JAK-i inhibiitor blokeerib COVID{0}}tsütokiinide poolt indutseeritud JAK-STAT-APOL1 signaaliülekande glomerulaarrakkudes ja podotsütopaatia inimese neeru organoidides Ⅱ

Meie tulemused muudavad praegust interferoonist põhjustatud paradigmatAPOL{0}}nefropaatia. Sisse mitu näidetkõrge interferooni tase põhjustas kõrge riskiga kandjatel kollapseerivat glomerulopaatiatAPOL1genotüüpviis paradigmani, mis pidas interferoone peamisteks APOL-i{1}}vahendatud teise tabamuse käivitajateks.glomerulopaatia (31, 36, 37). Seda paradigmat tugevdas veelgi asjaolu, et interferoon alfa, beeta,ja gamma-indutseeritudAPOL1ekspressioon kultiveeritud podotsüütide ja endoteeli rakuliinides (22). Kuid,seda arhetüüpi seab kahtluse alla tähelepanek, et interferoonid ei ole alati kõrgenenud seerumispatsientidelCOVID{0}} nakkusja COVAN, samas kui teised tsütokiinid, sealhulgas IL-6, IL-1 ja IL-18suurendatakse (4, 17, 18). Käesolevas uuringus näitasime, et isegi interferoonide puudumiselneed mitteinterferooni tsütokiinid individuaalselt ja kollektiivselt indutseerisid tugevadAPOL1väljendus inimesespodotsüüdid ja GEC-d, tuues samal ajal esile ka varem hindamata sünergismi. Näidateset JAK-STAT signaalimine on nende kombineeritud tsütokiiniefektide keskne vahendaja, näitavad meie tulemusedusutav seletus selle kohta, kuidas COVID{0}} tsütokiinitorm juhibAPOL1väljendus ja kõrgekokkuvariseva glomerulopaatia esinemissagedus riskivariandiga patsientidelAPOL1jaCOVID-19infektsioon. Need leiud võivad avaldada mõju teisteleAPOL{0}}vahendatud nefropaatiad. 

Lisateabe saamiseks võtke meiega ühendust aadressil:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Tel/Whatsapp: +86 15292862950

Kuigi meie tulemused näitavad sedaCOVID{0}}indutseeritud tsütokiinidon indutseerimiseks piisavadAPOL1väljendusja põhjustada kaotustneeru mikroorganoidsed podotsüüdid, ei välista nad võimalust, et SAR-CoV-2 võib samuti otseselt nakatada neerurakke, nagu hiljuti teatati (38, 39). Kuid SARs-CoV-2inimese neerukoes on tõestatud ainult lahkamisproovides, mille puhul segaduskudede autolüüsi panust ei saanud välistada (3, 4, 15, 16). Enamik teateid neeru biopsiatestCOVAN-iga patsientidest ei ole õnnestunud SARs-CoV-2 viirust tuvastada, hoolimata tundlike meetodite kasutamisest (3, 4),sealhulgas kaks praeguse uuringu üheksast juhtumist, mida testiti immunohistokeemia ja insitu hübridisatsioon.

Näidates tsütokiinide poolt indutseeritud podotsütopaatiat, erines meie neerude mikroorgaaniline mudelhiljuti avaldatudneeru organoidAPOL{0}}vahendatud neeruhaiguse mudel Liu jt poolt, kesgenereeris mitte-Aafrika doonori CRISPR-i redigeeritud iPSC-dest neeruorganoidid, milles G0APOL1alleelid muudeti G1 alleelideks, kuid G0 geneetilisel taustal. Kuigi interferoon gamma-indutseeritudAPOL1ekspressiooni nende organoidides, ei põhjustanud see tsütotoksilisust (40). Tsütotoksilisuse puudumine nendesneeru organoidmudel võiks selgitada vähem toksilise geneetilise tausta, millel G1 mutatsioonidolid peale pandud. On teada, et tsütotoksilisusAPOL1haplotüüpi mõjutab selle geneetiline omadustaust (41). Theneeru mikroorganoidKäesolevas uuringus loodi redigeerimata iPSC-destAafrika ameeriklasest G1G2 genotüübi kandjast. Natiivse geneetilise haplotüübi säilitamine võibon aidanud kaasa APOL{0}}seotud tsütotoksilisusele, mida on täheldatud meie puhulneerude mikroorganoidid. 

Lisaks sellele, erinevalt ülesreguleeritud APOL1 valgu ekspressioonist, millest me siin teatame, on hiljutine uuringei leidnud vahetAPOL1mRNA tase ühe COVANiga patsiendi neerubiopsias võrreldesterved kontrollid (26). See lahkarvamus meie tulemustes võib olla seletatav mööduva olemusegaAPOL1mRNA valgu suhtes, eriti kui biopsiad saadi mitu nädalat pärast esialgsetCOVID{0}}-nakkuse diagnoosimine, kui COVID-19-indutseeritud tsütokiinitormi ägedad tagajärjed javastav mRNA ekspressiooniprofiil võib olla hajunud. On mõeldav, et mida kaugemal onCOVID{0}}indutseeritud tsütokiinitormi tõttu, seda nõrgemad on ägeda faasi reagendid allavoolutsütokiini retseptor muutuvad, sealhulgas fosforüülitud STAT valgud jaAPOL1mRNA. Meie tulemusedviitavad sellele, et indutseeritud APOL1 valk püsib kauemgiAPOL1mRNA ja fosforüülitud STAT-id.

Sellel uuringul on kolm peamist kliinilist mõju. Esiteks rõhutavad nad vajadust genotüpiseerida Black võiHispaanlastest isikutel on aktiivse või hiljutise COVID-i taustal leitud kollapseeriv glomerulopaatia-19infektsioon. Kui aganeeru biopsiaei ole teostatav ega võimalik,APOL1Musta võiHispaanlastest COVID{0}}nakatunud isikud, kellel on uus või süvenev proteinuuria ja AKI, on tõenäoliselt samutikõrge saagikus. Teiseks seetõttu, et mitmed COVID{0}}indutseeritud tsütokiinid aktiveerivad JAK-STATi üleliiaindutseerimise viisAPOL1ekspressioon, terapeutiline strateegia, mis põhineb selektiivsel eemaldamisel võiühegi tsütokiini inhibeerimine ei ole tõenäoliselt efektiivne COVANi ennetamisel või ravimisel. Praegubaritsitiniib on COVID-i raviks lubatud kasutada ainult erakorralise kasutusloa alusel{0}}vajavad täiendavat hapnikku. Seetõttu nõuab selle potentsiaal COVAN-i raviks tõsisteriti mustanahaliste ja hispaanlastest kõrge riskiga lennuettevõtjate puhulAPOL1genotüübid, kellel onCOVID{0}} nakkus. Lõpuks, tuginedes tõenditele, et interferooni puudulikkus on seotud raskete häiretegaCOVID-19 infektsiooni korral tehti ettepanek manustada COVID-19 raviks interferooni. JuuresSelle kirjutamise ajal, vastavalt ClinicalTrials.gov, kolmkümmend kuus interferooni kui ravi kliinilist uuringutCOVID{0}} on kas käimas või lõpetatud. Vastupidiselt nende kliiniliste uuringute põhjendustele on meieTulemuseks on ettevaatus interferoonide manustamise suhtes COVID{0}} nakkuse ravikskõrge riskigaAPOL1genotüüp, sest interferoonid võivad patogeense ekspressiooni ülesreguleeridaAPOL1sisseaneerud ja sade COVAN. 

Meie uuringul on mõned piirangud. Meie COVANi juhtumite seeria üheksa biopsiaga tõestatud kokkuvarisemistglomerulopaatia juhtumid on suhteliselt väikese valimi suurus ja võisid seost alahinnatakõrge riskiga genotüübi ja COVANi vahel või on olnud proovide võtmise nihkes. Logistiline väljakutseAktiivse COVID{0}} infektsiooniga patsientidelt neerubiopsiate võtmine akuutravi tingimustes piirabsagedusneeru biopsiadselles populatsioonis. Tõenäoliselt on selle põhjuseks sama tegurenamik selle uuringu biopsiatest tehti mitu nädalat kuni kuud pärast haiguse esmast diagnoosimistCOVID{0}} nakkus. Nakkuslikule vallandajale lähemal saadud neerubiopsiate analüüs võib andatäiendavaid teadmisi varajaste raku fenotüüpide kohta. Lisaks ei tuvasta praegune uuring, kesja millal ravida COVANi JAK-i inhibiitoritega. Vastused neile küsimustele ja määramineJAK-i inhibeerimise efektiivsus COVAN-i ravina on tulevaste uuringute keskmes.See töö toob esile kõrge riskiga seoseAPOL1genotüüp ja JAK-STAT-APOL1 rollsignaalimine COVANi arendamisel. Kuna meie arusaam COVID{0}} pandeemiast areneb,kiireloomuline vajadus on suurendada arstide ja rahvatervise teadlikkust neerutüsistustestCOVID-ist-19. Samuti on tungiv vajadus COVAN-ravi järele. Meie uuring pakub JAK-i kohta uusi andmeidinhibiitoreid kui tugevaid terapeutilisi kandidaate APOL{0}}seotud COVAN-i jaoks.

meetodid

Antikehad ja reaktiivid.

Kasutati primaarseid antikehi järgmiste valkude vastu: APOL1 küülikinimesevastane [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (lõppkontsentratsioon 0,05 ug/ml);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (lõppkontsentratsioon 0,95 ug/mL) vastavalt hiljutisele aruandele (42)];APOL1 hiire anti-inimese [Genentech, 4.17A5; Immunofluorestsents [IF] 1:2000 (lõppkontsentratsioon2,13 ug/ml)]; GAPDH hiire anti-inimese (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); Vinculiinhiire anti-inimese (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 hiir inimesevastane (Santa CruzBiotehnoloogia, sc373787; WB 1:300); WT1 küülik inimesevastane (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1hiire anti-inimese (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 küüliku anti-inimese(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 hiire anti-inimese (CST, 9139; WB 1:1000); FosforüülitudSTAT1 (Y701) küülik inimesevastane (CST, 9167; WB 1:1000); Fosforüülitud-STAT2 (Y690) küüliku antiinimene (CST, 88410; WB 1:1000); Fosforüülitud-STAT3 (Y705) küüliku anti-inimese (CST, 9145; WB)1:2000); PODXL kitse inimesevastane (R&D, AF1658; IF 1:500), E-kadheriini küülik inimesevastane (rakkSignalisatsioon, 3195S; IF 1:200), NEPH1 hiire anti-inimese (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Sekundaarneantikehad hõlmasid kitse küülikuvastast IgG-d, HRP-ga seotud antikeha (CST, 7074s; WB 1:1000); hobune antihiire IgG, HRP-seotud antikeha (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 konjugeeritud eesli antihiir (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 konjugeeritud eesli antikits (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) ja Alexa Fluor 405 konjugeeritud eeselküülikuvastane (Thermo Scientific, A48258; 1:000). qRT-PCR jaoks TaqMan Gene Expression Assayshõlmas APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) ja PECAM-1 (Hs00169777_m1).Neerude immunohistokeemia värvimine APOL1, sünaptopodiini ja CD31 jaoks. Alustades fikseeritud formaliinistparafiiniga manustatud neeru biopsia slaidid, antigeeni otsimine viidi läbi (EDTA lahus pH-ga 8.0)56 minutit 100 kraadi juures. Primaarsed antikehad APOL1 (5.17D12, Genentech), sünaptopodiini (Progen) vastuBiotechnik, 61094) ja CD31 (Cell Signaling, 3528s) kasutati 1:4000 juures (lõppkontsentratsioon 0,95ug/mL), vastavalt 1:100 ja 1:1600 60 minuti jooksul 36 kraadi juures. Kasutusvalmis HQ-konjugeeritudsekundaarseid küülikuvastaseid multimeere (760-4815) inkubeeriti 12 minutit 36 ​​kraadi juures. Seda järgitianti-HQ HRP lisamisega 12 minutiks. DAB-d (760-159) inkubeeriti 5 minutit toastemperatuuri. Koeosa värviti toatemperatuuril 4 minutit hematoksüliiniga (760-2021).Sinistamisreaktiivi (760-2037) lisati 4 minutiks toatemperatuuril.

Kultiveeritud rakkude tsütokiiniravi.

Primaarsed inimese glomerulaarsed endoteelirakud, primaarsed podotsüüdidsubkultuuritud inimese doonori neerudest ja organoidsetest pärinevaid podotsüüte töödeldi 50 ng/ml,20 ng/mL või 10 ng/ml järgmiste tsütokiinide kontsentratsioon: Rekombinantne inimese CXCL9(Biolegend, 578102); Rekombinantne inimese CXCL10 (Biolegend, 573502); Rekombinantne inimeneCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); interferoon (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeeta (Peprotech, 300-02BC); IFN gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alpha (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Tsütokiini standardiseeritud kontsentratsioon 50 ng/ml määrati eelmääratletud pretsedendi põhjalinimrakkude ravimeetodid tsütokiinišoki sündroomide hindamiseks COVID{0}} infektsiooni korral (17). Järeltegevuskatsetes kasutati kontsentratsioone 20 ng/ml ja 10 ng/mL. Järgnevad töötlused, sealhulgas organoidja organoidist tuletatud podotsüütide katsed viidi läbi, kasutades 10 ng/ml. JAK 1/2 inhibiitor,baritsitiniibi (INCB028050) (Selleckchem, S2851) kasutati lõppkontsentratsioonis 10 uMkatsed.

Primaarne inimese glomerulaarne endoteelirakkude kultuur. Külmutatudmadala riskiga (G0G0) esmase inimese varuglomerulaarsed endoteelirakud osteti ettevõttest Celprogen (36066-05), sulatati ja kultiveeriti inimestelglomerulaarse endoteeli primaarse rakukultuuri täielik sööde seerumiga, antibiootikumivaba (Celprogen,M36066-05SA) plaatidel, mis on kaetud patenteeritud rakuvälise maatriksiga (Celprogen, E36066-05-PD10 jaE36066-05-12Noh) niisutatud keskkonnas 37 kraadi ja 5% CO2. Rakud passeeriti, kasutades 1XTrüpsiin EDTA (Celprogen, T1509-014). Rakke kasutati katseteks lõikude 2 kuni 4 vahel.Rakud valideeriti qRT-PCR abil, mis näitas PECAM1 geeniekspressiooni rikastumist (endoteliaalrakkmarker, tuntud ka kui CD31).

Glomerulaarne isoleerimine doonori inimese neerude ja podotsüütide subkultuurist.Inimese doonori neer olihangitud National Disease Research Interchange'i (NDRI) kaudu. Doonori APOL1 genotüüp oliG0G1. Glomerulaarne isoleerimine viidi läbi sõelameetodil, mis oli kohandatud varasemast avaldamisest (43,44). Lühidalt, steriilses kapotis jääl töötades eemaldati neer esmalt kapslist ja lõigati sagitaalselt pooleks.. Medulla lõigati lahti, jättes ajukoore alles. Seejärel haki ajukoorja lasti järjestikku läbi roostevabast terasest sõela (suurused 425 µm, 250 µm) ja kogutikolmanda sõela (150 µm) peal, pestes sageli eeljahutatud fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS)1% BSA-ga (ilma kaltsiumi ja magneesiumita) (Endecotts, sõelad 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Glomeruli koguti, tsentrifuugiti ja resuspendeeriti 5 ml PBS-is. 10 µl proovivärviti NucBlue Live ReadyProbes reagendiga (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) ja visualiseeriti valgusmikroskoopia abil. Glomeruleid inkubeeriti seejärel seedimispuhvris[DMEM/F12, kumbki 1 mg/ml (kollagenaas I, IV ja V), DNAas I (50 U/mL või 50 µg/mL)] temperatuuril 37 kraadi1 tund ühe raku suspensiooni saamiseks (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 10% FBS-iga (R&D Systems,Seedimise peatamiseks lisati S10350H) ja proovi tsentrifuugiti 450 g minutis 4 kraadi juures.Eraldatud podotsüüdid subkultuuriti Advanced RPMI-s (Fischer Scientific, MT10040CV) 10% FBS-gaja 1% penitsilliini-streptomütsiini (Thermo Fisher Scientific, 15070063) vitronektiiniga kaetud plaatidel(StemCell Technologies, 07004) temperatuuril 37 kraadi ja 5% CO2. Subkultuuritud rakud olid nähtavad ~ 5 päeva pärast jaraviti pärast 2-nädalast kultuuri.

Valgu ekstraheerimine ja Western blotting.Kõiki kultiveerimisplaate ja proove hoiti 4 kraadi juures. Ühekihilinerakkudest lüüsiti ja koguti rakkude lüüsipuhvriga (Cell Signaling, 9803)miniproteaasi inhibiitor ja fosfataasi inhibiitor (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Proove töödeldi ultraheliga tasemel 4 10 sekundit, tsentrifuugiti kiirusel 12000 p/min x 5 min, supernatantkoguti uude Eppendorfi katsutisse ja valgu kontsentratsioon määrati BCA valgu testiga(Pierce, 23225). Valgulüsaadid lahjendati 4x LaemmLi proovipuhvriga 2-merkaptoetanooliga(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) ja kuumutati 95-100 kraadi juures 5 minutit. Valgulüsaadidseejärel eraldati Criterion TGX plekivabade geelidega (4-20%) ja kanti Bio-Rad Transi abil.Blot Turbo ülekandesüsteem. Ülekantud membraanid blokeeriti 1 tund 3% rasvavabas piimas Tris-puhverdatudsoolalahusega ja inkubeeriti spetsiifiliste primaarsete antikehadega öö läbi 4 kraadi juures. Järgmisel päeval päraststandardpesu, membraane inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsegaantikeha vähemalt 1 tund toatemperatuuril enne pildistamist Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging Systemigatootja juhiste järgi.

RNA ekstraheerimine ja qRT-PCR.RNA eraldati raku monokihist, kasutades RLT lüüsipuhvrit jaQiagen RNEasy Mini Kit (74106) vastavalt tootja juhistele. RNA transkribeeriti cDNA-ks kasutadesInvitrogen SuperScript IV pöördtranskriptaasi reaktiivid ja protokoll (Thermo Fisher, 18091050).qRT-PCR reaktsioonid viidi läbi rakendusega Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) ja geeniekspressiooni testid QuantStudio 6 Flex Systemiga(Thermo Fisher Scientific), kasutades ∆∆Ct meetod, mille võrdlusgeeniks on GAPDH.

Genotüpiseerimine.DNA ekstraheeriti FFPE koeplokkidest, kasutades QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen, 56404) vastavalt tootja protokollile. Genotüpiseerimine viidi läbi Applied Biosystemsi abilTaqmani alleelide eristamise testid G1 SNP (p.Ser342Gly) ja G2 polümorfismi jaoks(p.Asn388_Tyr389del), kasutades QuantStudio 6 Flex Systemi. Sellel analüüsil on 100% analüütiline spetsiifilisus jaanalüütiline tundlikkus (tuvastuspiir) 1.{1}}ng DNA tuvastamiseksAPOL1riskivariandid DNA-sekstraheeritakse perifeerse vere monotsüütidest. Analüüsid kinnitati varem, võrreldes tulemusiotsene sekveneerimine (Sangeri järjestus). Genotüpiseerimise kvaliteedikontrolli meetmed hõlmasid kasutamisttehnilised replikatsioonid, iga genotüübi positiivsete kontrollide ja negatiivsete kontrollide 100% sobivus.

G1G2 patsiendi iPSC neeru mikroorganoidi tuletamine.Neerude mikroorganoidid saadi vastavaltavaldatud protokoll (27), mõningate muudatustega. Lühidalt, indutseeritud inimese pluripotentsed tüvirakud (iPSC)eraldati üksikuteks rakkudeks, kasutades TrypLE Selecti, ja külvati vitronektiiniga kaetud plaatideleStemFlexi sööde (Thermo Fisher Scientific, A3349401) 10 uM Rho kinaasi inhibiitoriga (Tocris)Bioscience, 1254) tihedusega 11,000-14,000 rakku/cm2 ja kultiveeritakse niiskes keskkonnas kl37 kraadi ja 5% CO2. Seejärel viidi rakud üle TeSR-E6 söötmele (Stemcell Technologies, 05946)8 uM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) 4 päeva. Päeval 5 kuni 7 töödeldi rakke200 ng/ml FGF9, 1 ug/ml hepariini ja 1 uM CHIR99021. 7. päeval pesti rakke PBS-ga jadissotsieerunud TrypLE-ga. Seejärel pesti dissotsieerunud rakke tavalise DMEM-ga ja tsentrifuugiti temperatuuril300xg 5 minutit. Rakupellet resuspendeeriti Stage1 söötmes [TeSR-E6, mis sisaldab 200 ng/mlFGF9, 1 µg/ml hepariin, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA, 10 µM Rho kinaasi inhibiitor (Tocris Bioscience)]ja kanti 24-kaevu AggreWell 400 plaadile (Stemcell, 34411) ligikaudu 1,2 miljonirakud/kaev. Seejärel plaati tsentrifuugiti 100xg juures 3 minutit ja inkubeeriti 48 tundi 37 kraadi juures ja5% CO2 standardses rakukultuuri inkubaatoris. 48 tunni pärast (päev7+2) olid AggreWelli organoididkanti 6-süvendi madala kinnitusega plaadile koos Stage2 söötmega [TeSR-E6, mis sisaldab 200 ng/mL FGF9, 1µg/ml hepariin, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] rakuinkubaatoris orbitaalloksutil veel 72tundi. Alates päevast 7+5 värskendati kõiki organoide 3. etapi söötmega [TeSR-E6, mis sisaldab0,1% PVA] alternatiivsetel päevadel kuni katseteks kasutamiseni.

Podotsüüdi eraldamine mikroorganoididest.Glomerulite eraldamine neeru organoididest kohandati aeelnevalt kirjeldatud protokoll (45). Lühidalt iPSC-st pärinevate neeruorganoidide rühmad initsiaaligaalguslahtri number 1,2x106 iPSC-d eraldati inkubeerimise teel TrypLE selectiga (ThermoFisher) 5 minutit 37 kraadi juures. Iga 2-3 min järel segati õrnalt 1 ml pipetigadissotsiatsioon. Iga rühma kohta pandi üks 70 µm rakusõel (PluriSelect) 50 ml tuubi (Falcon)ja võrk hüdraaditi PBS-ga. Rakulahus lisati 1 ml pipetiga, võimaldades läbivoolulahusest raskusjõu mõjul. Kasutades 1 ml steriilse süstla kolvi, ülejäänud rakksõelale püütud lahus suruti õrnalt läbi võrgu. Kurn pesti sellegaPBS ja visati ära, hoides raku läbivoolu. Seejärel pipeteeriti rakkude läbivool eelnevalt hüdreeritud vedelikule40 µm rakusõel (Pluriselect) ja asetati värskesse 50 ml tuubi (Falcon), mis võimaldab üksikuid rakkevoolata läbi raskusjõu toimel ja pestes sõela põhjalikult PBS-ga, et eemaldada kõik järelejäänud üksikudrakud. Suurimad glomerulid koguti seejärel 40 µm rakusõelast, pöörates sõela ümber.värske 50 ml tuubi ja pesti PBS-iga kinnipüütud glomerulite välja loputamiseks. See protsess olikorratakse läbivooluga alates 40 µm protsessist, kasutades viimast 30 µm rakusõela (PluriSelect) kunikoguvad väiksemad glomerulid. IPSC-st saadud neeruorganoididest eraldatud glomeruleid kasvatativitronektiiniga kaetud plaadid täiustatud RPMI 1640-ga, mis sisaldavad 10% FBS-i standardses rakukultuurisinkubaatoris 37 kraadi pluss 5% CO2. Söödet värskendati igal teisel päeval, kuni rakke kasutatikatsed.

Immunofluorestsentsvärvimine, mikroorganoid.Neerude mikroorganoide pesti PBS-ga jafikseeritud 4% PFA-s PBS-is 30-45 min jääl. Seejärel pesti fikseeritud organoide kolm korda PBS-ga,ja inkubeeriti 30% sahharoosis PBS-is üle öö temperatuuril 4 °C. Organoidid manustati ÜMT-sse jaallutati 10 µm krüosektsioonile Laica krüostaadiga. Organoidseid krüosektsioone pesti kolm kordakorda PBS-ga ja seejärel blokeeriti blokeeriva puhvriga 1 (1% kalaželatiin, 2% eesli seerum, 0,3% TritonX-100 PBS-s) üks tund toatemperatuuril. Järgmisena inkubeeriti krüosektsioone primaarsegaantikehad blokeerimispuhvris 1 üleöö temperatuuril 4 kraadi. Krüosektsioone pesti kolm korda PBS-ga. Pärastpärast pesemist inkubeeriti krüosektsioone sekundaarsete antikehadega blokeerimispuhvris 1 2 tundi toastemperatuuri. Pärast viit pesemist PBS-ga paigaldati krüosektsioonid Prolong Glass pleekimisvastase vahendiga.paigalduslahus (Thermo Scientific, P36980). Fluorestseeruvad pildid genereeriti ECHO abilmikroskoop.

Immunofluorestsentsvärvimine, podotsüütide.Podotsüüdi kultuure pesti PBS-ga ja fikseeriti 4%PFA PBS-s 10-15 min toatemperatuuril. Pärast fikseerimist pesti rakke kolm korda PBS-gaja blokeeritud blokeerimispuhvris 2 (1% Fisher želatiin, 2% eesli seerum, 0,1% saponiin PBS-is) 30-60 jaoksmin. Rakke inkubeeriti primaarsete antikehadega blokeerimispuhvris 2 2 tundi toatemperatuuril(või üleöö 4 kraadi juures). Rakke pesti kolm korda blokeerimispuhvriga 2 ja inkubeeriti koossekundaarsed antikehad blokeerimispuhvris 2 1 tund toatemperatuuril. Pärast kolme pesu koosblokeeriv puhver 2 ja üks viimane pesu PBS-ga, paigaldati rakud Drop-n-Stain EverBrite'igapaigaldusvahend (Biotium, 23008). Fluorestseeruvad pildid jäädvustati ECHO mikroskoobiga.

Elujõulisuse testimine. Rakkude elujõulisuse ja ATP mõõtmiseks plaaditi organoididest pärinevad podotsüüdidvitronektiiniga kaetud 96-kaevuplaadile 100 uL söötmes (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) ja kultiveeriti Advanced RPMI+10%FBS+1%PS-s (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) niisutatud keskkonnas temperatuuril 37 kraadi ja 5% CO2. Organoididest saadudpodotsüüdid plaaditi samaaegselt 6-süvendiplaadile, mida kasutati RNA ekstraheerimiseks qPCR jaoks ja24-auguplaadile, mida kasutatakse immunohistokeemia (IHC) jaoks. Rakke töödeldi ~ 80% konfluentsusegakuue tingimusega [kontroll, IFNG (10 ng/mL), IFNG (10 ng/mL) + baritsitiniib (lõppkontsentratsioon 10 uM),Kõik tsütokiinid (10 ng/mL) ja kõik tsütokiinid (10 ng/ml) + baritsitiniib (lõppkontsentratsioon 10 uM)]. Meediamuudeti Q48 tundi ja rakke hinnati 96 tunni pärast. 96-kaevuplaati töödeldi Promega abilrakkude elujõulisuse ja ATP analüüsid, nagu allpool täiendavalt mainitud; 6-kaevuplaati töödeldi RNA jaoksekstraheerimine, cDNA süntees ja qRT-PCR; ja 24-kaevuplaat fikseeriti IHC jaoks 4% PFA-s. CellTiterFluorTMRakkude elujõulisuse test (Promega, G6080) ja CellTiter-Glo® 2.{1}} Analüüs (Promega, G9241) olidteostatakse tootja antud standardsete protokollijuhiste järgi. Analüüsid olid multipleksitudprotokolli järgi. Fluorestsents (mittelüütiline proteaasi test) ja luminestsents (lüütiline ATP test) olidmõõdeti SpectramaxM3 fluoromeetriga. Mõõtude erinevuse määras Student'ssidumata t-test.

Statistika.Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± SD. Andmete jaoks kasutati GraphPad Prism 8.3.1 tarkvaraanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5 kordaAPOL1transkriptsioon võrreldes söötmega töödeldud kontrolligaanalüüsiti olulisuse suhtes, kasutades paaritu t-testi Holm-Sidaki korrektsiooniga mitme jaoksvõrdlused. Esitatud P-väärtused on korrigeeritud p-väärtused. Tähendus määrati p<0.05.

Uuringu heakskiit. Selle uuringu kiitis heaks Duke'i ülikooli institutsionaalne ülevaatenõukogu (IRB),Põhja-Carolina. Patsiendi teadlikku nõusolekut IRB ei nõudnud, kuna selle juhtumi osauuring oli ainult kliinilise ja arhiveeritud patoloogilise materjali retrospektiivne ülevaade. Inimese neeru jaoksglomerulaarne isoleerimine ja podotsüütide subkultuur hangiti riikliku haiguste uurimise kauduVahetus (NDRI); see inimkoe uuring oli ka Duke'i IRB kaudu eelnevalt heaks kiidetud. NDRInõuab, et kõik kudede lähtekohad saaksid koedoonorilt või surrogaadilt teadliku nõusoleku.

Autori kaastöödSEN, GL, SD, KS ja DS tegid katseid ja redigeerisid käsikirju. AW ja DT esinesid jatõlgendas histopatoloogiat ja IHC-d ning redigeeris käsikirja. GH andis olulisi reaktiive ja redigeeriskäsikiri. SEN ja OAO kavandasid uuringu, analüüsisid ja tõlgendasid andmeid, kujundasid jooniseid jakirjutas ja toimetas käsikirja.

TänuavaldusedSeda tööd toetasid 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 ja Whitehead Scholar Award(OAO); Erivajadusi toetas Duke Nephrology T32 koolitustoetus (5T32DK007731-24). Me tänameSuzie kaalud (Genentech) APOL{0}}spetsiifiliste antikehade helde kingituse eest. Täname uurimistöödHistoloogialabor Duke BRPC-s ja Steven R. Colon PhotoPathis, Duke'i patoloogiaosakonnas.

Viited

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S jt. AKI COVID-iga haiglaravil olevatel patsientidel-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL jt. Äge neerukahjustus patsientidelCOVIDiga haiglasse viidud-19.Kidney Int.2020;98(1):209-18. 

3. May RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS jt. Mitmekeskuseline retrospektiiv kohortuuring määratleb 2019. aasta koroonaviiruse haiguse (COVID-19) neerupatoloogia spektri.Kidney Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M jt. AKI ja kokkuvarisemineGlomerulopaatia, mis on seotud COVID{0}} ja APOL 1 kõrge riskiga genotüübiga.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI jt. Ühendustrüpanolüütilised ApoL1 variandid neeruhaigusega afroameeriklastel.Teadus.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ ja Pollak MR. APOL1 nefropaatia: geneetikast kliiniliste rakendusteni.Clin J Am SocNephrol.2020. 

7. Friedman DJ ja Pollak MR. APOL1 ja neeruhaigus: geneetikast bioloogiani.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A jt. Missense mutatsioonid APOL1-sgeen on tugevalt seotud lõppstaadiumis neeruhaiguse riskiga, mis on varem omistatud MYH9 geenile.Hum Genet.2010;128(3):345-50. 

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SAAN 25% EHHINAKOOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIK ORGAANILINE KISTANŠEKSTRAKT NERENFEKTSIOONIDE PUHUL