Kaempferool leevendab LD-mitokondriaalseid kahjustusi, soodustades autofagiat: mõju Parkinsoni tõvele, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Uued tõendid näitavad, et ootamatu lipiidipiiskade (LD) sadestumine ja peroksüdatsioon võivad kiirendada organellide stressi ja mängib olulist rolli neurodegeneratiivsete haiguste (NDD) patogeneesis. Oma eelmises uuringus kinnitasime, et kaempferool (Ka), looduslik flavonoidi väike molekul. , avaldas neuroprotektiivne toime LPS-indutseeritud Parkinsoni tõvega (PD) hiirtele. Lisaks on varasemad uuringud näidanud, et autofagia mängib olulist rolli raku LD ladestumise reguleerimisel. Käesolevas uuringus näitasime, et Ka kaitses MPTP/p-indutseeritud PD hiirtel TH pluss neuronite kadumise ja käitumishäirete eest, millega kaasnes vähenenud lipiidide oksüdatiivne stress substantia nigra pars compactas (SNpc). Kultiveeritud neuronaalsetes rakkudes ilmnes Ka. suhteliselt ohutu kontsentratsioonivahemik ja pärssis oluliselt MPP pluss indutseeritud LD akumulatsiooni ja raku apoptoosi. Edasine uuring näitas, et Ka kaitsev toime sõltus autofagiast, täpsemalt lipofagiast. Kriitiliselt soodustas Ka autofagiat, et vahendada LD lagunemist lüsosoomides, mis seejärel leevendas lipiidide ladestumist ja peroksüdatsiooni ning sellest tulenevaid mitokondriaalseid kahjustusi, vähendades järelikult neuronite surma. Lisaks kaotas AAV-shAtg5-vahendatud Atg5 knockdown Ka neuroprotektiivse toime lipiidide oksüdatsiooni vastu PD hiirtel. See töö näitab, et Ka hoiab ära dopamiinergilise neuronaalse degeneratsiooni PD-s lipiidide peroksüdatsiooni poolt vahendatud mitokondriaalse kahjustuse pärssimise kaudu, soodustades huulte autofagiat, ja pakub potentsiaalset uudset ravistrateegiat PD ja sellega seotud NDD-de jaoks.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi (PD) on levinud neurodegeneratiivne haigus (NDD), mida patoloogiliselt iseloomustab dopamiinergiliste (DA) neuronite järkjärguline kadumine substantia nigra pars compacta (SNpc)[]. Kuigi selle haiguse täpset etioloogiat ja loomulikku kulgu ei ole veel täielikult välja selgitatud, on PD patogeneesis kaasatud arvukad süsteemitasandi protsessid ja düsfunktsioonid, sealhulgas mitokondriaalsed funktsioonid, dopamiini homöostaas, neuropõletik ja autofagia [1, 2]. Hiljutised aruanded näitasid, et lipiidipiiskadega (LD) seotud lipotoksilisus võib osaleda PD patoloogias [3, 4]. LD-d on väga dünaamilised organellid, mis väljuvad endoplasmaatilisest retikulumi (ER) membraanist ja toimivad tavaliselt neutraalse lipiidide säilitamise rakusiseste saitidena [5]. Hiljuti näidati, et LD-d mängivad palju laiemat rolli kui rasvhapete (FA) säilitamine ja osalevad paljudes haigustes. Näiteks müeloidrakud, sealhulgas makrofaagid, leukotsüüdid ja eosinofiilid, moodustavad vastuseks põletikule ja stressile LD-sid ning LD-d on põletikuliste tsütokiinide tootmise ja säilitamise kohad ning on lisaks seotud antigeeni esitlemise ja patogeeni kliirensiga [6]. Oluline on see, et ateroskleroosi korral on LD-rikkad vahtrakud haiguse kõigis etappides kahjulikud [7].

Cistanche võib aidata parandada immuunsust

Siiski ei ole LD-sid kesknärvisüsteemis (KNS) põhjalikult uuritud, vähesed paberid kirjeldavad LD-de histoloogilist esinemist inimese ajukoes [8, 9]. Sellegipoolest võivad LD-d omada ajus olulisi funktsioone, kuna hiljutised uuringud kinnitasid, et glia agregeeritud LD-d kiirendasid Drosophila mudelis neurodegeneratsiooni [10]. Hiljuti on teatatud, et hiirtel on õlipunased O-positiivsed lipiididega koormatud rakud, sealhulgas neuronid, gliiafibrillaarne happeline valk (GFAP) pluss astrotsüüdid ja ioniseeritud kaltsiumi siduv adaptermolekul-1 (IBA-1). ) mikrogliia, esinevad paljudes ajupiirkondades ja on näidatud, et nad osalevad vanusega seotud protsessides [11]. Meie eelmine töö näitas ka suurenenud LD akumuleerumist ajus PD hiiremudelis [12]. Kokkuvõttes näitavad need uuringud, et LD-d võivad olla seotud PD, aga ka teiste NDD-de patogeneesiga.

Tavaliselt lagunevad rakusisesed LD-d lüsosoomides ja toimetavad FA-d mitokondritesse, et neid tarbida alternatiivse energiaallikana toitainete ammendumise perioodidel [13]. Neuronidel on aga vähene mitokondriaalse FA tarbimise võime energia tootmiseks [14]. See omadus muudab neuronid eriti tundlikuks LD akumulatsiooni ja peroksüdatsiooni suhtes. Lisaks suurendab LD-de akumuleerumine FA oksüdatsioonikiirust ja avaldab mitokondriaalsele elektronide transpordiahelale püsivat survet, mis suurendab oksüdatiivse stressi võimendamiseks elektronide transpordiahela komplekside I ja II [15] reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist. Lipiidide ülekoormus põhjustab ka ROS-i tootmist ekstramitokondriaalsetest allikatest, nagu nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat (NADPH) oksüdaasid ja muud oksüdatiivsed ensüümid. Koos antioksüdantsete ensüümide vähenenud ekspressiooni ja FA tarbimise vähese võimega neuronites vahendab LD akumuleerumine oksüdatiivset stressi ja võib veelgi põhjustada mitokondriaalseid kahjustusi, lüsosomaalset düsfunktsiooni, defektset autofagiat ja põletikuliste reaktsioonide aktiveerimist [16, 17]. Kui kogunenud LD-sid ei saa inhibeerida või eemaldada, läbivad väga aktiivsed neuronid patofüsioloogia, mis põhjustab neurodegeneratsiooni [17]. Tõendid näitavad, et lüsosoomide vahendatud kataboolne protsess, mida nimetatakse autofagiaks, mängib keskset rolli rakulise LD homöostaasi säilitamisel mitmes koes [17,18]. Üksikasjalikult saab LD-sid selektiivselt sekvestreerida autofagosoomides ja toimetada lüsosoomidesse lüsosomaalsete happelipaaside poolt lagunemiseks, mis on spetsiifiliselt lipofaagiana tuntud protsess [19]. Seetõttu võib LD-de sihtimine ja nende autofagiline eemaldamise rada kujutada endast uudset lähenemisviisi neurodegeneratsiooni juhtimisele.

Viimastel aastatel on tohutut huvi pälvinud looduslike toodete ja dieetainete uurimine võimalike NDD-ravi ja strateegiate allikatena [20]. Kaempferool (Ka) on looduslik polüfenoolne väike molekul, mida võib leida paljudest Hiina ravimtaimedest ja toiduallikatest [21]. On teatatud, et Ka avaldab antibakteriaalset, vananemisvastast ja immunomoduleerivat toimet, samuti antioksüdantset ja neuroprotektiivset toimet [20, 22, 23]. Varem teatati, et Ka inhibeerib põletikku BV2 mikrogliiarakkudes in vitro [24] ja suurendab DA neuronite resistentsust neuropõletiku suhtes in vivo [25]. Kuid Ka mõju LD-dele PD-s ei ole veel uuritud.

Arvestades LD-de tähtsust ja LD-de, mitokondrite ja autofagia vahelist intiimset seost [16], mis kõik on seotud PD-ga, oletame, et Ka pärsib LD peroksüdatsiooni ja takistab DA neurodegeneratsiooni PD-s. Käesolevas uuringus näitasime, et Ka kaitses märkimisväärselt neurodegeneratsiooni eest hiire PD mudelis, inhibeerides LD akumulatsiooni. Täiendav uuring näitas, et Ka vallandas autofagia ja vähendas oksüdeeritud LD-de kuhjumist, et leevendada mitokondriaalset düsfunktsiooni ja mitokondriaalset ROS-i (mtROS) tootmist, vältides seeläbi neuronaalset apoptootilist surma. Selles uuringus saadud tulemused võivad aidata suunata kliinilisi otsuseid loodusliku molekuli Ka kasutamise kohta NDD-des, nagu PD.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Katseloomad

C57BL/6J hiired (isased, 4-kuused) saadi ettevõttest Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Hiiri hoiti ja kasvatati Nanjingi meditsiiniülikooli arstiteaduskonna loomaressursside keskuses ja Nanjing Drum Toweri haigla loomakasvatusasutuses. Hiirtel on vaba juurdepääs toidule ja veele ruumis, mille ümbritseva õhu temperatuur on 22 kraadi ± 2 kraadi ja valguse/pimeduse tsükkel 12:12 tundi. Kõik loomkatsed viidi läbi rangelt kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendi juhistega.

2.2. Reaktiivid

MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 protsenti,96 353) in vitro katsete jaoks saadi firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) osteti ettevõttelt Thermo Fisher Scientific. Loomkatsetes lahustati Ka 10% DMSO lahuses 16% SBE- -CD-s steriilses soolalahuses. Rakukatsete jaoks valmistati Ka DMSO-s (Sigma-Aldrich) ja PBS-is (DMSO lõppkontsentratsioon on 0,01 protsenti), pH 7,4.

2.3. Metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP) indutseeritud PD hiiremudeli indutseerimine ja ravi

Ka mõju hindamiseks MPTP/p-toksilisuse PD mudelis jagati hiired (isased, 4-5 kuu vanused) juhuslikult soolalahusega töödeldud rühma, MPTP-ga ravitud rühma, MPTP pluss Ka-ga töödeldud rühma. rühm ja Ka üksi ravitud rühm. MPTP-ga ravitud rühmas manustati hiirtele kroonilist MPTP-d vastavalt eelnevalt kirjeldatule [26]: MPTP lahustati soolalahuses ja süstiti subkutaanselt annuses 25 mg/kg, millele järgnes 250 mg/kg probenetsiidi (lahustatuna dimetüülsulfoksiidis). intraperitoneaalne (ip) süstimine 1-tunniste intervallidega iga 3,5 päeva järel 5 nädala jooksul. Kontrollhiired said soolalahuse ja probenetsiidi süsti. MPTP pluss Ka-ga ravitud rühmas said hiired Ka (50 mg/kg, üks süst/päevas katsete ajal, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Hiina) intraperitoneaalselt (.p.) iga päev 3 päeva enne ravi MPTP-ga ja üle 5. MPTP süstimisnädalad. Nädal pärast viimast MPTP süsti tehti hiirte käitumistestid, mis olid rühmade suhtes pimedad. Pärast seda anesteseeriti kõik hiired 40 mg/kg naatriumpentobarbitaaliga ja ohverdati ajuvalkude tuvastamiseks ja immunohistokeemia või qPCR analüüsi jaoks.

2.4. In vivo stereotaksiline kirurgia ja eksperimentaalsed ravimeetodid

Stereotaksiline operatsioon naatriumpentobarbitaali anesteesia all (40 mg/kg, ip) viidi läbi nagu kirjeldatud [25]. Hiire Atg5 ja kontroll-shRNA transfekteeriti AAV genereerimiseks pakkevektoritega (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP). Mikrosüstimiseks asetatakse tuimestatud hiired stereotaksilisse aparaati. Neile süstiti 1 μLAAV klaaselektroodiga, mis oli suunatud DG(AP: -0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm) kiirusega 0,25 μL/min Seejärel hoiti nõela alles veel 2-min.2 nädalat pärast viiruse mikrosüstimist, hiired allutati MPTP-indutseeritud PD mudeli juhtivusele ja (või) Ka-ravile.

Atg5 shRNA saadi ettevõttelt Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Atg5 vaikuse jaoks on praimerid näidatud täiendavas tabelis 1.

2.5. Käitumisanalüüs

Nädal pärast MPTP või soolalahuse viimast süstimist viidi läbi rotarod-test ja pooluste test, nagu eelnevalt kirjeldatud [27]. Rotarod-testi jaoks aklimatiseeriti hiired rotarodiga kahes katses (6 minutit kiirendatud kiirusega 12-20 pööret minutis) päevas 2 päeva järjest enne katse algust. Seejärel testiti hiiri kiirusel 20 pööret minutis 300 sekundit ülejäänud 3 järjestikuse päeva jooksul. Languse latentsusaeg registreeriti Rotarodi analüüsisüsteemi abil (Jiliang, Shanghai, Hiina). Varrastesti jaoks asetati hiired pea püsti vertikaalse puidust varda otsa (kareda pinnaga, kõrgus 50 cm, läbimõõt 1 cm). Kõik hiired olid aparaadiga harjunud 2 päeva enne testimist ja seejärel testiti neid kolm korda kolmandal päeval. Registreeriti koguaeg (T-summa, kuni hiir jõudis oma nelja käpaga põrandale) ja pöördeaeg (T-pööre, et hiir pööraks täielikult pea alla). Katse pimestati hiirerühmadega iga käitumistesti jaoks ja test viidi läbi kolm korda.

2.6. Ajuproovide kogumine

Pärast viimaseid käitumisteste anesteseeriti hiired naatriumpentobarbitaaliga (40 mg/kg, ip). qPCR, Western blot analüüsi ja kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) analüüsi jaoks eraldati loomadelt kiiresti terved ajud, seejärel keskaju ja striatumi kuded lõigati kiiresti lahti, külmutati eelnevalt vedela lämmastikuga. Kõiki proove säilitati kuni analüüsini -80 kraadi juures.

Immunohistokeemilise analüüsi jaoks perfuseeriti hiiri transkardiaalselt 4-protsendilise paraformaldehüüdiga (PFA). Ajud ekstraheeriti, järelfikseeriti, dehüdreeriti, sisestati OCT-sse (Tissue-Tek) ja ajude seerialõigud krüosekteeriti (30 um viilu kohta) läbi iga kihi ja keskaju, kasutades külmutusmikrotoomi (Leica CM1950, Nussloch, Saksamaa). ). Kõik sektsioonid koguti kuue eraldi seeriana ja ajulõike säilitati 50-protsendilises glütseroolis ja külmutati -20 kraadises kuni analüüsimiseni.

TEM-i jaoks perfuseeriti hiiri 2,5% glutaaraldehüüdiga ja 2% paraformaldehüüdiga, nagu on kirjeldatud 【12】. Väike portsjon (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunohistokeemiline analüüs

Ajulõike loputati PBS-s, millele järgnes 3% H2O2 10 min, seejärel inkubeeriti 1 tund 0,3% Triton X-100-ga PBS-is, millele oli lisatud 5% BSA-d. Pärast seda inkubeeriti slaide primaarsete antikehadega 4 kraadi juures üleöö PBS-is, mis sisaldas 5 protsenti BSA-d 4 kraadi juures üle öö, seejärel pesti ja inkubeeriti sekundaarsetes antikehades 1 tund toatemperatuuril, millele järgnes inkubeerimine diaminobensidiiniga (DAB) või paigaldamine DAPI (Life Technologies, Cat P36931) immunofluorestsentsvärvina 5 minuti jooksul. Nissl-värvimiseks liideti slaidid kresüülviolett (CV) lahuses (0,1 g kresüülviolet, 99 ml H2O ja 1% äädikhapet 1 ml) 30 minutit toatemperatuuril, seejärel dehüdreeriti alkoholi ja ksüleeniga. Pilte vaadeldi ja fotod jäädvustati Olympus BX52 mikroskoobi all (Olympus America Inc., Melville, NY, Ameerika Ühendriigid). TH-positiivsete ja Nissl-positiivsete neuronite koguarv SNpc-s saadi seroloogiliselt, kasutades optilise fraktsioneerimismeetodit MicroBrightField Stereo-Investigator tarkvaraga (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) analüüs

Hiirte juttkeha proovid homogeniseeriti {{0}},1 M perkloorhappega (1 mg kudesid 100 µl perkloorhappes) ja 0,1 mM EDTA-ga ning töödeldi

2.17. Voolutsütomeetria

Rakud seediti ja loputati D-hank'iga, seejärel värviti anneksiin V-FITC-ga (5 ul, mis on lahjendatud 500 ul PBS-s/PI-s (0,1 ul lahjendatud 500 ul PBS-s) apoptoosikomplektis (CA1020, Solarbio, Peking, Chian) vastavalt tootja protokollile. Pärast seda analüüsiti apoptootilisi rakke voolutsütomeetria abil (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA). Mitokondriaalse ROS-i ja mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõtmised viidi läbi vastavalt avaldatud andmetele 【12】.SH-SY5Y rakud värviti MitoSOX-iga (2,5 μM, Invitrogen, USA) või JCl-ga (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) ） 37 °C juures 30 minutit. Pärast kahekordset pesemist PBS-iga resuspendeeriti rakud voolutsütomeetriliseks analüüsiks külmas PBS-is, mis sisaldas 1 protsenti FBS-i. Andmeid analüüsiti FCS Expressi tarkvaraga (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Merihobu hingamise testid

Mitokondriaalset hingamisfunktsiooni elusates SH-SY5Y rakkudes mõõdeti Seahorse ekstratsellulaarse voolu (XFe96) analüsaatoriga (Agi-lent, Santa Clara, USA) hapnikutarbimise määra (OCR) muutuste kaudu. SH-SY5Y rakkudel, mis olid külvatud 3 x 103 rakku süvendi kohta, lasti kleepuda Seahorse'i rakukultuuriplaatidele ja saavutada katse ajal ligikaudu 80-protsendiline konfluentsus. Järgmisel päeval töödeldi rakke Ka-ga ja seejärel eksponeeriti MPP plussiga veel 24 tundi. OCR tuvastati põhitingimustes, millele järgnes 1 μM oligomütsiini, 1 μM FCCP, samuti 1 μM rotenooni ja antimütsiini A järjestikune lisamine.

2.19. Statistiline analüüs

Andmed esitati kui keskmine ± SEM. Erinevuste olulisus määrati Studenti t-testi, kahesuunalise dispersioonanalüüsi või ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post hoc test. Erinevust peeti oluliseks P<>

3. Tulemused

Tulemus 1. Ka taastab motoorse düsfunktsiooni ja suurendab dopamiini taset MPTP/p PD mudelhiirte juttkehas

Kaoni PD patogeneesi neuroprotektiivse toime uurimiseks süstiti 4-kuustele isastele C57BL/6 hiirtele MPTP/p PD mudeli loomiseks neurotoksiini MPTP ja neid raviti Ka-ga (joonis la). Pärast mudeli esilekutsumist kasutati hiirte motoorse ja käitumusliku jõudluse hindamiseks erinevates rühmades rotarod-testi ja poolustesti. Nagu näidatud, vähenes MPTP-ga töödeldud hiirtel rotarodi jõudlusaeg märkimisväärselt ja Ka takistas seda mõju (joonis 1b). Ka taastas ka MPTP-st põhjustatud käitumuslikud puudujäägid, mida näitavad poolustesti pöördeaja ja koguaja vähenemine (joonised lc ja d), ilma et see mõjutaks hiirte kehakaalu (joonis 1e). Lisaks näitas HPLC analüüs, et MPTP/p-ga nakatunud hiirtel oli dopamiini tase juttkehas oluliselt langenud ja see tase taastati Ka-raviga (joonis 1f). Ka-ravi leevendas ka MPTP/p-indutseeritud dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC, dopamiini metaboliit) taseme langust juttkehas (joonis 1g). Need tulemused viitavad sellele, et Ka taastab motoorse düsfunktsiooni ja suurendab MPTP-indutseeritud PD hiirte juttkeha dopamiini taset.

Tulemus 2. Ka leevendab DA neuronite kadu MPTP/p PD mudelhiirte SNpc-s

Järgmisena uurisime Kaon MPTP/p-indutseeritud DA neuronaalse kahjustuse neuroprotektiivse toime edasiseks hindamiseks türosiini hüdroksülaasi (THD pluss neuronid hiire SNpc-s immunovärvimise teel. Nagu on näidatud joonistel 2a ja b, indutseeris MPTP/p olulise vähenemise TH pluss neuronite arvus, mida Ka-ravi leevendas. Lisaks Nissli defineeritud neuronite üldarvu stereoloogiline arv SNpc-s

Joonis 1. Ka-ravi leevendab motoorset düsfunktsiooni ja suurendab dopamiini taset MPTP/p PD mudelhiirte juttkehas.

(a) Eksperimendi kavandi skemaatiline diagramm. (b) Vardale kulunud aega mõõdeti rotarod-testi jaoks kolmel järjestikusel päeval. (cd) Teivastesti jaoks registreeriti ümberpööramiseks (pööramise aeg) ja teivast laskumiseks kulunud aeg (ronimise aeg). (e) Uuringu lõpus mõõdeti hiirte kehamassi, (fg) Dopamiini (DA) ja dihüdroksüfenüüläädikhapet (DOPAC) juttkehas analüüsiti kõrgsurvevedelikkromatograafiaga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM.n =9-10 iga rühma kohta (b, C, d); n=6-8 iga rühma jaoks in(f,g).ns, ei ole oluline,*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

värvimist, kontrollis, et THt-rakkude kadu peegeldas rakusurma, kuid mitte TH ekspressiooni allareguleerimist, ja näitas, et Ka-ravi taastas Nissl-positiivsete neuronite arvu vähenemise MPTP-ga töödeldud hiirte SNpc-s 43,3 protsendilt 25,4 protsendile ( Joonised 2c ja d. Lisaks parandas Ka oluliselt MPTP-indutseeritud TH- ja DAT-valgu ekspressiooni vähenemist, mõõdetuna Western blot analüüsiga (joonis 2e-g). Need tõendid kinnitavad Ka neuroprotektiivset toimet PD hiiremudelile.

Tulemus 3. Ka vähendab LD vakuoolide kuhjumist ja oksüdatiivset stressi MPTP/p-ga töödeldud hiirte SNpc-s

Üha rohkem tõendeid on näidanud LD-de osalust NDD-des [10], järjekindlalt tuvastas meie eelmine töö MPTP-indutseeritud PD-hiirte SNpc-de suurenenud LD-de [12]. LD-sid saab hõlpsasti tuvastada ja neil on homogeense amorfse sisuga ümmargused madala tihedusega struktuurid [28]. Tavaliselt saab LD-sid lagundada autofagia kaudu, et vältida akumuleerumist [29]. Et uurida, kas Ka võib reguleerida LD-sid PD-s, analüüsiti LD-de akumuleerumist transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) abil kontroll-, MPTP/p ja MPTP/p pluss Ka hiirte SNpc-s. Nagu on näidatud meie eelmises töös [12], suurenes LD-de arv ja suurus MPTP/p hiirtel võrreldes soolalahusega töödeldud kontrollidega (joonised 3a ja b) ning vähenes oluliselt Ka-ga töödeldud hiirtel (joonis 3c). e). Veelgi enam, Ka-ga töödeldud hiirtel täheldati LD-sid sagedamini autolüsosoomide läheduses, nendesse suletud või nende poolt lagundatud, mida määratleti elektrontihedate lipofustsiini graanulitena. TH pluss neuronite edasine histoloogiline värvimine BODIPY-ga, värvainega, mis märgistab spetsiifiliselt neutraalseid lipiide ja mida tavaliselt kasutatakse LD-de tuvastamiseks [30], näitas, et nii BODIPY pluss LD-de arv kui ka suurus SNpc-s olid PD-hiirtel suurem kui kontrollrühmas. , ja need vähenesid oluliselt Ka-ravi tõttu (joonis 3f-h).

Kui LD-sid ei saa õigeaegselt lagundada, võivad kogunenud LD-d läbida peroksüdatsiooni ja soodustada mitokondriaalset ROS-i vahendatud stressi [4], mis võimendab neurotoksilisust ja haiguse progresseerumist. Seetõttu uurisime täiendavalt geenide ekspressiooniprofiile, mis on seotud kaitsega vaba FA toksilisuse (Gpx8), neutraliseerivate oksüdatiivsete liikide, superoksiidi radikaalide (Sod3) ja vesinikperoksiidi (Cat) ning FA metabolismi (Acsbg1 ja Dbi) eest, nagu on teatatud [31] , mis kõik olid MPTP-ga töödeldud hiirte SNpc-s võrreldes kontrollidega märkimisväärselt vähenenud, ja need mõjud paranesid Ka-ga töödeldud PD hiirtel (joonis 3i). Samamoodi suurendas MPTP / p ka mRNA ekspressioonitasemeid

NADPH oksüdaasi alaühikute, nagu Nox1, Nox2 ja Nox4, MPTP/p hiirte SNpc-s, mida Ka-töötlus veelgi nüristas (joonis 3j). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et Ka leevendab MPTP / p-indutseeritud LD akumulatsiooni, peroksüdatsiooni ja ROS-vahendatud stressi.

See artikkel on välja võetud sisuloenditest, mis on saadaval ajakirja ScienceDirect Redox Biology kodulehel: www.elsevier.com/locate/redox