Neerude interkaleerunud rakud on fagotsüütilised ja hapestavad sisemise uropatogeense Escherichia coli
Feb 28, 2022
Neerinterkaleeritud rakud osalevad happe-aluse homöostaasis vaakum-ATPaasi ekspressiooni kaudu. Siin kirjeldame kuut inimese interkaleeritud raku alatüüpi, sealhulgas hübriidseid peamisi interkaleeritud rakke, mis on tuvastatud üksiku raku transkriptoomikast. Fagosoomide küpsemine on bioloogiline protsess, mis suurendab bioloogilise raja analüüsi järjestust pärast kokkupuudet uropatogeense Escherichia coli-ga kahes interkaleerunud raku alatüübis. Hiire reaalajas konfokaalne mikroskoopia visualiseerimineneeru-Escherichia coli või pHrodo Green E. coli BioParticles ekspresseeriva rohelise fluorestseeruva valguga perfuseeritud torukesed näitavad, et interkaleerunud rakud fagotsüteerivad aktiivselt baktereid ja seejärel hapestavad fagolüsosoome. Lisaks on interkaleerunud rakkudel pärast in vivo eksperimentaalset UTI-d suurenenud vakuolaarne ATPaasi ekspressioon. Kokkuvõttes näitavad interkaleerunud rakud transkriptsioonilist vastust, mis soodustabneerudkaitsevad, neelavad baktereid ja hapestavad sisestatud baktereid. Interkaleeritud rakud esindavad epiteelirakku, millel on professionaalsete fagotsüütide, näiteks makrofaagide omadused.
Märksõnad:neeruhaigus;neerukude;neerurakud;neer; neeru-
Neere koguv tuubul on happe-aluse reguleerimise lõpp-koht 1 . Kogumistuubul koosneb põhirakkudest ja interkaleeritud rakkudest (IC). Põhirakud (PC-d) vahendavad soola ja vee resorptsiooni ning neid iseloomustab tsütoplasmaatiline akvaporiin 2 (AQP2) 2 . IC-d aitavad säilitada happe-aluse homöostaasi ja neil on kolm kirjeldatud alatüüpi, tüüp A (A-IC), tüüp B (B-IC) ja nonA-nonB 2,3 . A-IC-d sekreteerivad prootoneid apikaalse vakuolaarse H-ATPaasi (V-ATPaasi) kaudu ja regenereerivad vesinikkarbonaati basilarkloriidi/vesinikkarbonaadi (Cl − /HCO 3 ) transporteri, anioonivahetuse 1 (AE1/riba 3/SLC4A1) 1,4 kaudu. B-IC-d sekreteerivad HCO 3 - apikaalse Cl - / HCO 3 transporteri, pendriini (SLC26A4) kaudu ja ekspresseerivad basolateraalset V-ATPaasi 2,3. Näriliste nonA–nonB IC-del on apikaalne pendriin ja V-ATPaas, kuid puudub AE1 ning need on tuvastatud kogumiskanalis ja ühendustorustikus (CNT) 3 . Üha rohkem tõendeid toetab IC-de kaasasündinud immuunsüsteemi rolli koos nende traditsioonilise pH reguleerimise funktsiooniga. Esiteks, enamus kümnest mitteseotud patsiendist, kellel on distaalneneeru-tubulaarne atsidoos, seisund, mida iseloomustab IC düsfunktsioon, teatati, et neil on UTI anamneesis 5 . Teiseks, uropatogeenne Escherichia coli (UPEC), organism, mis on isoleeritud 70 protsendil ägeda püelonefriidi korral meestel ja 80 protsendil naistel, lokaliseerub selektiivselt IC-de 6,7 tsütoplasmas. Kolmandaks tuvastasime, et IC-d ekspresseerivad antimikroobseid peptiide (AMP), nagu ribonukleaas 7 (RNASE7) 8–11. Nendel AMP-del on otsene toime mitmete patogeenide, sealhulgas bakterite vastu algtasemel ja/või vastusena infektsioonile 8–11. Neljandaks oleme me ja teised sõltumatult teatanud, et ebanormaalse IC arenguga hiirtel on suurenenud vastuvõtlikkus kuseteede infektsioonidele (UTI) ja/või püelonefriidile12,13. Viiendaks, IC-d tunnetavad ja vahendavad põletikku 14 . Lõpuks oleme näidanud kaasasündinud immuungeeni ekspressiooni isoleeritud hiire IC-des 15, 16
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Oluline on mõista, kuidas IC-d kuseteede infektsiooni eest kaitsevad, kuna UTI-sid esineb sageli. Üle 50 protsendi naistest kogeb elu jooksul UTI-d ja UTI-d moodustavad 1–6 protsenti kõigist arstivisiitidest 17 . Kui bakterid tõusevadneerudmille tagajärjeks on püelonefriit, võimalike tüsistuste hulka kuuluvad hüpertensioon, kroonilineneeruhaigusja urosepsis 18,19. Ameerika Ühendriikides esineb igal aastal hinnanguliselt 250000 püelonefriidi juhtu 17 . Mitme ravimiresistentsus on kujunemas kriitiliseks väljakutseks seoses UTI-de ja muude infektsioonide raviga 20 . Seetõttu võivad mehhanismid, mida IC-d kasutavad tõusvate uropatogeenide eest kaitsmiseks, olla terapeutilised sihtmärgid, mida saaks kasutadaneerud- spetsiifiline püelonefriidi ravi. Kuna enamik IC-uuringuid hõlmab loommudeleid, on vaja inimeste IC-de paremat mõistmist, et suunata põhiteaduslikke uuringuid parema kliinilise hoolduse poole.
Kunaneerudon keeruline organ, võib mRNA profiile olla raske tõlgendada. Näiteks nefronil on piirkondlik spetsialiseerumine erinevate torukujuliste segmentide ja raku alatüüpidega. Theneerudsisaldab endoteeli-, epiteeli-, interstitsiaalseid ja värvatud põletikurakke, millel kõigil on erinevad bioloogilised funktsioonid ja geeniekspressioonimustrid. Üherakuline RNA sekveneerimine (scRNA-seq) kujutab endast kiiresti arenevat metoodikat erinevate rakutüüpide tuvastamiseks ja profileerimiseks algtasemel või vastusena stressoritele 21 . Siin näitame scRNA-seq tehnoloogia abil, et inimeneneerudIC-d koosnevad kuuest erinevast alamhulgast, mis hõlmavad kolme A-IC-d, ühte hübriid-IC-PC-d, ühte nonA-nonB IC-d ja ühte B-IC-d. RNA kiiruse analüüs näitas UPEC-ga kokkupuutel transkriptsiooni nihet arvutitelt A-IC alamhulkade suunas. Leidlikkuse raja analüüs näitas fagosoomide küpsemist kui A-IC alamhulga peamist bioloogilist rada UPEC-i kokkupuutel. Selles rajas on V-ATPaasid peamised kaasatud komponendid. Kasutasime intravitaalset mikroskoopiat, et visualiseerida in vivo UPEC-i omastamist IC-de poolt ja kinnitada nendesse IC-desse sisestatud UPEC-i hapestumist. Lõpuks näitas hiire UTI mudel V-ATPaasi (Atp6v1b1) mRNA ekspressiooni suurenemist. See uuring annab aluse V-ATPaasi ekspresseerivate epiteelirakkude uurimiseks ja terapeutiliseks manipuleerimiseks bakteriaalsete fagotsüütidena.
Tulemused
Inimese IC-sid saab rikastada magnetiliselt aktiveeritud rakkude sorteerimise (MACS) abil nuum-/tüvirakkude kasvufaktori retseptoriga (CD117/c-KIT) kaetud magnethelmestega. Inimeneneerudkudedest, peamiselt normaalsetest servadestneerudmassresektsioonid, tükeldati 2–4- mm tükkideks ja viidi seejärel Cooperative Human Tissue Networki [https://www.chtn.org] poolt meie laborisse Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM) jääl. Hindasime c-KIT-i rakupinna markerina inimese IC-de sorteerimiseks, kuna c-KIT-i on sel eesmärgil edukalt kasutatud hiirtel22. c-KIT ekspressioon lokaliseeriti inimese IC-dele, tuginedes järeldusele, et c-KIT ja inimese IC-marker V-ATPaas, B1 subühik (geen ATP6V1B1), märgistasid inimeses samu rakkeneerudsektsioon (täiendav joonis 1) 22,23 . Pärast magnetsortimist, mis hõlmas CD45 pluss immuunrakkude ja surnud rakkude eemaldamist; c-KIT-positiivsete oletatavate IC-de rikastumist demonstreeris ATP6V1B1 mRNA ekspressioon, mis suurenes c-Kit-positiivsetes rakkudes 8–12- korda võrreldes c-KIT-negatiivsete rakkudega. Nii SLC4A1 kui ka SLC26A4 rikastati erinevalt IC-dega, mis näitab, et seda metoodikat kasutades on võimalik nii A-IC kui ka/või B-IC rikastamine (täiendav joonis 2). Selles uuringus kasutatud neerukoe taust on esitatud täiendavas tabelis 1.
Integreeritud klastrianalüüs tuvastas kuus IC-alatüüpi.ScRNA-seq viidi lõpule 1861 dissotsiatsiooniganeerudrakud, mida rikastati IC-de jaoks, nagu ülalpool kirjeldatud. Rikastatud IC-d saadi singli normaalsetest servadestneerudmassiline resektsioon. Kvaliteedikontrolli (QC) filtreerimise läbisid 859 rakku, mida eksponeeriti UPEC-ga in vitro 1 tund ja 1002 rakku, mida eksponeeriti soolalahusega in vitro 1 tund. Seurat' funktsiooni analüüs tuvastas sorteeritud rakupreparaadis 12 klastrit (joonis 1a). Iga klastri üheksa kõige konserveeritumat markerit on esitatud täiendavatel joonistel. 3–14. Üldiselt moodustasid IC-alatüübid 1861 rakust 1066 (57 protsenti). Kuus klastritest esindasid IC-alatüüpe. Täpsemalt leidsime kolm A-IC, ühe B-IC, ühe nonA-nonB-IC ja ühe hübriidse PC-IC alatüübi.NeerCheni ja tema kolleegide soovitatud epiteelirakkude nomenklatuuri kasutati igale klastrile rakutüübi määramiseks konserveerunud tegijaid, kelle kohta on varem teatatud, et need on rakutüüpi markerid või konserveeritud markerid, mis eristasid ühte 12 klastrist teistest (täiendav tabel 2). , joon. 1b, c, joon. 2) 24–28 .
A-IC alatüüp ja hübriid PC-IC valgu ekspressioon korreleerub scRNA-seq tulemustega. Kinnitasime peamised scRNA-seq leiud, eelkõige see, et SLC8A1 (nimetatakse ka kui Na plus /Ca plus soojusvaheti 1 (NCX1)) on hübriidsete PC-IC-de marker ja et kuumašoki valgu perekonna A (Hsp70) liige 1A (HSPA1A) koos varajase kasvuvastusega 1 (EGR1) on markerid, mis võivad eristada A-IC alatüüpe (joonis 3). Kuna me kasutasime tavalisi veerisidneerudVähi resektsioonide käigus kinnitasime, et meie SLC8A1, HSPA1A ja EGR1neerudekspressioonimustrid olid kooskõlas normaalsetes näidatuteganeerudkude Human Protein Atlasest, mis on saadaval aadressil http://www.proteinatlas.org (täiendav joonis 15) 29
Kanalirakkude alatüübi markerite profiilide kogumine, mida on varem näidatud hiirelneerudrakud jäävad inimesel suures osas puutumataneerudrakud. Kuna tulevaste hiiremudelite leidude kontekstualiseerimine inimese patofüsioloogiaga on oluline, hindasime inimese IC ekspressiooni hiire koguvate kanalite rakumarkerite puhul, mis tuvastati varem Cheni jt scRNA-seq uuringutes. 22 ja Ransick et al. 30 . Tulemuste punktdiagramm on esitatud joonisel 4. Hiire kogumise kanalite rakutüüpi markerid on enamasti konserveerunud inimese kogumiskanalirakkudes.
A-IC alatüübi A suhteline protsent suureneb 1-tunnise UPEC-i kokkupuute korral. Klastrites olevate rakkude protsendid olid kokkupuutetüüpide lõikes kooskõlas, välja arvatud A-IC alatüüp A/klastri 0, mis suurenes 16,2-lt 20,1 protsendile, ja A-IC alatüüp C/klastri 5 kohta, mis vähenes 9,4-lt. 6,6 protsendini, soolalahuse ja UPEC kokkupuute korral, P =0,03 (tabel 1).
Hübriidsed PC-IC-rakud muudavad vastusena 1-tunnisele UPEC-i kokkupuutele oma RNA kiirust PC-dest eemale ja A-IC-de suunas. Hiljuti transkribeeritud splaissimata pre-mRNA-de suhtelist arvukust võrreldes küpse splaissitud mRNA-ga saab kasutada mRNA arvukuse muutuse arvutamiseks, mida nimetatakse mRNA kiiruseks31. Positiivne mRNA kiirus üherakulistes uuringutes näitab, et geene reguleeritakse üles, kui negatiivne mRNA kiirus tähendab geenide allareguleerimist 31 . RNA kiiruse suund järeldab, et rakul on mRNA ekspressioonitrajektoor teise rakutüübi suunas 31,32 . MRNA kiirus vastuseks UPEC kokkupuutele on esitatud joonisel 5. Oluline on see, et hübriid PC-IC-d muudavad oma RNA kiirust PC-dest eemale ja IC-de suunas vastuseks UPEC-ile. Lisaks säilitavad IC-d oma transkriptsiooni aktiivsust, samas kui teistes muutub transkriptsiooniline aktiivsus minimaalseksneerudrakutüübid.
Neerude kaasasündinud immuunprofiil näitab mõningaid varajasi üherakulise ekspressiooni muutusi pärast 1-tunnist UPEC-i kokkupuudet.Täiendavad joonised fig. 16 ja 17. Peamised leiud hõlmavad AMP adrenomedulliini (ADM) kõrget ekspressiooni A-IC alatüüpides A ja B, hübriid PC-IC ja B-IC. Arvutid ei ekspresseeri algtasemel adrenomedulliini, kuid neil on märkimisväärselt suurenenud ekspressioon vastuseks UPEC-i kokkupuutele. Tsütokiiniga indutseeritav SH2-sisaldav valk (CISH) ja autointegratsioonifaktori 1 (BANF1) ekspressioon indutseeritakse märkimisväärselt mitteA–mitteB IC-des pärast UPEC-ga kokkupuudet. Interleukiin 18 (IL18), galektiin 3 (LGALS3), beeta-defensiin 1 (DEFB1) ja signaalimuundur CD24 lipokaliin 2/neutrofiili želatinaasiga seotud lipokaliin (LCN2/NGAL) tuvastati ainult
hübriidsetes PC-IC-des ja esines ainult minimaalne teemaksutaolise retseptori 4 mRNA ekspressioon. Me ei tuvastanud ribonukleaasi 7 (RNASE7) ekspressiooni scRNA-seq. Hindasime RNASE7 mRNA ekspressiooni magnetiliselt sorteeritud ühendatud IC-s ja mitte-IC-sneerudrakud. RNASE7 mRNA ekspressioon tuvastati IC-des ühest neljastneerud(täiendav joonis 18).
Fagosoomide küpsemise bioloogiline protsess on seotud IC-dega, mis puutuvad kokku UPEC-ga 1 tund.Iga klastriga seotud kümme juhtivat bioloogilist rada järjestati p väärtuse järgi, mis määrati leidlikkuse raja analüüsi abil. Kolmel kogumiskanaliga määratud klastril A-IC alamtüüp A/klastri 0, A-IC alatüübi B/ kobaral 3 ja A-IC alatüübil C/klastril 5 oli pärast UPEC-i kokkupuudet soolalahusega võrreldes erinevad bioloogilised rajaprotsessid (joonis 1). 6a–c). Fagosoomide küpsemine oli UPEC-i ja soolalahusega kokku puutunud rakkudes A-IC alatüübi C/klastris 5 kõrgeim funktsioon, A-IC alatüübis A/klastris 0 liikus teiselt positsioonilt esimesele ja kõrgeimalt neljandalt kolmandale positsioonile. A-IC alatüübis B/klastris 3. Ühelgi ülejäänud kogumiskanalirakkude alatüübil (täiendav joonis 19) ei olnud kümmet parimat seotud rada, mis oleksid pärast UPEC-i kokkupuudet soolalahusega võrreldes erinevad. Geeniekspressiooniprofiil, mille tulemuseks oli A-IC alatüübi A/klastri 0 fagosoomide küpsemise järjestus, on esitatud lisatabelis 3.
IC Atp6v1b1 mRNA ekspressioon suureneb vastusenaeksperimentaalne püelonefriit in vivo.Ingenuity fagosoomi küpsemise rada tõstis esile V-ATPaasi kui IC-des osalevat (täiendav tabel 3). Et teha kindlaks, kas V-ATPaas aktiveeritakse UPEC-ga kokkupuutel, kasutasime hiire UTI mudelit. Üks tund pärast transuretraalset UPEC vs soolalahuse inokulatsiooni "IC reporter" hiired, kellel on tdTomato (tdT, punase fluorestseeruva valgu variant) ekspressioon IC-des, eutaniseeriti ja IC-sid rikastati dissotsieerunud hiirega.neerurakud. Rikastatud IC-del oli kõrgem Atp6v1b1 mRNA ekspressioon hiirtel, kellele oli inokuleeritud UPEC, võrreldes soolalahuse kontrolliga (joonis 6d).
IC-d fagotsüteerivad UPEC-i in vivo.Töötasime välja metoodika singli perfuseerimiseksneerudtuubul koos UPEC-iga terves elusas hiiresneerud.Rohelist fluorestseeruvat valku (GFP) ekspresseerivad UPEC agregaadid, mis olid mikroperfuseeritud "IC reporter" hiirte ühte neerutuubuli luumenisse, visualiseeriti voolamas läbi tuubulite, kleepudes selektiivselt luminaalsele pinnale ja sisestades IC-d (joonis 7) intravitaalse mikroskoopia käigus.
IC-d hapestavad UPEC-i sisaldavaid fagolüsosoome in vivo jain vitro.Samuti perfuseerisime torukesed pHrodo Green E. coli bioosakestega, mis fluorestseeruvad ainult hapestamisel. Nende bioosakeste omastamist ja fluorestsentsi visualiseeriti ainult intravitaalse mikroskoopia ajal IC-des (joonis 8). Imarise segmentatsioonianalüüs näitas, et roheline fluorestsents suurenes aja jooksul märkimisväärselt tdT pluss IC-des pHrodo Green E. coli bioosakestega perfuseeritud tuubulis, võrreldes kontroll-tdT pluss tuubuliga (joonis 9a, b). Kui fluorestsentsi hinnati rakupõhiselt, näitas 12/16 (75 protsenti) tdT pluss rakku rohelise fluorestsentsi suurenemist aja jooksul pärast tubulaarset perfusiooni pHrodo Green E. coli BioParticles'iga (joonis 9b). Iga raku lineaarse regressiooni tulemused on esitatud täiendavas tabelis 4. PHrodo Greeni E. coli bioosakeste fagotsütoosi ja IC-de poolt hapestamise kohta saadud elusate in vivo intravitaalse kujutise leiud valideeriti in vitro voolutsütomeetria testiga. Hiirneerurakk"IC reporter" hiirte suspensioon, milles IC-d (CD45-tdT pluss ) ekspresseerivad endogeenselt tdT-d, eksponeeriti pHrodo Green E. coli BioParticles'iga versus rakud ainult söötmega. Rakususpensioonis olevad CD45 pluss immuunrakud kontrolliti positiivse kontrollina ja CD45-tdT-rakud (mitte-IC-d) kontrolliti negatiivse kontrollina. Võrreldes ainult meediat
bioosakestega kokkupuude, roheline fluorestsents, mis näitab bioosakeste omandamist ja hapestumist, suurenes {{0}},7-lt 62,8 protsendile CD45 pluss rakkudest. See leid näitab eeldatavat bakterite omastamist professionaalsete fagotsüütide, näiteks neutrofiilide poolt. Huvitaval kombel oli rohelisi bioosakesi omastanud 22,2 protsenti IC-dest, võrreldes 5,6 protsendiga mitte-IC-dest (täiendav joonis 20), meediumikontrollis oli omastamine 0,7 protsenti IC-dest ja 0 protsenti mitte-IC-dest.
Arutelu
IC-sid on raske uurida, eriti inimestel, kuna need moodustavad ainult 7 protsentineerudrakud, koosnevad paljudest alatüüpidest ja ei säilita kultuuris oma fenotüüpi 33 . Chen et al. 22 teatas üheraku analüüsist hiireganeerudrakud ja Lake et al. teatas ühetuumalisest RNA sekveneerimise torujuhtmest inimeselneerudrakud 34,35 . Need uuringud tuvastasid kaks A-IC-de alatüüpi. Siin oleme välja töötanud metoodika üherakulise sekveneerimise teostamiseks elujõulistel rikastatud inimese IC-del. Me rikastasime elujõuliste IC-de jaoks, mitte ei järjestanud kõikineerudrakke, et võimaldada sellele rakutüübile rohkem keskenduda. Meie peamised leiud olid (a) tuvastamine, et hübriidarvutid-IC-d võivad vastuseks UPEC-i kokkupuutele muuta oma RNA kiiruse suunda personaalarvutitest eemale ja A-IC-de poole, (b) on olemas vähemalt kolm A-IC-de alamtüüpi ja nende suhteline. sagedused võivad nihkuda vastusena UPEC-i kokkupuutele, (c) fagosoomide küpsemine on juhtiv bioloogiline rada mitmes A-IC alatüübis ja võib UPEC-i kokkupuute korral suhtelise tähtsusega suureneda, ja (d) IC-d fagotsüteerivad ja hapestavad UPEC-i in vivo eluspildi pildistamise ajal. hiired.
IC-d diferentseeruvad vastusena atsidoosile, muutes oma polaarsuse 36,37. On teatatud, et IC-d tekivad AQP2- ekspresseerivatest rakkudest38. 2017. aastal tuvastasid Chen ja tema kolleegid hiire üherakulise profiiliga topeltpositiivsed rakud, mis ekspresseerisid Aqp2 koos Slc4a1 või Slc26a4-ga. Park ja kolleegid kinnitasid need tulemused järgmisel aastal 22,35 . 2019. aastal näitasime valkude ja mRNA immunomärgistusega, et hübriidsed PC-IC-d on olemas 15 . Täpsemalt, 9 protsenti hiire IC-dest, mis on määratletud V-ATPaasi B1 fluorestsents-immunomärgistusega, ekspresseerisid ka Aqp2 mRNA-d, mis on määratletud fluorestseeruva in situ hübridisatsiooniga15. Käesolev uuring määratles inimeste populatsioonineerud- AQP2, ATP6V1G3 ja SLC4A1 ekspresseerivate kanalirakkude kogumine, mis on kooskõlas hübriidsete PC-IC-dega. tSNE ja UMAP graafikutel koondusid need hübriidrakud arvutitele kõige lähemale, kuid erinesid traditsioonilistest arvutitest IC-markeri ekspressiooni alusel. SLC8A1 ekspressioon erines sellest rakutüübist. Huvitaval kombel on SLC8A1 väga seotud epiteeli-mesenhümaalse üleminekuga. Täpsemalt, SLC8A1 puudumine muudab epiteelirakkude fenotüüpe E-kadheriini 39 kateniini vahendatud destabiliseerimise kaudu. Siin demonstreerime, et IC-d eristuvad vastuseks uropatogeeni kokkupuutele. Hübriidsed PC-IC rakud muudavad vastusena UPEC-le oma RNA kiirust, mRNA ekspressiooni aja derivaati, PC-dest eemale ja A-IC-de poole. Hiirtel on Ransick et al. 30 tuvastas Slc8a1 ekspressiooni peamiselt distaalses keerdunud tuubulis ja rakkudes, mis meenutavad PC-sid ühendustuubulis. Meie konfokaalse mikrokoopia kujutiste hindamiselneerudSLC8A1 ekspressiooni, leidsime isoleeritud rakud, mis ekspresseerisid SLC8A1 AQP2-positiivsetes tuubulites (nt kogumiskanalites või ühendavates tuubulites). Tuvastasime ka AQP2-negatiivsed tuubulid, milles enamik rakke ekspresseeris SLC8A1, mis võib olla kooskõlas ülalmainitud distaalse keerdunud tuubuli Slc8a1 ekspressiooniga hiirtel. Mõnel A-IC alatüübil on pärast UPEC-i kokkupuudet erinevad juhtivad bioloogilised rajad ja A-IC-alatüübi A suhteline sagedus on vastuseks UPEC-ile suurenenud. Need leiud näitavad, et A-IC alatüüp A võib esindada kaasasündinud immuunvarianti. SLC8A1 roll IC diferentseerimisel nõuab tulevaste uuringute uurimist.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Tegime scRNA-seq 1861 inimeselneerudrakud, millest 1066 olid IC-d. Hiire eksperimentaalsete mudelite kontekstualiseerimiseks inimese patofüsioloogiaga on oluline võrrelda inimese ja hiire IC-sid. Chen ja tema kolleegid rikastasid hiire IC-sid c-KIT-ga ja viisid läbi scRNA-seq 22 . Nad klassifitseerisid 74 rakku PC-deks, 87 A-IC-deks ja 23 rakku B-IC-deks 22 . Ransick et al. 30 teostas scRNA-seq 688 IC-l. Nad ei rikastanud IC-sid, vaid pigem jagasid neidneerudajukooresse, medulla sisemisse ja välimisse medullasse, et hinnata tsoonide erinevusi 30 . Näitasime, et hiire kogumise kanalite rakutüüpi markerite ekspressioon näis olevat inimese kogumiskanalirakkudes suures osas konserveerunud. See, kas hiirtel on inimestega võrreldavad A-IC alatüübid, nõuab tõenäoliselt suurema arvu hiire IC-de sihipärast üherakulist hindamist.
Tuvastasime kaasasündinud immuunvalkude, näiteks immuun- ja põletikumediaatori galektiin 3 (LGALS3) ja ADM-i scRNA-seq IC ekspressiooni, millest oleme varem teatanud näriliste IC-des 15, 40–42 . Mõnedel võtmetähtsusega kaasasündinud immuunvalkudel, millest on varem teatatud IC-des, nagu Lipocalin 2 (LCN2/NGAL), RNASE7 ja teemaksulaadne retseptor 4 (TLR4), oli aga minimaalne ekspressioon või neid ei täheldatud inimese IC-des üherakulisel tasemel. meie analüüs 6,9 . LCN2 / NGAL ja TLR4 ekspressiooni vähesus IC-des on kooskõlas sellega, mida meie uurimisrühm koos Ransicki jt on hiire IC-des teatanud. 30neerudcellexplorer/] 15 . Chen et al. 22 teatas mõningast TLR4 ja NGAL mRNA ekspressioonist IC-des, kuid mitu korda vähem kui personaalarvutites. Hindasime ühendatud inimese IC-sid RNASE7 ekspressiooni jaoks ja tuvastasime selle IC-des 1-st 4-stneerud(täiendav joonis 18), mis näitab, et selle ekspressioon võib sõltuvalt piirkonnast, ajapunktist ja füsioloogilistest tingimustest olla katkendlik. On näidatud, et CISH-i ekspressioon, mis indutseeritakse nonA nonB IC-des vastusena UPEC-le, reguleerib kaasasündinud immuunvastust Mycobacterium tuberculosis'e vastu kopsus ja põrnas43. IC-d fagotsüteerisid baktereid mitme minuti jooksul ja meie scRNA-seq rakud eksponeeriti UPEC-ile suhteliselt lühikese 1-tunnise ajapunkti jooksul. Tulevased uuringud on vajalikud selleks, et teha kindlaks, kas muud IC-rajad, nagu AMP ekspressioon või rakusurma reguleerimine, muutuvad hilisematel ajahetkedel pärast UPEC-i kokkupuudet silmatorkavamaks.
Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 μm plasmamembraani ümbrise poolt 44 . "Professionaalsed fagotsüüdid", müeloidist pärinevad immuunrakud, sealhulgas makrofaagid, neutrofiilid ja osteoklastid, eristavad sissetungivaid mikroobe mikrobiotast ja tervetest rakkudest, neelavad sihtmärgi fagosoomi, genereerivad reaktiivseid hapniku liike (ROS), sekreteerivad AMP-sid ja esitlevad antigeene. muud rakud 45–49 . Oluline on see, et professionaalsetele fagotsüütidele on iseloomulik fagolüsosoomide tugev hapestamine V-ATPaasi poolt, mis loob happelise mikrokeskkonna, mis on piisav enamiku mikroobide tapmiseks 48,50. Näiteks V-ATPaasi inhibeerimine bafilomütsiin A1-ga pärsib makrofaagide bakteritsiidset aktiivsust51. Teatud epiteelirakud fagotsüteerivad mikroobe, kuid on bakterite hävitamisel vähem tõhusad kui professionaalsed fagotsüüdid ja neid on kirjeldatud kui mitteprofessionaalseid fagotsüüte 52 . IC-d esindavad epiteeli liini, millel on fagotsütoos ja antigeeni esitlemise võime (joonised 6-9) koos tugeva AMP ekspressiooni ja helde mitokondritega, mis tekitavad ROS-i; seega näib, et IC-del on makrofaagidega võrreldav bakterite tapmise potentsiaal kui ülalnimetatud mitteprofessionaalsetel fagotsüütidel 8,53–55. Varem on näidatud, et A-IC-d on võimelised dekstraani apikaalseks endotsütoosiks suurel määral tsütoplasmaatilistesse vesiikulitesse 56 . Me oletame, et UPEC-i IC-fagotsütoos on makrofaagidega jagatud omaduste laiendus, sealhulgas V-ATPaasi ekspressioon, redokspotentsiaal, AMP sekretsioon ja endotsütoosi võimed 8, 16, 49, 57, 58 . Tuleb veel kindlaks teha, kas IC-d suudavad rakujääke ja muid baktereid peale UPEC-i fagotsüteerida sarnaselt professionaalsete fagotsüütidega.
Üksiku konfokaalne kujutisneerudIn vivo bakteritega perfuseeritud tuubul laieneb varasematele in vitro tehnikatele, nagu rakukultuur ja dissekteeritud tuubulite perfusioon. Siin töötasime välja metoodika, et otse testida elusate hiirtega, kas fagotsütoos on IC-funktsioon. Intravitaalne mikroskoopia võimaldab keerukalt uurida dünaamilisi rakuprotsesse toimivas hiiresneerud59 . Varasemad strateegiad intravitaalse mikroskoopia kasutamiseks on hõlmanud intravitaalsete värvainete või markerite süsteemset süstimist hiirtele, et uurida proksimaalse tuubuli endotsütoosi,neerudverevoolu dünaamika ja vaskulaarne või glomerulaarne läbilaskvus 60 . Kui intravitaalset mikroskoopiat kombineeritakse keerukate kirurgiliste tehnikatega, saab uurida nakkusprotsesside varajasi ajapunkte, mida on raske hinnata61. Varem mikroperfuseeriti baktereid rottide proksimaalsetes tuubulites, et hinnata verevoolu, neutrofiilide värbamist ja kuseteede obstruktsiooni 62,63. Valdav enamus UTI-sid on tingitud tõusvatest patogeenidest ja satuvad esialgu kogumiskanalisse 64,65 . Seega teeme ettepaneku, et kogumiskanal oleks peremees-patogeeni interaktsioonide hindamiseks kriitiline torukujuline piirkond. Meie intravitaalne mudelisüsteem taastab tõhusalt klassikalise
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
ühe koguva tuubuli perfusiooniuuring, kuid terve hiireganeerud,vere-, lümfi- ja neuronite varustus ning säilinud võime suhelda immuunrakkudega. Püelonefriidi patofüsioloogias on meeste ja naiste erinevused. Näiteks inimestel on emastel viis korda suurem tõenäosus haigestuda ägedasse püelonefriiti, kuid isastel hiirtel on androgeenide poolt vahendatud püelonefriidi raskusaste 66,67. Ransick ja tema kolleegid näitasid meeste ja naiste erinevusi proksimaalsetes tuubulite rakkudes, eriti orgaanilistes anioonide transporterites30. Meeste IC-sid hinnati nii meie üherakulise sekveneerimise kui ka intravitaalsetes uuringutes. IC-de rolli tõttu bakteriaalses kaitsesneerudja elektrolüütide tasakaal, sooga seotud mitmekesisus IC-funktsioonides, nagu fagotsütoos ja üherakuline geeniekspressioon, on tulevaste uuringute võtmevaldkonnad. Sellel uuringul on piirangud. UPEC-i kokkupuude inimese IC-dega meie scRNA-seq-is oli in vitro ühekordneneerudja neil võib olla erinevusi võrreldes in vivo UPEC kokkupuutega. Lisaks esindasid meie leiud inimese anatoomilist piirkondaneerudvalimi ja tulevaste erinevate asukohtadega uuringutes võib olla piirkondlik mitmekesisus, nagu on näidanud Ransick et al. 30 . IC-d moodustasid 57 protsenti meie scRNA-seq rakkudest, mis olid rikastatud ~ 7 protsendi IC koostisestneerudalgtasemel 33 . Meie proov sisaldas mõningaid teisi epiteeli- ja endoteelirakutüüpe, kuid oli negatiivne CD45 pluss immuunrakkude suhtes, mis sorteeriti välja enne IC-de rikastamist (joonis 1, täiendav joonis 1). scRNA-seq abil saab sihtmärk-IC-sid tuvastada ja eraldi hinnata. Hematopoeetilised tüvirakud ekspresseerivad c-KIT-i, kuid tõenäoliselt ei esinda needneerudmüeloidsete rakkude populatsioonid 68 . Me ei tuvastanud teisi tervel inimesel esinevaid c-KIT-i ekspresseerivaid rakkeneerud, nagu stroomarakud/telotsüüdid 69 . Varem on teatatud Henle isoleeritud ahela ja proksimaalse tuubuli c-KIT positiivsusestneerudimmunohistokeemia, mis on kooskõlas meie scRNA-seq tulemustega 70
