Epigallokatehhiin{0}}gallaat soodustab sigade munarakkude IVF-i järel in vitro küpsemist ja embrüo arengut, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Eesmärk:Epigallokatehhiin-3-gallaat (EGCG) on katehhiinpolüfenoolide peamine koostisosa ja omab tugevate antioksüdantsete omaduste tõttu kaitsvat toimet. Meile teadaolevalt on EGCG mõju sigade munarakkude in vitro küpsemisele (IVM) ja in vitro viljastamisele (IVF) süstemaatilised uuringud endiselt puudulikud. Käesoleva uuringu eesmärk oli määrata EGCG mõju sea munarakkude IVM-ile ja IVF-ile.

Meetodid:Sigade ootsüüte töödeldi erineva kontsentratsiooniga EGCG-ga (5, 10 ja 20 uM) ning määrati kummulirakkude laienemine, munarakkude küpsemise kiirus, reaktiivsete hapnikuliikide (ROS), glutatiooni (GSH) ja malondialdehüüdi (MDA) tase ning antioksüdantide koguvõime. kindlaks määratud. Oksüdatiivse stressi ja apoptoosiga seotud geenide mRNA ekspressioonitasemed määrati kvantitatiivse reaalajas PCR abil. Samuti hinnati munarakkude lõhustamiskiirust ja blastotsüstide kiirust pärast 10 uM EGCG-ravi IVM-i ja IVF-i ajal. Tulemused: EGCG kontsentratsioonis 5, 10 ja 20 uM soodustas märkimisväärselt kummulirakkude laienemist ja EGCG 10 uM juures suurendas munarakkude küpsemise kiirust. EGCG (10 μM) ravi vähendas ROS ja MDA taset, suurendades samal ajal antioksüdantide võimet ja GSH kontsentratsiooni küpsetes munarakkudes. QRT-PCR tulemused näitasid, et EGCG-ravi reguleeris katalaasi, glutatioonperoksidaasi ja superoksiidi dismutaasi mRNA ekspressiooni küpsetes munarakkudes. Lisaks vähendas EGCG-ravi ka Baxi ja kaspaasi-3 mRNA ekspressioonitaset ning suurendas Bcl-2 mRNA ekspressioonitaset küpsetes munarakkudes. Lisaks oli IVM-i ja IVF-i ajal 10 uM EGCG-ga töödeldud munarakkude lõhustamis- ja blastotsüstide määr oluliselt kõrgem kui kontrollrühmal.

Järeldus:Meie tulemused näitavad, et EGCG soodustab sigade munarakkude IVF-i järel in vitro küpsemist ja embrüo arengut. EGCG kaitsev toime munarakkudele võib olla seotud selle antioksüdantsete ja apoptoosivastaste omadustega. Märksõnad: EGCG, sea munarakud, IVM, antioksüdant, anti-apoptoos, IVF

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Munarakkude in vitro küpsemine (IVM) on võtmeetapp kariloomade embrüote in vitro tootmisel.2 IVM-i munarakud on võimelised viljastuma ja arenema embrüoteks, samas kui IVM-i munarakkudest embrüo arenemise edukus on madalam kui in vivo küpsenud munarakkudest. Munarakkude küpsemine nõuab nii tsütoplasmaatilist kui ka tuuma küpsemist ning on oletatud, et vale tsütoplasmaatiline küpsemine aitab kaasa IVM munarakkude halvale arengupotentsiaalile. Varasemate uuringute põhjal on õige söötme koostis ja kultiveerimistingimused olulised munaraku IVM4 edukaks toimimiseks. Epigallokatehhiin-3-gallaat (EGCG) on rohelise tee üks peamisi bioaktiivseid ühendeid ja kuulub katehhiinpolüfenoolide hulka. tuntud oma rolli poolest siirdemetallide kelaatimisel ja seega oksüdatiivse stressi taseme vähendamisel.5 In vitro ja in vivo eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et EGCG-l on erinevad bioloogilised funktsioonid, sealhulgas kromosoomikahjustuste vältimine reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) poolt, antibakteriaalne toime, antibakteriaalne toime. -kasvaja aktiivsused ja lipogeneesi inhibeerimine.5 IVMoocytes näitasid Huang jt, et EGCG IVM söötmes võib vähendada ROS-i taset ja apoptoosi veise munarakkudes ning suurendada kummulirakkude laienemist. kraadi Roth jt näitasid, et antioksüdandi EGCG intraperitoneaalne süstimine parandab hiirte arengupädevust ja embrüote kvaliteeti, mis arenevad hüpertermiaga ravitud munarakkudest. Gadani jt näitasid, et EGCG lisamine sulatatud kuldi spermale parandas in vitro viljastamist (IVF).8 Kuid Bucci jt hiljutine uuring näitas, et EGCG lisamine sulatussöötmele ei parandanud koera sperma kvaliteeti ega tsooni sidumisvõimet. 10 Meile teadaolevalt ei ole veel süstemaatilisi uuringuid EGCG mõju kohta sea munarakkude IVM-ile ja IVF-ile. Seda, kas EGCG-d saab kasutada in vitro kultiveeritud sigade munarakkude tõhusa antioksüdandina, tuleb veel uurida. Süstemaatiliselt uuriti EGCG mõju sea munarakkude IVM-ile ja IVF-ile. Lisaks määrati in vitro analüüsidega ROS-i tase, antioksüdantide võime, antioksüdantide ja apoptoosiga seotud geeni mRNA ekspressioonitasemed munarakkudes.

Cistanche võib parandada immuunsust

Materjalide ja meetodite eetikaavaldus

Selle töö kiitis heaks Lõuna-Hiina põllumajandusülikooli loomkatsete eetikakomitee.

EGCG ravi

EGCG ühend osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) ja valmistati 1 mM põhikontsentratsioonina, kasutades M-199 söödet (Sigma-Aldrich). Et määrata EGCG mõju kummuli laienemisindeksile ja munarakkude in vitro küpsemiskiirusele ning munarakkude ROS-i tootmisele, EGCG erinevad kontsentratsioonid (0,5,10 ja 2{{ 16}} uM) lisati IVM söötmesse (M-199 sööde, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit, 10 protsenti sea folliikulite vedelikku, 0,57 mM tsüsteiini, 10 ng/mL epidermise kasvufaktorit, 10 IU/ml tiine mära seerumit gonadotropiini ja 10 IU/ml inimese kooriongonadotropiini). Et määrata EGCG mõju antioksüdantide koguvõimsusele, glutatiooni (GSH) sisaldusele, malondialdehüüdi (MDA) tasemele ja mRNA ekspressioonitasemele, lisati IVM söötmele EGCG (0 ja 10 uM). Et määrata EGCG mõju munarakkude arengupotentsiaalile, lisati IVM ja/või IVF või IVM ja/või IVC ajal EGCG (0 ja 10 μM).

Munarakkude kogumine ja in vitro küpsemine

Munasarjad saadi noorsigadelt, kes tapeti kohalikus tapamajas (Guangzhou Kongwangji Slaughterhouse, Guangzhou, Hiina) ja viidi 2 tunni jooksul laborisse 0,9% soolalahuses temperatuuril 37 kraadi. 3-8 mm antraalsetest folliikulite folliikulite vedelik aspireeriti süstlaga, millele oli kinnitatud 18-mõõturnõel. Nagu eelnevalt kirjeldatud, kultiveeriti ligikaudu 50 kummuli munaraku kompleksi (COC) 500 µl (IVM) söötmes, kaeti mineraalõliga ja kultiveeriti 44 tundi temperatuuril 38,5 °C 5% CO sisaldusega inkubaatoris niisutatud õhuga.

Cumuluse laienemise ja munarakkude IVM hindamine

Cumuluse laienemine registreeriti 44 tunni pärast IVM-i. Eelarvamuste kõrvaldamiseks tehti hindamine pimedaks. Iga COC kumulatsiooni laienemise astet hinnati vastavalt subjektiivsele punktisüsteemile skaalal 0-4, kus 0 näitab, et laienemine puudub, 1 näitab minimaalset täheldatavat laienemist, 2 näitab välise laienemist. kummuli rakukihid, 3 näitab kõigi kummulirakkude kihtide laienemist, välja arvatud koroona radiata ja 4 kõigi kummulirakkude kihtide laienemist.12 Keskmine punktisumma (0.0-4).{10} }) iga rühma jaoks arvutati igas korduses (4-6 kordust), et saada väärtus, mida nimetatakse kummuli laienemisindeksiks. Esimese polaarse keha ekstrusioon ootsüütides määrati valgusmikroskoobi all. Ootsüüdid liigitati järgmiselt: ebaküpsed (ei jõudnud metafaasi), küpsed (esitati metafaasi I plaati ja polaarkeha) ja ebanormaalsed (mis tahes kromosomaalsed aberratsioonid, nagu diploidne, ebanormaalne metafaas I, mitmesuunaline spindel ja kromosoomide dispersioon). Munarakkude küpsemise määr arvutati järgmiselt: uuritud küpsenud munarakkude arv / munarakkude koguarv x 100 protsenti.

ROS tasemete määramine

Intratsellulaarse ROS-i sisalduse määramiseks inkubeeriti 30 küpset munarakku 20 minutit 38,5 kraadi juures fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), mis sisaldas 10 µM 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaati fluorestsentssondis (Beyotime, Hiina) pimedas biotehnoloogias. . Seejärel pesti ootsüüte PBS-ga, millele oli lisatud 1 protsenti veise seerumi albumiini. Pildid jäädvustati konfokaalse mikroskoopiasüsteemiga (IX71, Olympus, Jaapan) samade skaneerimisseadetega rühmade vahel. Fluorestsentsi intensiivsus arvutati Image abil. J tarkvara.

Antioksüdantide kogumahu test

Kogu antioksüdantide mahtu ootsüütides analüüsiti, kasutades Total Antioxidant Capacity Assay komplekti ABTS meetodil (Beyotime, Peking, Hiina) vastavalt tootja protokollile. ABTS-test mõõdab proovi kogu antioksüdantide võimet ja põhineb ABTS· pluss radikaalsel värvimuutusel. Katioonne radikaal ABTS· plus on kromofoor, mis neelab lainepikkusel 734 nm ja mis tekib ABTS-i (2,2-asino-bis-(3-etüülbenstiasoliin{{7) oksüdatsioonireaktsioonil. }}ammooniumsulfonaat) kaaliumpersulfaadiga.13

GSH sisalduse kvantifitseerimine

GSH sisaldust mõõdeti Total Glutathione Assay Kit (S0053, Beyotime, Bejing, Hiina) abil vastavalt tootja juhistele. Selles komplektis kasutatakse bioloogiliste proovide glutatiooni (tGSH) üldsisalduse mõõtmiseks kineetilist ensümaatilist taaskasutusanalüüsi, mis põhineb GSH oksüdatsioonil 5,5'-ditiobis-(2-nitrobensoehappe) [DTNB] abil. Mikrotiiterplaadi süvenditesse lisatakse glutatiooni standardid või töödeldud proovid, seejärel DTNB ja glutatioonreduktaas. NADPH2 lisamine süvenditesse käivitab DTNB järkjärgulise redutseerimise GSH abil, põhjustades värvi suurenemist, mida jälgitakse 405 nm juures. Lühidalt öeldes külvati proovid 96-süvendiga plaatidele ja seejärel lisati igasse süvendisse 150 μL tuvastamislahust. Pärast proovide tasakaalustamist toatemperatuuril 5 minutit lisati 50 μ a-0,16 mg/mL NADPH lahust. GSH sisaldus määrati 5-tio{{{15 mõõdetud väärtuse jagamisel. }}nitrobensoehape iga proovi munarakkude arvu järgi.

Malondialdehüüdi (MDA) taseme kvantifitseerimine

MDA taset munarakkudes analüüsiti MDA analüüsikomplekti (Beyotime) abil vastavalt tootja protokollile. MDA reageerib tiobarbituurhappega (TBA), saades punase ühendi, mille maksimaalne neeldumine on 532 nm. TBA reaktiiv valmistati, segades 0,2 ml SDS-i (8,1 protsenti), 1,5 ml äädikhapet (20 protsenti, pH=3,5) ja 1,5 ml TBA-d (0,8 protsenti). kokku, seejärel segati 100 μL iga homogeniseeritud munaraku proovi selle 200 μL TBA reagendiga. Segu inkubeeriti keevas veevannis 15 minutit ja seejärel jahutati jääl. Pärast jahutamist tsentrifuugiti segu kiirusel 4000 p/min 10 minutit. Supernatandi neeldumine määrati 532 nm juures, võrreldes pimekatsega.

In vitro viljastamine ja embrüokultuur, IVF-katse viidi läbi nagu varem teatatud.14 Lühidalt, kohalikust tapamajast kogutud ootsüüte kultiveeriti 44 tundi ja denudeeriti 1 mg/ml hüaluronidaasi lahuses DPBS-is mehaanilise pipetiga; seejärel rühmitati 10-15 ootsüüdid ja kanti üle 50 μL TBM väetussöötmesse (113,1 mm NaCl, 3.0mM KCl, 7,5 mM CaCl22H2O,20 .0 mM Tris, 11.0 mM glükoosi, 5,0 mM naatriumpüruvaati), mis sisaldab 2,5 mM kofeiini ja 2 mg/ml BSA-d (fraktsioon V), kaetud mineraalõliga. Guangxi Yangxiang Company Co. Ltd. (Guangxi, Hiina) värsket spermat (umbes 12 kuu vanuselt Duroc sigadelt, kellel on mitu korda paljunemist) pesti kolm korda tsentrifuugimisega DPBS-ga, millele oli lisatud 0,1 protsenti BSA-d, kiirusel 1500 pööret minutis. 4 min. Spermatosoidi graanulid resuspendeeriti ja lahjendati TBM-iga 30 minutiks CO2 inkubaatoris mahutamiseks 1 × 10 kraadi sperma/ml. Seejärel lisati mahtuvuslikud spermatosoidid tilka sisaldavatele munarakkudele lõpliku spermakontsentratsiooniga 1 × 102 sperma/ml ja inkubeeriti 6 tundi 39 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris. Pärast viljastamist pesti ootsüüte 3 korda PZM3 söötmega ja kultiveeriti PZM3 söötmega temperatuuril 39 °C; 5% O2, 5% CO2 ja 90% N2; ja 100 protsenti niiskust. Embrüonaalset lõhustumist ja blastotsüstide moodustumist hinnati vastavalt 48 tundi ja 6 päeva pärast viljastamist. Valemid lõhustumise ja blastotsüstide määra hindamiseks olid järgmised: lõhustumise kiirus=lõhustumise arv/küpsenud munarakkude arv; blastotsüstide määr=blastotsüstide arv/küpsenud munarakkude arv.

Kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR) Kogu RNA ekstraheeriti laagerdunud munarakkudest, kasutades Trizol reagenti (Invitrogen, USA) ja kvantifitseeriti neeldumise mõõtmisega 260 nm juures. RNA pöördtranskribeeriti cDNA-ks, kasutades HiScript III-RT SuperMix komplekti (Vazyme, Nanjing, Hiina). Reaalajas PCR viidi läbi qTOWER³ termotsükleril (Analytik Jena Germany), kasutades ChamQrM Universal SYBR qPCR Master Mix komplekti (Vazyme). Tuvastatud geenide mRNA ekspressioonitasemed normaliseeriti GAPDH abil ja arvutati 2-△c meetodil. Praimerite järjestused on näidatud täiendavas tabelis S1.

Statistiline analüüs

Kogu andmete analüüs viidi läbi R Statistical Software (versioon 3.6.3) abil. Kõik andmed esitati kui keskmine ± standardhälve. Erinevate ravirühmade vahelisi olulisi erinevusi hinnati permutatsioonitestide abil. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

See artikkel on välja võetud artiklist See artikkel avaldati järgmises Dove Pressi ajakirjas: Drug Design, Development and Therapy