Neeru heptsidiini/ferroportiini telg kontrollib raua tagasiimendumist ja määrab neerude ja süsteemse raua ülekoormuse ulatuse

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 ja Samira Lakhal-Littleton1

MÄRKSÕNAD:ferroportiin; hemokromatoos; heptsidiin; raud; raua ülekoormus;neeru-torukesed

Ferroportiin (FPN) on ainus teadaolev imetajate rauaekspordivalk. See vahendab raua vabanemist vereringesse kaksteistsõrmiksoole enterotsüütidest ja põrna retikuloendoteliaalsetest makrofaagidest, vastavatest raua imendumise ja taaskasutamise kohtadest.1,2 FPN-vahendatud raua vabanemist antagoniseerib hormoon heptsidiin, tuntud ka kui heptsidiini antimikroobne peptiid (HAMP). Peamiselt maksas toodetud heptsidiin seondub FPN-iga ja indutseerib selle internaliseerumist, piirates seeläbi raua vabanemist vereringesse ja selle kättesaadavust perifeersetes kudedes.3,4 Seega toimib HAMP/FPN telg imendumise ja ringlussevõtu kohtades, et kontrollida süsteemset toimet. raua homöostaas.

Neerud on raua reabsorptsiooni koht. Nii mitte-transferriiniga seotud kui ka transferriiniga seotud raud võib ristuda glomerulaarfifiltraati.5 Valdav enamus sellest rauast imendub tagasi tubulaarsesse epiteeli. Sellesse tagasihaardesse on kaasatud mitmed transporterid, sealhulgas multiligandi megaliin-kubiliini retseptori kompleks, transferriini retseptor 1, kahevalentne metallitransporter 1, tsingi transporter ZIP8 ja tsingi transporter ZIP14.5–10.

Kord sisseneeru-epiteel, raud imendub tagasi vereringesse. FPN-i on selles rohkestineerudja on seotud raua reabsorptsiooniga.11–14 Siiski jääb teadmata, kas neerude FPN-i reguleerib ka normaalsetes füsioloogilistes tingimustes endogeenne HAMP, ja kui jah, siis kas selline regulatsioon on oluline süsteemse ja/või neerude raua homöostaasi jaoks.

Nende küsimuste lahendamiseks lõime uudse indutseeritava hiiremudelineeru-tuubul– spetsiifiline fpnC326Y sisselülitamine, mis kodeerib HAMP-resistentset FPNC326Y valku. Lisaks, et kinnitada FPN-i varem teatatud rolli raua reabsorptsioonis, genereerisime ka indutseeritava hiiremudelineeru-tuubul– fpn geeni spetsiifiline deletsioon. Meie tulemused näitavad, et endogeenne HAMP reguleerib otseselt FPN-vahendatud raua imendumist ja et see regulatsioon on mõlema jaoks oluline.neeru-ja süsteemne raua homöostaas, eriti raua liigse kättesaadavuse korral.

See uuring on esimene, kus kasutati hiirtel, kellel on neeruspetsiifiline HAMP-tundlikkuse kaotus, et ametlikult määratatähtsustselleneeru-HAMP/FPN telg. See annab uusi teadmisi raua reabsorptsiooni rollist neerude ja ekstrarenaalse raua ülekoormuse määramisel hemokromatoosi taustal.

MEETODID

Hiired

Kõik loomadega tehtavad protseduurid vastasid Ühendkuningriigi 1986. aasta koduloomade (teaduslike protseduuride) seadusele ja Oxfordi ülikooli meditsiiniteaduste osakonna eetilise läbivaatamise komitee poolt.

Tingimuslikud fpnflfl ja fpnC326Yflfl alleelid genereeriti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud.15,16

Pax8.CreERT2þ transgeeni kandvad hiired kinkis dr Athena Matakidou Ühendkuningriigi Cambridge'i Vähiuuringute Instituudist, Cambridge'i ülikoolist. Need hiired loodi nagu eelnevalt kirjeldatud.17 Kõik hiired olid C57BL/6 taustal.

Dieedid

Kui pole öeldud teisiti, anti loomadele standardne näriliste sööt, mis sisaldas 200 miljondikosa (ppm) rauda. Rauaga manipuleerimise katsetes anti hiirtele 3-ks võõrutamisest rauasisaldusega dieeti (5000-ppm rauda; Teklad TD.140464) või sobivat kontrolldieeti (200- ppm rauda; Teklad TD.08713). kuud.

Raua kvantifitseerimine ja rauaindeksid 

Seerumi raua ja ferritiini tase määrati ABXPentra süsteemi (Horiba Medical) abil. Hemoglobiini väärtused määrati HemoCue Hb 201 hemoglobiini mikroküvettide abil. Seerumi erütroferrooni taset mõõdeti ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (Intrinsic Lifesciences). Elementaarse raua üldsisaldus kudedes määrati induktiivselt sidestatud plasma massispektromeetria abil, nagu eelnevalt kirjeldatud.15, 16, 18 Kalibreerimine saavutati standardse lisamise protsessiga, kus piigid 0 ng/g, 0,5 ng/ Valitud proovi replikaatidele lisati rauda g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g ja 100 ng/g. Väline rauastandard (High Purity Standards ICP-MS-68-A lahus) lahjendati ja mõõdeti kalibreerimise õigsuse kinnitamiseks. Roodiumi lisati ka sisestandardina igale tühikatsele, standardile ja proovile kontsentratsiooniga 1 ng/g. Uriini rauasisalduse kvantifitseerimiseks koguti hiirtelt uriin 24 tunni jooksul ja allutati induktiivselt seotud plasma massispektromeetriale. Kreatiniini taset samades proovides mõõdeti kolorimeetrilise kreatiniinianalüüsi komplekti (Abcam; ab65340) abil ja raua väärtused normaliseeriti kreatiniini kontsentratsioonini.

Immunohistokeemia 

Fluorestsents-immunovärvimine viidi läbi formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud koelõikudes, kasutades FPN antikeha (Novus Biologicals; NBP1-21502) vahekorras 1:100 ja pro-hepcidiini (AA 39-59) antikeha vahekorras 1:50. (Antibodies Online; ABIN350367). FPN-i ja heptsidiini antikehade spetsiifilisus kinnitati, kasutades negatiivsete kontrollidena vastavalt Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ loomi ja Hamp–/– loomi (täiendav joonis S1). Neerusegmendi markerid tuvastati, kasutades akvaporiini-1 antikeha 1:200 (Biotechne; NB600- 749), akvaporiini-2 antikeha 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), või kalbindiini antikeha suhtes 1:100 (Abcam; ab82812). Sekundaarsed antikehad olid küüliku IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), eeslivastane IgG Cy3 (Abcam; ab6949) ja hiire IgG vastane Alexa568 (Abcam; ab175473). Slaidid pildistati FV1000 Olympuse mikroskoobiga.

cistanche suudab kaitstaneerudfunktsiooni

Western blotting

Kuded külmutati vedelas lämmastikus, purustati ja seejärel lüüsiti RIPA lüüsipuhvrisüsteemi (Santa Cruz; sc{0}}) abil vastavalt tootja juhistele. Koelüsaadid puhastati tsentrifuugimisega 15 000g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Lüsaatide valgu kontsentratsiooni mõõdeti BCA valguanalüüsiga (Pierce; 23225) ja normaliseeriti iga partii puhul samale kontsentratsioonile. Seejärel lahjendati lüsaadid mitteredutseerivas Laemmli naatriumdodetsüülsulfaadi proovipuhvris ja kuumutati 95 °C juures 5 minutit. Valk (30–50 mg) laaditi Mini-PROTEAN TGX geelidele (Biorad; 4561096). Pärast elektroforeesi kanti valk BioRad Translotter süsteemi abil polüvinülideendifluoriidmembraanile ja membraane blokeeriti tund aega blokeerimispuhvris, mis sisaldas 5 protsenti veise seerumi albumiini. Seejärel värviti membraane üle öö temperatuuril 4 °C küüliku polüklonaalse hiire FPN-vastase antikehaga (NBP1-21502; Novus Biologicals) vahekorras 1:1000 või mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud anti-b-aktiini antikehaga (Proteintech; HRP{{18}). }) kell 1:5000. Blotid töötati välja, kasutades ECL prime tuvastamise komplekti (RPN2232; VWR International). Signaali intensiivsused kvantifitseeriti ImageJ abil ning FPN ja b-aktiini signaalide suhe arvutati normaliseeritud intensiivsuse saamiseks.

Diaminobensidiini (DAB) täiustatud Perlsi plekk

Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud koelõigud deparaffineeriti ksüleeni abil ja seejärel rehüdreeriti etanoolis. Seejärel värviti slaide 1 tund 1% kaaliumferritsüaniidiga 0,1 mol/L HCl puhvris. Endogeense peroksidaasi aktiivsus kustutati ja seejärel värviti slaidid DAB kromogeeni substraadiga ja värviti hematoksüliiniga. Neid visualiseeriti tavalise ereda valgusvälja mikroskoobi abil.

Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon

Geeniekspressiooni mõõdeti, kasutades Applied Biosystems TaqMangene ekspressioonianalüüsi sonde Hampi ja majapidamisgeeni baktiini jaoks (Life Technologies). Esmalt normaliseeriti huvipakkuva geeni künnistsükli (CT) väärtus, lahutades DCT väärtuse saamiseks b-aktiini CT väärtuse. Testproovide DCT väärtused normaliseeriti täiendavalt kontrollproovide DCT väärtuste keskmisega, et saada DDCT väärtused. Seejärel arvutati suhtelised geeniekspressiooni tasemed kui 2-DDCT.

Statistika

Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. Paarisvõrdlused viidi läbi Studenti t testi abil. Dispersioonanalüüsi abil tehti mitu võrdlust. Post hoc testides kasutati Bonferroni korrektsiooni.

Joonis 1|Heptsidiini/ferroportiini (FPN) telg neerutuubulites kontrollib raua tagasiimendumist ja on oluline neerude raua homöostaasi jaoksemastel hiirtel. (a)Tüüpilised kujutised FPN, akvaporiin 1 (AQP1), akvaporiin 2 (AQP2) ja Calbindin (CalD) immunofluorestsentsvärvimisest metsiktüüpi hiirte neerudes. Vardad¼ 200 mm, algne suurendus 10. Otsapaneel, latt¼ 25 mm, algne suurendus 60. (b) Western blot FPN jaoksneerudemaste ja isaste FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreER T2 þ hiirte ja FpnC326Y flfl/flfl kontrollide puhul 1 nädal pärast tamoksifeenravi. Signaali intensiivsuse kvantifitseerimine on näidatud alumisel paneelil. (c) Western blot FPN määramiseks emaste ja isaste Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirte ja Fpnflfl/flfl kontrollide neerudes 1 nädal pärast ravi tamoksifeeniga. Signaali intensiivsuse kvantifitseerimine on näidatud alumisel paneelil. (d) Neerude rauasisaldus naistel ja meestel FpnC326Y^flfl/^flfl,Pax8.CreERT2þ hiired ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollrühmad 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeenravi. (e) Tüüpilised kujutised diaminobensidiiniga (DAB) tugevdatud Perlsi rauaplekist vastavate loomade neerukoore piirkonnas 3 kuud pärast tamoksifeeni indutseerimist. Vardad ¼ 200 mm, algne suurendus 10. (f) Neerude rauasisaldus emastel ja isastel Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja Fpnflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeeni induktsiooni. ( g ) DAB-võimendatud Perlsi rauapleki tüüpilised kujutised vastavate loomade neerukoore piirkonnas 3 kuud pärast tamoksifeeni indutseerimist. (jätkub)

Joonis 1 |(Järgneb) Tulbad ¼ 200 mm, algne suurendus 10. (h) Seerumi rauasisaldus emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeenravi. (i) Seerumi rauasisaldus emastel ja isastel Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja Fpnflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeeni induktsiooni. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" ja="" ****p="">< 0,0001.="" b-akt,="" b-aktiin;="" jätk,="" kontroll;="" dapi,="" 40,="" 6-diamidino-2-fenüülindool;="" ppm,="" osa="" miljoni="" kohta.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

TULEMUSED

Heptsidiini / FPN telg neerutuubulites kontrollib raua tagasiimendumist ja on oluline emaste hiirte neerude raua homöostaasi jaoks

Esmalt püüdsime kindlaks teha FPN-i ekspressiooni täpse asukohaneerud. Selleks kulutasime hiire neerud FPN-i ja segmendispetsiifiliste markerite akvaporiini 1 (Henley proksimaalsete keerdunud tuubulite ja õhukese laskuva jäseme marker), akvaporiini 2 (kogumiskanalite ja ühendavate tuubulite marker) ja kalbindiini (marker) jaoks. distaalsete keerdunud tuubulite ja kortikaalsete ühendus- ja kogumiskanalite puhul). Leidsime, et FPN ekspresseerub tugevalt ajukoores, kolokaliseerudes akvaporiiniga 1 proksimaalsetesse keerdunud tuubulitesse. Sisemises medullas oli veidi FPN-i, mis kolokaliseerus akvaporiin 2-ga medullaarsetesse kogumiskanalitesse. FPN-i kolokaliseerimist kalbindiiniga ei toimunud (joonis 1a; suurem paneel on näidatud lisajoonisel S2). Need tulemused kinnitavad, et FPN on kõige rikkalikum kortikaalses piirkonnas proksimaalsetes keerdunud tuubulites.

Et teha kindlaks, kas neeru FPN-i reguleerib HAMP, kasutasime hiiri, kellel oli Pax8.CreERT2þ knock-in transgeen, mis juhib tamoksifeeniga indutseeritavat Cre rekombinaasi ekspressiooni paariskarpgeeni 8 pax8 promootori kontrolli all proksimaalsetes ja distaalsetes tuubulites ning 17 Ristasime Pax8.CreERT2þ hiired nendega, kellel oli tinglikult sissetungiv flfloxed alleel FpnC326Y, mis kodeerib heptsidiiniresistentset FPN-i. Lisaks ja kinnitamaks varem teatatud neerude FPN-i rolli raua tagasiimendumisel, ristasime Pax8.CreERT2þ hiired hiirtega, kellel oli Fpnflfl / flfl alleel. Nädal pärast tamoksifeenravi transgeeni Pax8.CreERT2 indutseerimiseks suurenes neerude FPN tase emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel võrreldes FpnC326Yflfl/flfl kontrollidega (joonis 1b), mis näitab, et FPN allub neerude reguleerimisele. endogeenne HAMP normaalsetes füsioloogilistes tingimustes ja lisaks kinnitab Pax8.CreERT2þ transgeeni efektiivsust. Seevastu vähenes neerude FPN tase emastel ja isastel Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirtel võrreldes Fpnflfl/flfl kontrollidega, mis kinnitas veelgi Pax8.CreERT2þ transgeeni efektiivsust (joonis 1c). Selle Pax8.CreERT2þ transgeeni spetsiifilisust kinnitas ka deletsioonialleeli (DFpn) olemasoluneerudkuid mitte Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirte maksas ega põrnas (täiendav joonis S2A).

Järgmisena otsustasime kindlaks teha, kas neeru HAMP / FPN telg kontrollib raua tagasiimendumist. Sel eesmärgil mõõdeti neerude ja seerumi rauasisaldust 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeenravi. Leidsime selle neerude raua

sisaldus oli kõigil ajahetkedel madalam FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ emastel kui FpnC326Yflfl/flfl kontroll-emastel (joonis 1d). Neerude rauasisaldus meestel ei erinenud vastavalt genotüübile (joonis 1d). DAB-tugevdatud Perli rauaplekk kinnitas ka rauasisalduse vähenemist FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ emaste proksimaalsetes tuubulites (joonis 1e; suurem paneel on näidatud lisajoonisel S2). Vastupidi, me leidsime, et neerude rauasisaldus oli kõrgem Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ emastel kui Fpnflfl/flfl kontrollrühma emastel alates 1 kuust (joonis 1f). Neerude rauasisaldus meestel ei erinenud vastavalt genotüübile (joonis 1f). DAB-tugevdatud Perlsi rauaplekk kinnitas ka raua kogunemist Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ emaste proksimaalsetesse tuubulitesse (joonis 1g; suurem paneel on näidatud lisajoonisel S2).

Seerumi rauasisaldus tõusis ajutiselt nii isastel kui ka emastel FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ hiirtel võrreldes FpnC326Yflfl/flfl kontrollidega 1-kuu ajapunktis (joonis 1h). Vastupidi, seerumi rauasisaldus langes Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ emasloomadel võrreldes Fpnflfl/flfl kontroll-naistega 1-kuu ajahetkel, samas kui erineva genotüübiga meestel jäi see kõigil ajahetkedel võrreldavaks (joonis 1i). ). Seerumi rauasisalduse taastumist kontrollloomadel 3 kuu vanustel loomadel täheldatud tasemele ei saanud seostada normaalse neeru FPN taseme taastumisega. Tõepoolest, Pax8.CreERT2-indutseeritud muutused neerude FPN tasemetes püsisid endiselt 3 kuud pärast tamoksifeenravi (täiendav joonis S2B ja C). Vähenenud neerude rauasisaldus ja suurenenud seerumi rauasisaldus FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ emastel näitab, et FPN-sõltuv raua reabsorptsioon proksimaalsetes tuubulites on normaalsetes füsioloogilistes tingimustes reguleeritav HAMP-ga. Suurenenud neerude rauasisaldus ja vähenenud seerumi rauasisaldus Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ emastel kinnitavad varasemaid leide, et neerude FPN aitab kaasa raua tagasiimendumisele. Lisaks näib normaalsetes füsioloogilistes tingimustes raua reabsorptsiooni kontroll neeru HAMP/FPN telje poolt olevat naistel olulisem kui meestel, vähemalt C57BL/6 tüve puhul.

Cistanche võib parandada neerufunktsiooni

Neerude HAMP/FPN telg aitab kaasa normaalsele raua normaalsele saadavusele, kuid ei ole selle jaoks hädavajalik.

Järgmisena otsustasime määrata neeru HAMP / FPN telje panuse raua süsteemsesse homöostaasi. Leidsime, et FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ emastel oli seerumi ferritiini (joonis 2a), maksa rauasisalduse (joonis 2b) ja põrna rauasisalduse (joonis 2c) mööduv tõus 1-kuulisel ajahetkel, kui võrreldes FpnC326Yflfl/flfl kontroll-naistega. Nende hemoglobiinitase oli kõigil ajahetkedel võrreldav kontrollide omaga (joonis 2d). Ükski neist parameetritest ei erinenud FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ meeste ja nende FpnC326Yflfl/flfl kontrollide vahel (joonis 2a–d). Erütroferrooni tasemed ei erinenud vastavalt genotüübile (täiendav joonis 3A). Seevastu leidsime, et Fpnflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ emastel on madalam seerumi ferritiinitase 1- ja 3-kuu ajapunktides (joonis 2e), madalam maksa rauasisaldus 3- ja 6-kuu ajapunktid (joonis 2f) ja madalam põrna rauasisaldus 1- ja 3-kuu ajapunktides (joonis 2g), võrreldes Fpnflfl/flfl kontroll-naistega. Neil oli ka hemoglobiinitaseme mööduv ja kerge langus 3-kuu ajapunktis (joonis 2h). Ükski neist parameetritest ei erinenud Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ meeste ja nende Fpnflfl/flfl kontrollide vahel (joonis 2e–h). Samuti ei muutunud erütroferrooni tasemed vastavalt genotüübile (täiendav joonis 3B). Need andmed näitavad koos, et normaalsetes füsioloogilistes tingimustes aitab neeru HAMP / FPN telg kaasa süsteemsele rauatasemele, kuid iseenesest ei ole see normaalse süsteemse raua homöostaasi säilitamiseks hädavajalik.

Joonis 2|Neeru heptsidiini antimikroobse peptiidi/ferroportiini (FPN) telg aitab kaasa normaalsele süsteemsele aktiivsusele, kuid ei ole selle jaoks hädavajalik.raua homöostaas normaalse raua kättesaadavuse tingimustes. (a–d)Süsteemsed rauaindeksid emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast ravi tamoksifeeniga, sealhulgas (a) seerumi ferritiin, (b) maksa rauasisaldus (c) põrna rauasisaldus ja (d) hemoglobiin. (e–h) Süsteemsed rauaindeksid emastel ja isastel Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja Fpnflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeeni indutseerimist, sealhulgas (e) seerumi ferritiin, ( f) maksa rauasisaldus, (g) põrna rauasisaldus ja (h) hemoglobiin. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" ja="" ***p="">< 0,001.="" ppm,="" osa="" miljoni="">

Joonis 3|Neeru heptsidiini antimikroobse peptiidi (HAMP) / ferroportiini (FPN) telg määrab neerude ja süsteemse raua ülekoormuse ulatuse raua liigse kättesaadavuse tingimustes. (a–f)Ekstrarenaalsed rauaindeksid emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollidel pakkusid kas kontrolltoidu (200 miljondikosa [ppm]) või rauasisaldusega dieeti (5000 ppm) 3 kuu jooksul. (jätkub)

Joonis 3 |(Järgneb) Indeksid hõlmavad (a) seerumi rauasisaldust, (b) seerumi ferritiini, (c) põrna rauasisaldust, (d) südame rauasisaldust, (e) kopsu rauasisaldust ja (f) maksa rauasisaldust. (g) Neerude rauasisaldus emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollrühmal oli kas kontrolltoidu (200 ppm) võirauast koormatuddieet (5000 ppm) 3 kuud. ( h, i ) Diaminobensidiini (DAB) tugevdatud Perlsi rauapleki tüüpilised kujutised vastavate loomade maksas ja neerukriitilises piirkonnas. Tulbad ¼ 200 mm, algne suurendus 10. (j) Hampi geeni suhteline ekspressioon vastavate loomade maksas. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001,="" *****p="">< 0,00001="" ja="" ******p="">< 0,000001.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Neeru HAMP/FPN telg määrab neerude ja süsteemse raua ülekoormuse ulatuse raua liigse kättesaadavuse tingimustes 

Järgmisena otsustasime määrata neeru HAMP / FPN telje rolli raua ülekoormuse määramisel. Selleks indutseeriti FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ loomi ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollrühmi tamoksifeeniga ja anti seejärel 3 kuu jooksul kas kontrolltoidu, mis sisaldas 200 ppm rauda, ​​või rauasisaldusega dieeti, mis sisaldas 5000 ppm rauda. . Leidsime, et rauasisaldusega dieedi tagamine suurendas seerumi raua, seerumi ferritiini ja kudede rauasisaldust mõlema genotüübi meestel ja naistel. FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ loomadel oli aga suurem seerumi raua (joonis 3a), seerumi ferritiini (joonis 3b) ja rauasisalduse suurenemine põrnas (joonis 3c), südames (joonis 3d), kopsus (joonis 3e). , ja maksa (joonis 3f) kui FpnC326Yflfl/flfl kontrollides. Seevastu neil oli neerude rauasisaldus väiksem (joonis 3g). Genotüüpide vahelised erinevused raua koormuse määras proksimaalsetes tuubulites ja maksas ilmnesid ka DAB-i täiustatud Perlsi rauapleki puhul (joonis 3h ja i; suuremad paneelid on näidatud täiendaval joonisel S4). Kooskõlas suurema süsteemse raua ülekoormusega suurenes FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ loomadel ka maksa hampi geeniekspressioon suurem kui FpnC326Yflfl/flfl kontrollidega (joonis 3j). Dieet ega genotüüp ei mõjutanud hemoglobiini taset ning sellega kooskõlas jäi ka seerumi erütroferrooni tase muutumatuks (täiendav joonis 4A ja B). Need leiud näitavad, et raua liigse kättesaadavuse tingimustes vähendab raua tagasiimendumise kontroll neeru HAMP / FPN telje poolt süsteemset raua ülekoormust, suurendades samal ajal neerude raua ülekoormust.

Neeru HAMP/FPN telg määrab hemokromatoosi kudede raua ülekoormuse mustri 

Järgmisena asusime uurima neeru HAMP/FPN telje rolli päriliku hemokromatoosi kontekstis, mis on raua ülekoormuse geneetiline seisund, mis on põhjustatud heptsidiini tootmise või heptsidiini tundlikkuse defektidest.19 Selleks kasutasime hiiri, mis on loodud maja, mis sisaldab heterosügootset üldlevinud fpnC326Y alleeli (Fpnwt / C326Y) sissetungi. Varem olime näidanud, et neil hiirtel tekib pärilikule hemokromatoosile iseloomulik raua ülekoormuse fenotüüp.15,18 Võrdlesime koe mustrit.raua ülekoormusnendel hiirtel, mida täheldati metsiktüüpi hiirtel, keda toideti 3 kuu jooksul võõrutusest rauarikka dieediga. Nii Fpnwt/C326Ymice kui ka metsikut tüüpi hiirtel, keda toideti rauarikka dieediga, olid

suurenenud rauasisaldus maksas, südames ja kopsudes võrreldes nende vastavate kontrollidega (joonised 4a ja b). Neerude rauasisaldus Fpnwt / C326Yhiirtel oli 3 kuu vanuselt normaalne (joonis 4a) ja suurenes 6 kuu vanuselt kontrollidega võrreldes ainult 32 protsenti (täiendav joonis 5A). Seevastu metsiktüüpi loomadel, kellel oli rauasisaldusega toit, suurenes rauasisaldus neerudes 260 protsenti võrreldes normaalse dieediga loomadega (joonis 4b). Suhtelised erinevused neerude ja maksa raua ülekoormuses kahe mudeli vahel ilmnesid ka DABenhanced Perlsi rauapleki puhul (joonis 4c ja d; suuremad paneelid on näidatud lisajoonisel S5). Neeruvälise raua ülekoormuse ulatus oli kahe mudeli vahel võrreldav, samas kui rauasisaldusega dieediga metsiktüüpi loomadel oli neerude ülekoormuse ulatus tunduvalt suurem kui Fpnwt / C326Y hiirtel (joonis 4e). FPN suurenes ajukoores nii Fpnwt / C326Y hiirtel kui ka metsiktüüpi hiirtel, kes pakkusid rauasisaldusega dieeti (joonised 4f ja g; suuremad paneelid on näidatud lisajoonisel S5). FPN ekspressioonikoha täpsem uurimine proksimaalsetes tuubulites näitas, et see lokaliseerub nii rakusiseselt kui ka basolateraalsele membraanile Fpnwt/C326Y hiirtel. Seevastu näis, et FPN lokaliseerub peamiselt tsütoplasmas, apikaalses membraanis ja üllataval kombel pakkus hiirte tuum rauasisaldusega dieeti (joonis 4f ja g, alumised paneelid). Rauasisaldusega dieedist tuleneva FPN lokaliseerimise mustrit kinnitati täiendavalt, kasutades negatiivsete kontrollidena Fpnflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ loomi (täiendav joonis S5B). Need tähelepanekud koos eelneva järeldusega, et FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ loomadel on neerude rauakoormus madalam kui kontrollidel pärast katse andmist.rauast koormatuddieediga, näidake, et HAMP-i toime kadumine neerude FPN-ile kaitsebneerudrauakoormusest päriliku hemokromatoosi taustal.

ARUTELU

Käesoleva uuringu kõige olulisem järeldus on see, et endogeenne HAMP kontrollib FPN-vahendatud raua reabsorptsiooni. Varasemad uuringud on teatanud FPN-i reguleerimisest eksogeense HAMP-ga kultiveeritud neerurakkudes ning pöördvõrdelisest seosest HAMP-i ja FPN-i tasemete vahelneerudpärast ühepoolset kusejuha oklusiooni.12,13 See on aga esimene tõestus, et selline regulatsioon toimib in vivo normaalsetes füsioloogilistes tingimustes ja viisil, mis mõjutab neerude ja süsteemset raua homöostaasi. Selle uuringu eriliseks tugevuseks on ettevõttesiseselt loodud uudsete hiirte kasutamine HAMP-i tundlikkuse neeruspetsiifilise kaotuse tagamiseks. See lähenemisviis võimaldab uurida neeru HAMP / FPN telge ilma muutunud süsteemse raua homöostaasi segavate mõjudeta, mida muidu nähakse üldlevinud loommudelites.

Joonis 4|Neerude heptsidiini antimikroobne peptiid / ferroportiin (FPN) määrab kudede raua ülekoormuse mustri hemokromatoosi korral. (a)Rauasisaldus Fpnwt/C326Y loomade ja Fpnwt/wt kontrollide neerudes, maksas, südames ja kopsudes 3 kuu vanuselt. b) rauasisaldus veresneerud, maks, süda ja kopsud metsikloomadel, kes said kas kontrolltoidu (200 miljondikosa [ppm]) või rauasisaldusega dieeti (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) võõrutamisest 3 kuu jooksul. ( c ) Tüüpilised kujutised diaminobensidiiniga (DAB) tugevdatud Perlsi rauaplekist Fpnwt/C326Y loomade ja Fpnwt/wt kontrollide neerukoores ja maksas 3 kuu vanuselt. Varras ¼ 200 mm, originaal suurendus 10. ( d ) DAB-võimendatud Perlsi rauapleki esinduslikud kujutised metsiktüüpi loomade neerukoores ja maksas pakkusid 3 kuu jooksul võõrutamise järel kas kontrolltoidu (200 ppm) või rauaga koormatud dieeti (5000 ppm). Varras ¼ 200 mm, esialgne suurendus 10. e) Fpnwt/C326Y loomade ja rauasisaldusega dieediga metsiktüüpi loomade vahelise raua koormuse astme võrdlus kudedes. Iga looma kohta näidatud väärtused normaliseeritakse vastava kontrollrühma keskmisega. (f) Tüüpilised kujutised FPN immunofluorestsentsvärvimisest Fpnwt/C326Y loomade ja Fpnwt/wt kontrollide neerukoores 3 kuu vanuselt. Ülemine paneel, vardad ¼ 200 mm, algne suurendus 10. Alumine paneel, riba ¼ 25 mm, algne suurendus 60. (g) Tüüpilised kujutised FPN immunofluorestsentsvärvimisest metsiktüüpi loomade neerukoores, pakkusid kas kontrolltoitu (200) ppm) või rauasisaldusega dieeti (5000 ppm) võõrutusest 3 kuu jooksul. Ülemine paneel, vardad ¼ 200 mm, algne suurendus 10. Alumine paneel, riba ¼ 25 mm, algne suurendus 60. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" ja="" ****p="">< 0,0001.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Käesoleva uuringu teine ​​oluline järeldus on see, et neeru HAMP / FPN määrab nii neerude kui ka süsteemse raua ülekoormuse suuruse (joonis 5). Tõepoolest, HAMP-i tundlikkuse kaotus neerutuubulites suurendas maksa, põrna, südame ja kopsude raua ülekoormust, vähendades samal ajal rauasisaldusega dieedi järgset neerude raua ülekoormuse ulatust. Kooskõlas sellega täheldati metsiktüüpi loomadele (millel neeru HAMP/FPN telg oli puutumata) rauasisaldusega dieedi tagamisel neerude raua ülekoormust hemokromatoosiga hiirtel (kellel on ka neeru HAMP/FPN telg). häiritud) (graafiline abstraktne). See leid võib selgitada kliinilist tähelepanekut, etneerudei ole päriliku hemokromatoosiga patsientidel sageli mõjutatud.19

Joonis 5|Neeru heptsidiini antimikroobse peptiidi (HAMP) / ferroportiini (FPN) telje roll raua ülekoormuse määramisel.Rauasisaldusega dieedi tagamine suurendab seerumi raua kättesaadavust ja raua taset glomerulaarfifiltraadis ning suurendab heptsidiini (HAMP) tootmist ja vabanemist maksas. Suurenenud seerumi HAMP inhibeerib raua tagasiimendumist, blokeerides FPN-i neerutuubulites. Raua tagasiimendumise pärssimine põhjustab raua retentsiooni neerudes, vähendades samal ajal raua süsteemset kättesaadavust ja seega ka maksa raua ülekoormust. FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel põhjustab HAMP-i tundlikkuse kadumine neerutuubulites raua reguleerimata reabsorptsiooni. See omakorda takistab raua retentsiooni neerudes, suurendades samal ajal süsteemset raua kättesaadavust ja suurendades seejärel maksa raua ülekoormust.

Kuigi nii hemokromatoos kui ka toiduga saadav raua ülekoormus suurendasid neerutuubulite FPN-i, näisid need põhjustavat apikaalsetes, rakusiseste või basolateraalsetes sektsioonides erinevaid lokaliseerimismustreid. Sarnased tähelepanekud tehti roti kaksteistsõrmiksoole puhul, kus leiti, et rauasond muudab FPN suhtelist jaotumist nende sektsioonide vahel kaksteistsõrmiksoole enterotsüütides.20 Üks nende tulemuste tõlgendus on see, et toiduga saadava raua ülekoormuse taustal suurenes FPN translatsioon (vahendatud: rauda reguleerivad valgud) säilitaksid kõrge üldise FPN-i produktsiooni neerutorukeste rakus, samas kui suurenenud seerumi HAMP vähendaks FPN-i osakaalu, mis võib lokaliseerida basolateraalsele membraanile. Sellest tõlgendusest järeldub, et varasemate aruannete lahknevus FPN-i lokaliseerimise kohta proksimaalsetes tuubulites võib peegeldada neerutuubulite rauasisalduse ja seerumi heptsidiini taseme erinevusi erinevates uuringutes kasutatud loommudelite vahel. 5,11–14,21. see lahknevus võib peegeldada mittespetsiifilist reaktiivsust, millest on varem teatatud seoses kaubanduslike FPN-i antikehadega, sealhulgas käesolevas uuringus kasutatud antikehaga.14 FPN-i apikaalse lokaliseerimise funktsionaalne tähtsus neerutuubulites jääb ebaselgeks ja me ei suutnud tuvastada mingeid muutusi. raua eritumisel uriiniga rauaga koormatud hiirtel (täiendav joonis 5C). Veel üks huvitav tähelepanek on see, et mõned FPN-id paiknesid rauaga koormatud hiirte neerutuubulite tuumas. Sarnaseid tähelepanekuid tegid ka teised rauaga koormatud makrofaagide ja roti maksas. Viimases uuringus leiti, et tuuma FPN osaleb tuumaraua retentsioonis osana ägeda faasi vastusest.22, 23 FPN subtsellulaarse lokaliseerimise kohta erinevates rauaseisundites ja erinevates patoloogiates on vaja üksikasjalikke uuringuid, et edendada meie rollist arusaamist. FPN neerudes.

Ka neeru HAMP-i reguleerimine ja funktsioon ei ole täielikult teada. Leidsime, et hampi geeni ekspressioon neerus suurenes metsiktüüpi loomadel pärast rauasisaldusega dieedi pakkumist (täiendav joonis 5E), kuid jäi muutumatuks hemokromatoosiga hiirtel (täiendav joonis 5D) ja neerutuubulitega hiirtel. FPN-i või neerutuubulite spetsiifiline HAMP-tundlikkuse kadu (täiendav joonis S5F ja G). Need tulemused ei toeta arvamust, et neeruhamp geeni ekspressiooni reguleerib lokaalselt neeru raua tase. Neerude HAMP-i funktsiooni osas näitas eelmine uuring ühepoolse kusejuha oklusiooni mudelis, et see on seotud neerude FPN-i kontrollimisega. Leidsime, et neeru HAMP (tuvastatud pro-HAMP peptiidi vastase antikeha abil) kolokaliseeriti kalbindiiniga (distaalsete keerdunud tuubulite ja kortikaalsete kogumiskanalite ja ühenduskanalite marker) (täiendav joonis S5H). Teisest küljest ei kolokaliseeru FPN-i ekspressioon kalbindiiniga isegi hiirtel, kellel on neeruspetsiifiline HAMP-tundlikkuse kaotus (joonis 1a ja täiendav joonis S5I). Need tulemused ei ole kooskõlas neeru HAMP-i autokriinse rolliga neerude FPN-i reguleerimisel. Sellegipoolest võib neeru HAMP olla seotud neerude FPN parakriinse reguleerimisega. Tulevikus oleks huvitav uurida neeru-HAMP-i parakriinseid funktsioone ja kvantifitseerida neerude ja maksa HAMP-de suhtelist panust raua tagasiimendumise kontrollimisse.

Veel üks huvitav tähelepanek käesolevast uuringust on see, et normaalse raua kättesaadavuse tingimustes ei ole neeru HAMP/FPN telg normaalse süsteemse raua homöostaasi säilitamiseks hädavajalik ning on selle asemel olulisem neerude rauataseme reguleerimiseks, vähemalt emastel hiirtel. tüvi C57BL/6. Tõepoolest, kuigi täheldatud muutused neerude rauatasemetes, mis tulenevad FPN-i või HAMP-i tundlikkuse kadumisest neerutuubulites, olid püsivad, olid muutused süsteemsetes rauaindeksites oma olemuselt mööduvad. Süsteemsete mõjude mööduv iseloom viitab kaasamise kompenseeriva(te)le mehhanismile. Üks võimalik kompenseeriv mehhanism on toidust saadava raua imendumise moduleerimine maksa HAMP-i poolt. Tõepoolest, leidsime, et hiirtel, kellel oli neeruspetsiifiline HAMP-tundlikkuse kaotus, suurenes maksa hampi geeni ekspressioon pärast seerumi rauataseme tõusu 1-kuu ajapunktis ja jäi hilisematel ajahetkedel suurenenud. Vastupidi, maksa hamp geeni ekspressioon pärssis hiirtel, kellel oli neeruspetsiifiline FPN kadu pärast seerumi rauataseme langust 1- kuu ajahetkel, ja jäi allasurutuks hilisematel ajahetkedel (täiendav joonis S6A ja B). Lisaks kaasnes esimeses seadistuses suurenenud maksahampi geeniekspressiooniga soolestiku FPN-i taseme langus, samas kui maksahampi geeniekspressiooni vähenemisega teises seades kaasnes kõrgem soolestiku FPN (täiendav joonis S6C ja D). Need tulemused näitavad, et maksa HAMP-i toime toidu kaudu saadavale raua imendumisele on aktiivne kompenseeriv mehhanism, mis on seotud normaalse süsteemse raua homöostaasi säilitamisega neerude raua häiritud reabsorptsiooni korral.

Cistanche võib parandada neerufunktsiooni

Pange tähele, et normaalse raua kättesaadavuse tingimustes näib neeru HAMP / FPN telg emastel hiirtel olevat olulisem kui isastel hiirtel, vähemalt C57BL / 6 tüve puhul. Seda tähelepanekut ei saa seostada erinevustega isaste ja naiste vahel Pax8.CreERT2þ transgeeni aktiivsuses. Selles hiiretüves on varem teatatud seksuaalsest dimorfismist nefroni transporterite tasemetes ja mustrites.24 Kooskõlas sellega leidsime FPN-i kõrgema basaalekspressiooni veres.neerudemastel kui isaste pesakonnakaaslaste neerudes (täiendav joonis S2D). Eelmine uuring, milles kasutati erinevat Cre rekombinaasi transgeeni, mida ajendas konstitutiivselt aktiivne Nestini promootor, et kustutada fpn kogu nefronis, teatas samuti neerude rauataseme tõusust ning seerumi raua ja maksa rauavarude vähenemisest. Kuid see uuring viidi läbi erineva hiiretüvega (129/SvEvTac) ja ei analüüsitud fenotüüpi vastavalt soole ega ajakulule.14

hemokromatoos ja muud rauahaigused.

AVALIKUSTAMINE

Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

SL-L sai Briti Südamefondi vahepealse baasteaduse järeldoktori stipendiumi (FS/12/63/29895). GM-i rahastas aÜhendkuningriigi neeruuuringute projekttoetus (RP_020_20160303), mis on antud SL-L-le.

AUTORI KAASALAD

SL-L kavandatud uuring. SL-L ja GM viisid läbi katsed. SL-L analüüsis ja tõlgendas tulemusi. SL-L kirjutas käsikirja. AM panustas materjale. PAR kommenteeris käsikirja.

LISAMATERJAL

Täiendav fail (PDF)

Joonis S1. FPN ja HAMP antikeha spetsiifilisuse kinnitamine. (A) Tüüpilised kujutised FPN immunofluorestsentsvärvimisest Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ loomade ja Fpnflfl/flfl kontrollide neerukoores 3 kuu vanuselt. Ülemised paneelid, latt ¼ 200 mm, algsuurendus 10. Alumised paneelid, latt ¼ 25 mm, algne suurendus 60. (B) Tüüpilised kujutised HAMP-i immunofluorestsentsvärvimisest Hamp–/– loomade neerukoores ja metsiktüüpi kontrollid temperatuuril 3 elukuud. Ülemised paneelid, latt ¼ 200 mm, originaal suurendus 10. Alumised paneelid, latt ¼ 25 mm, originaal suurendus 60.

Joonis S2. Pax8.CreERT2þ tegevuse ja spetsiifilisuse kinnitus. (A) Fpnflfl/flfl ja Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirte genotüpiseerimine, kasutades genoomset DNA-d, mis on ekstraheeritud maksast, põrnast janeerud1 nädal pärast tamoksifeeni induktsiooni. (B) Western blot FPN-i jaoksneerudemaste ja isaste FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja FpnC326Y kontrollide puhul 3 kuud pärast ravi tamoksifeeniga. Alumisel paneelil näidatud signaali intensiivsuse kvantifitseerimine. (C) Western blot FPN jaoks emaste ja isaste Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja Fpnflfl/flfl kontrollide neerudes 3 kuud pärast ravi tamoksifeeniga. Alumisel paneelil näidatud signaali intensiivsuse kvantifitseerimine. (D) Western blot FPN jaoks metsiktüüpi emaste ja isaste pesakonnakaaslaste neerudes 3 kuu vanuselt. Alumisel paneelil näidatud signaali intensiivsuse kvantifitseerimine. (E–G) Paneelide suuremad versioonid vastavalt joonisel 1a, g ja e. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P < 0.05,="" ***p=""><>

Joonis S3. Seerumi erütroferrooni tase ei muutu FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ ja Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2 hiirtel. (A) Seerumi erütroferrooni tase emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast ravi tamoksifeeniga. (B) Seerumi erütroferrooni tase emastel ja isastel Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja Fpnflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeeni indutseerimist. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina.

Joonis S4. Hemoglobiini ja seerumi erütroferrooni tase ei muutu rauasisaldusega dieedil FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ. (A) Hemoglobiini tase emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollrühmal, kellele manustati kas kontrolltoiduga (sisaldab 200 ppm rauda) või rauasisaldusega dieediga (sisaldab 5000 rauda sisaldavat 3 kuud) . (B) Seerumi erütroferrooni tase emastel ja isastel FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollrühmal, keda toideti kas kontrolltoiduga (sisaldab 200 ppm rauda) võirauarikas dieet(sisaldab 5000 ppm rauda) võõrutamisest 3 kuud. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. (C, D) Paneelide suuremad versioonid vastavalt joonisel 3h ja i.

Joonis S5. Neerude raua käitlemine ja neeruhamp ekspressioon erinevates hiiremudelites. (A) Neerude rauasisaldus Fpnwt/C326Y loomadel ja Fpnwt/wt kontrollidel 6 kuu vanuselt. (B) Tüüpilised kujutised FPN ja AQP1 immunofluorestsentsvärvimisest Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ loomade ja Fpnflfl/flfl kontrollide neerukoores, keda toideti 3 kuu jooksul pärast võõrutamist rauasisaldusega dieediga, mis sisaldas 5000 ppm. Varras ¼ 25 mm, esialgne suurendus 60. (C) Uriini rauasisaldus (normaliseeritud uriini kreatiniinile) metsiktüüpi loomadel, keda toideti 3 kuu jooksul 5000 ppm rauda sisaldava rauasisaldusega dieediga või 200 ppm rauda sisaldava kontrolltoiduga. (D) Neeruhampi geeni ekspressioon Fpnwt/C326Y loomadel ja Fpnwt/wt kontrollidel 3 kuu vanuselt. (E) Neeruhamba geeni ekspressioon metsiktüüpi loomadel, keda toideti 3 kuu jooksul võõrutamise ajal rauasisaldusega dieediga, mis sisaldas 5000 ppm rauda, ​​või kontrolltoiduga, mis sisaldas 200 ppm rauda. (F) Neeruhamba geeni ekspressioon emastel ja isastel FpnC326Yflflflfl,Pax8.CreERT2þ hiirtel ja FpnC326Yflflflfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeenravi. (G) Neeruhampi geeni ekspressioon emastel ja isastel Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ hiirtel ja Fpnflfl/flfl kontrollidel 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeeni indutseerimist. (H) Tüüpilised kujutised HAMP ja CalD immunofluorestsentsvärvimisest metsiktüüpi loomade neerukoores 3 kuu vanuselt. Riba ¼ 25 mm, algne suurendus 60. (I) Tüüpilised kujutised FPN ja CalD immunofluorestsentsvärvimisest FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ loomade neerukoores 1 kuu vanuses. Varras ¼ 25 mm, algne suurendus 60. (J–M) Paneelide suuremad versioonid vastavalt joonisel 4c, d, f ja g. Väärtused on näidatud keskmise SEM-ina. *P <>

Joonis S6. Maksahampi geeniekspressioon ja soolestiku FPN tasemed on muutunud hiirtel, kellel on neerutuubulispetsiifiline fpn-i väljatõrjumine, ja hiirtel, kellel on neerutuubulispetsiifiline fpnC326Y knock-in. (A) Hampi mRNA suhteline ekspressioon emaste FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollide maksas 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast ravi tamoksifeeniga. (B) Hampi mRNA suhteline ekspressioon emaste Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja Fpnflfl/flfl kontrollide maksas 1 nädal, 1 kuu, 3 kuud ja 6 kuud pärast tamoksifeenravi. (C) Tüüpilised kujutised FPN immunovärvimisest emaste FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja FpnC326Yflfl/flfl kontrollide soolestikus 1 kuu pärast ravi tamoksifeeniga. Varras ¼ 200 mm, algne suurendus10. (D) Tüüpilised kujutised FPN immuunvärvimisest emaste Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ hiirte ja Fpnflfl/flfl kontrollide soolestikus 1 kuu pärast ravi tamoksifeeniga. Varras ¼ 200 mm, algne suurendus 10. Väärtused on näidatud keskmise SEM-na. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" ja=""><>

Cistanche võib leevendada neerupõletikku

VIITED

1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL jt. Raua eksportija ferroportiin / slc40a1 on raua homöostaasi jaoks hädavajalik. Lahtri metab. 2005;1:191–200.

2. Ganz T. Rakuraud: ferroportiin on ainus väljapääs. Lahtri metab. 2005;1:155–157.

3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J et al. Heptsidiin reguleerib raku raua väljavoolu, seondudes ferroportiiniga ja indutseerides selle internaliseerumist. Teadus. 2004;306:2090–2093.

4. Qiao B, Sugianto P, Fung E jt. Heptsidiinist põhjustatud ferroportiini endotsütoos sõltub ferroportiini ubikvitinatsioonist. Lahtri metab. 2012;15:918–924.

5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. Neerude raua transpordi iseloomustus anesteseeritud rotil in vivo. J Physiol. 2000;524:581–586.

6. Christensen I, Birn H, Storm T jt. Endotsüütilised retseptorid neeru proksimaalses tuubulis. Füsioloogia. 2012;27:223–236.

7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Neerude raua metabolism: transferriini raua kohaletoimetamine ja raua reguleerivate valkude roll. J Am Soc Nephrol. 2007;18:401–406.

8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Nramp2 rauatransporteri rakuline ja subtsellulaarne lokaliseerimine sooleharja piiril ja regulatsioon toidurauaga. Veri. 1999;93: 4406–4417.

9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S jt. ZIP8 on raua ja tsingi transporter, mille rakupinna ekspressiooni reguleerib rakuline rauakoormus. J Biol Chem. 2012;287:34032–34043.

10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Raua metabolism rauast põhjustatud neerukahjustuse patogeneesis. Nat Rev Nephrol. 2013;9:385–398.

11. Wolff N, Liu W, Fenton R jt. Ferroportiin 1 ekspresseeritakse basolateraalselt roti neeru proksimaalsetes tuubulite rakkudes ja raua liig suurendab selle membraani liikumist. J Cell Mol Med. 2011;15:209–219.

12. Pan S, Qian ZM, Cui S jt. Kohalik heptsidiin suurendas rakusisest raua ülekoormust ferroportiini lagunemise kaudu neerudes. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:322–327.

13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C jt. Heptsidiin reguleerib intrarenaalset raua käitlemist distaalses nefronis. Kidney Int. 2013;84:756–766.

14. Wang X, Zheng X, Zhang J jt. Ferroportiini füsioloogilised funktsioonid neerude raua ringlussevõtu ja isheemilise ägeda neerukahjustuse reguleerimisel. Am J Physiol Renal Physiol. 2018;315:F1042–F1057.

15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ jt. Heptsidiini oluline raku autonoomne roll südame raua homöostaasis. Elife. 2016;5: e19804.

16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA jt. Südame ferroportiin reguleerib rakulise raua homöostaasi ja on oluline südamefunktsiooni jaoks. Proc Natl Acad Sci US A. 2015;112:3164–3169.

17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K jt. Pax8-CreERT2 transgeense liini ja Slc22a6-CreERT2 knock-in liini genereerimine ja iseloomustamine neerutuubulite epiteelirakkude indutseeritavaks ja spetsiifiliseks geneetiliseks manipuleerimiseks. PLoS One. 2016;11:e0148055.

18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frize M jt. Intratsellulaarne rauapuudus kopsuarteri silelihasrakkudes kutsub hiirtel esile pulmonaalse arteriaalse hüpertensiooni. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122–13130.

19. Camaschella C. Raua homöostaasi mõistmine hemokromatoosi ja sellega seotud häirete geneetilise analüüsi kaudu. Veri. 2005;106: 3710–3717.

20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A jt. Rauavaru määrab soolestiku rauatransporterite DMT1 ja ferroportiini 1 apikaalse/basolateraalse membraani jaotuse. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C477–C485.

21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Neerude roll raua homöostaasis: prohepcdiini, ferroportiini ja DMT1 ekspressioon neerudes aneemilistel hiirtel. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F1213–F1221.

22. Naz N, Malik I, Sheikh N jt. Ferroportiin-1 on "tuuma"-negatiivne akuutse faasi valk roti maksas: võrdlus teiste rauda transportivate valkudega. Lab Invest. 2012;92:842–856.

23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Raua laadimine suurendab ferroportiini heterogeense tuuma RNA ja mRNA taset hiire J774 makrofaagides. J Nutr. 2009;139:434–438.

24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J jt. Neerude transporterite ja elektrolüütide homöostaasi seksuaalne dimorfne muster. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 3504–3517.