dominantne polütsüstiline haigusneerudhaigus) patsiente ja ühte tervet doonorit (HC) kasutati võrdleva kontrollina, et normaliseerida paljusid tehnilisi etappe EP-de ümberprogrammeerimiseks ja organoidide genereerimiseks. EP-d programmeeriti episomaalse vektori abil ümber iPSC-deks (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud), mis diferentseeriti neerutorukujulisteks organoidideks ja seejärel stimuleeriti forskoliiniga tsüstide moodustumise esilekutsumiseks.

Tulemused: EP-dest tuletatud iPSC-d (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud) näitasid kõiki pluripotentsuse tunnuseid ja suutsid diferentseeruda kõigiks kolmeks idukihiks. 3D-torukujulised organoidid genereeriti üksikutest rakkudest pärast 28-päevast kasutamist Matrigelis. HC ja ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstilineneerudorganoidid ei moodustanud spontaanselt tsüste, kuid forskoliini stimuleerimisel täheldati ADPKD-s (autosomaalne dominantne polütsüstiline) tsüstilaadseid struktuure.neerudhaigus) organoidides, kuid mitte HC-st saadud organoidides.

Järeldus: selle uuringu tulemused näitasid, etneerudorganoidid genereeriti edukalt ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline) vere EP rakkudestneerudhaigus) patsiendid ja terve kontrolldoonor. See lähenemine peaks aitama kaasa embrüo jaoks võimsa vahendinaneerudarengumudel, mis suudab kokku võtta tsütogeneesiga seotud väga varajased patofüsioloogilised mehhanismid.

OSAKS KLIKI SIIAⅠ

Arutelu

Käesolevas uuringus kirjeldasime üksikasjalikult protseduuri neeruorganoidide genereerimiseks inimese iPSC-dest (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud), mis on saadud ADPKD-ga (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) patsientide vere erütroidi eellasrakkudest. Paljud somaatilised rakutüübid on edukalt ümber programmeeritud iPSC-deks (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud), sealhulgas vererakud [Z]. Siin otsustasime kasutada vere erüteoidsete eellasrakkude lähterakutüübina mitmel põhjusel, näiteks nende genoomne terviklikkus, epigeneetiline mälu ja tõhus ümberprogrammeerimine [11, 17, 18]. Erütroidsete eellasrakkude iPSC-deks muundamise efektiivsus oli tervelt kaks suurusjärku parem (7 protsenti -28 protsenti) kui diferentseeritud vererakkude tüüpide efektiivsus (0.0). 2 protsenti -0,60 protsenti )või fibroblastid (0,74 protsenti )[Z]. Vaatamata nende rakkude vähesele arvukusele perifeerses veres saab neid kergesti eraldada ja in vitro laiendada, et saada piisav arv ümberprogrammeerimiseks. Üks olulisemaid väljakutseid sobivate iPSC-de loomisel on nende genotüüp ja fenotüübiline varieeruvus [6], kuid sellise varieeruvuse vältimiseks või vähendamiseks on välja pakutud mõned tehnilised strateegiad. Käesolevates katsetes kasutasime ümberprogrammeerimiseks mitteintegreeruvat episomaalset süsteemi, mis ei nõua ümberprogrammeerivate geenide ekspresseerimiseks genoomi integreerimist [10], võimaldades vähem immunogeensust ja muutes rakud geneetiliselt stabiilsemaks [19, 20]. Lisaks saadi kõik proovid samast allikast, mis aitab minimeerida epigeneetilist varieeruvust [12], eeldades, et lähteraku diferentseerumine võib mõjutada lõpptulemuste tõhusust. Pluripotentsuse markerite analüüsi ja iPSC-de (indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude) võimet diferentseeruda kõigiks kolmeks idukihiks võrreldi kõrvuti ning neid võrreldi ka H9 embrüonaalse rakuliiniga, mida kasutati positiivse kontrollina. . Kõik need võrdlused ei näidanud olulisi erinevusi ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) patsientide, HC-de ja H9 rakkude vahel.

iPSC-de (indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude) neeruorganoidideks diferentseerumise esilekutsumiseks on välja töötatud mitu protokolli [13, 21]. Cruz et al. kirjeldatud protokollide põhjal. [6], saime proksimaalsete tuubulite omadustega struktuurid, sealhulgas NHE3 ja AOP1 ekspressioon. Lisaks ekspresseerisid organoidid NPHS2, mis näitab podotsüütide-sarnaste rakkude olemasolu.

Vastupidi, AQP2 ei ekspresseeritud nendes torukujulistes organoidides. See leid on kooskõlas varasemate uuringutega, mis viitavad mitmetele piirangutele in vitro kusejuha pungast (UB) pärinevate struktuuride väljatöötamisel, kusjuures UB arendamine nõuab spetsiifilisi protokolle, kuna spetsiifilise induktori lisamise ajavahemik on väga piiratud. 6,22,23].

Neeru organoidide genereerimisel iPSC-dest (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud) võetakse kogu neeru embrüogenees kokku in vitro, hõlmates esialgu kaviteeritud sferoidide moodustumist üksikutest rakkudest [14]. Tõepoolest, leidsime, et diferentseerumata iPSCs (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud) nii ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) patsientidelt kui ka tervelt kontrollilt moodustasid epiblastitaolised sfäärilised struktuurid, mis olid morfoloogiliselt sarnased. Kuigi käesolevas uuringus PKD1 ja PKD2 geenide DNA sekveneerimist ei tehtud, näitavad praegused leiud, et patsientide kantud mutatsiooni tüüp ei mõjutanud tüüpilist epiblasti morfogeneesi. Veel on vaja täiendavaid uuringuid, et paremini hinnata embrüonaalse arengu selles faasis osalevate pöördeliste molekulide ekspressiooni.

Vastavalt Freedmani jt poolt välja töötatud protokollile. [14], täheldasime, et sferoidid diferentseerusid torukujulisteks organoidideks 26 päeva pärast diferentseerumise esilekutsumist ja ajastus oli sarnane nii ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) kui ka HC (joonis ③) patsientidel. Sellegipoolest märkasime väljenduse ajakava ja diferentseerimismarkerite taseme osas mõningast varieeruvust. Teisest küljest oli torukujuliste struktuuride morfoloogia ADPKD patsientide ja HC proovide vahel sarnane ja võrreldav. Seevastu iPSC-sid (indutseeritud pluripotentseid tüvirakke), mis pärinevad ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) patsientide neerubiopsiatest, leidsid Cruzi jt rühm suuremat varieeruvust nende rakkude võimes moodustada organoide[6]. Lisaks sellele haigusele omaste mutatsioonide tohutule mitmekesisusele võib neid erinevusi organoidide saamise efektiivsuses seletada ka biopsiaproovides esinevate heterogeensete rakutüüpidega, erinevalt erütroidi eellasrakkudest, mis moodustavad homogeensema rakupopulatsiooni. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et vaatamata erinevate iPSC kloonide efektiivsuse varieeruvusele ja erinevustele neeruorganoidide moodustamisel, võib viimaste saamine ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) patsientidelt olla ainulaadne mudel fenotüüpiliste ilmingute mitmete vormide uurimiseks. sellest haigusest. Lisaks on oluline märkida, et kui ADPKD-ga mõjutatud populatsioonis on mutatsioonide varieeruvus märkimisväärne, kuna patsiendispetsiifilised iPSC-d (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud) on immuunsüsteemiga täielikult ühilduvad, võidakse neid tulevikus kasutada individuaalseks regeneratiivseks raviks. Lisaks in vitro mudeli väljatöötamisele, et kontrollida, kas väga varajased fenotüüpilised ilmingud on sama mitmekesised kui kliiniline esitlus.

HCor ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) patsientidest saadud stimuleerimata organoidid ei moodustanud spontaanselt tsüste. Tsüstide tüüpiline morfoloogia ja tsüstogeneesi markerite ekspressioon ei olnud üheski proovis tuvastatavad, isegi pikendades organoidide diferentseerumist kultuuris kuni 35 päeva lõpuni. On näidatud, et rakkude proliferatsioon üksi ei tekita tsüste [24]. Veelgi enam, tsüstide moodustumise ja kasvu kiirendamiseks in vivo on vaja kolmandat sõltumatut sündmust (tuntud kui kolmas tabamus) [23]. Seevastu forskoliini poolt indutseeritud tsüstide moodustumine toimus ADPKD patsientide organoidides, kuid mitte HC patsientide organoidides. Tähelepanuväärne on, et kuigi tsüste esines, täheldati ADPKD proovides väikese protsendina isegi forskoliini juuresolekul, nagu on täheldanud ka Freedman et al. [14] organoidides, mis on moodustatud ADPKD haiguse CRISPR/Cas9 mudelist. Käesolevas mudelis leitud tsüstide madala esinemissageduse selgitamiseks võib püstitada mõned hüpoteesid. 1) 3D suspensioonikeskkonnas kultiveeritud organoidid näitasid kleepuvate organoididega võrreldes palju suuremat tsüstogeneesi efektiivsust [6], mis näitab, et mikrokeskkond on otseselt seotud tsüstogeneesiga.2) Käesolevas uuringus kasutatud katseprotokoll moodustas proksimaalse tuubuli organoidid, kuid mitte. nefroni distaalsed osad [23]. Kuigi kõik nefronisegmendid võivad pärineda tsüstidest, sealhulgas proksimaalsetest tuubulitest [25], näivad kogumiskanalitest pärinevad tsüstid olevat suuremad ja arvukamad kui teistest segmentidest pärinevad [26], 3) Lõpuks tõestati hiljuti, et tsüstide päritolu on võib olla seotud mitme PKD1 mutatsiooni olemasoluga, mis määravad haiguse tõsiduse ja et tsüstide teket kogumiskanalites seostati haiguse tõsidusega [27, 28].

Kokkuvõtteks näitasid praegused leiud, et on võimalik genereerida organoide, millel on kolmemõõtmelised struktuurid, mis sarnanevad neeru eellasarhitektuuriga, kasutades iPSC-sid (indutseeritud pluripotentsed tüvirakud), mis on ümber programmeeritud erütroidi eellasrakkudest, mis olid kergesti eraldatavad ADPKD-st (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus). patsientidel ja et need organoidid on võimelised forskoliini stimuleerimisel moodustama tsüste. See paljutõotav metoodika tutvustab meetodit tsüstide moodustumise väga varaste geneetiliste, fenotüüpiliste ja füsioloogiliste etappide mõistmise suurendamiseks ADPKD (autosoomne domineeriv polütsüstiline neeruhaigus) keskkonnas.

Viited

1. Chebib FT, Torres VE: Autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus: põhiõppekava 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07:6653PMID07.

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW jt: üksikute maksatsüstide somaatiline mutatsioon toetab autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaiguse tsüstogeneesi kahe tabamuse mudelit.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P jt: Somaatilised PKD2mutatsioonid üksikutes neeru- ja maksatsüstides toetavad 2. tüüpi autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaiguse tsüstogeneesi "kahe tabamuse" mudelit. Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Kriitiline arengulüliti määratleb neerutsüstide moodustumise kineetika pärast Pkd1 kaotust. Nat Med, 13: 1490-1495, 2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD jt: Neerukahjustus on kolmas tabamus, mis soodustab täiskasvanute polütsüstilise neeruhaiguse kiiret arengut. Hum Mol Genet, 18:2523-2531, 2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK jt: Organoidide tsüstogenees näitab mikrokeskkonna kriitilist rolli inimese polütsüstilise neeruhaiguse korral. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Pluripotentsete tüvirakkude esilekutsumine fibroblastikultuuridest. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ jt: Vähenenud tsiliaarne polütsüstiin-2 PKD1 mutatsioonidega polütsüstilise neeruhaigusega patsientide indutseeritud pluripotentsetes tüvirakkudes. J Am Soc Nephrol, 24:1571-1586, 2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Transgeenivabade indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude tuletamine ühest veretilgast. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10, 2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il jt: Human indutseeritud pluripotentsed tüvirakud, mis ei sisalda vektorit ja transgeeni järjestusi. Science, 324:797-801, 2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G jt: Diferentseerumisstaadium määrab hematopoeetiliste rakkude potentsiaali ümberprogrammeerimiseks indutseeritud pluripotentseteks tüvirakkudeks. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM jt: Tõhus inimese iPS-rakkude tuletamine mitteintegreeruva plasmiidi abil vererakkudest, millel on ainulaadsed epigeneetilised ja geeniekspressioonisignatuurid. Cel/Res, 21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotentsed tüvirakkudest pärinevad neeruorganoidid: in vivo-sarnane in vitro tehnoloogia. Eur J Pharmacol, 790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V jt: Neeruhaiguse modelleerimine CRISPR-mutantsete neeruorganoididega, mis on saadud inimese pluripotentsetest epiblastide sferoididest. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; ADPKD (autosoomne dominantne polütsüstiline neeruhaigus) ultraheli diagnoosimise ühtsed kriteeriumid. JAm Soc Nephrol, 20:205-212, 2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T jt: ROCK-i inhibiitor võimaldab dissotsieerunud inimese embrüonaalsete tüvirakkude ellujäämist. Nat Biotechnol, 25:681-686, 2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Tuuma ümberprogrammeerimine ja pluripotentsus. Nature, 441: 1061-1067, 2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Kõrge efektiivsusega süsteem inimese poolt indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude genereerimiseks ja uurimiseks. Cel/ tüvirakk. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420