Cistanche Tubulosa fenüületanoidglükosiidide häirimine MTT analüüsiga

1. Sissejuhatus

Parasiitne taimCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaeperekond) on laialt levinud Põhja-Aafrika, Araabia ja Aasia riikides [1]. See tulenebC. tubulosajaC. deserticolaon traditsioonilises hiina meditsiinis olulised, kuna neid on kasutatud impotentsuse, steriilsuse, lumbago ja käärsoole inertsist tingitud kõhukinnisuse raviks [2]. Lisaks etanooli ekstraktiC. tubulosaon näidatud, et sellel on hiirtel märkimisväärne kaitsev toime aju hüpoksia vastu [3].

Endoteelirakud mängivad hüpoksilise pulmonaalse hüpertensiooni patogeneesis otsustavat rolli. EA.hy926 endoteeli rakuliin on märkimisväärselt sarnane primaarsete endoteelirakkudega. Uurides C. tubulosa etanooliekstrakti hüpoksiavastast toimet EA.hy926 endoteelirakkudele, märkasime, et 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül){{7 }},5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) test, mida tavaliselt kasutatakse rakkude elujõulisuse hindamiseks tsütotoksilisuse ja tsütostaatilise aktiivsuse uuringutes, andis vastuolulisi tulemusi, näidates pärast töötlemist suurenenud EA.hy926 rakkude elujõulisust.

Rakkude elujõulisuse täpne hindamine on ravimi potentsiaalse tsütotoksilise või tsütoprotektiivse toime tuvastamiseks hädavajalik. Seetõttu uurisime, millised C. tubulosa etanooliekstraktis sisalduvad komponendid võivad olla vastutavad MTT testiga täheldatud vastuoluliste tulemuste eest. Eraldasime kaks peamistfenüületanoidglükosiidid (PhG-d)C. tubulosa etanooliekstraktist,ehhinakosiid (edaspidi ühend 1) ja akteosiid (edaspidi ühend 2). Määrasime nende mõju EA.hy926 rakkude elujõulisusele erinevate meetodite abil. Lisaks, et selgitada, milline ühendite 1 ja 2 asendaja võib olla vasturääkivate tulemuste põhjuseks, testisime EA-l nende aglükoone, kofeiinhapet (edaspidi ühend 3) ja 3, 4-dihüdroksülfenüületanooli (edaspidi ühend 4). .hy926 rakkude elujõulisus, kasutades samu meetodeid.

LOODUSLIK TUBULOOS APOPTOOSI INHIBERIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Ühendite identifitseerimine

Kahe ühendi struktuurid, mis on eraldatudC. tubulosa etanooliekstraktidentifitseeriti tuumamagnetresonantsi (NMR) ja massispektromeetria (MS) analüüsidega, nagu on näidatud joonisel 1. Ühend 1 identifitseeriti ehhinakosiidina, võrreldes eelnevalt teatatud NMR-ga (tabel 1) ja MS-ga (m/z 785 [M-H). ]− ) andmed [4]. Ühendi 2 NMR spektrid olid väga sarnased ühendi 1 omadega, välja arvatud -D-glükopüranosüülrühma puudumine (tabel 1). Ühend 2 (m/z 623 [M-H]-) identifitseeriti kuiakteosiid[5]. Oluline on see, et mõlemal ühendil on sama aglükoon, mis sisaldab kohvhapet (ühend 3) ja 3,4-dihüdroksülfenüületanooli (ühend 4).

2.2. Rakkude elujõulisuse analüüsid

Ühendite 1–4 mõju analüüsimiseks EA.hy926 rakkude elujõulisusele kasutati MTT ja CCK{{0}} teste. MTT test näitas, et EA.hy926 rakkude elujõulisus suurenes oluliselt pärast töötlemist 25 ja 5{62}} μM ühenditega 1, 2 või 3 (166,3% ja 174,1% ühendil 1, 205,8% ja 224,3% ühendil 2 ning vastavalt 164,8% ja 189,6% ühendil 3, p < 0,05) võrreldes kontrollrakkudega (joonis 2A). Veelgi enam, rakkude morfoloogiline kontroll näitas, et töötlemine 50 μM ühendiga 1, 2 või 3 suurendas purpursete formatsaani kristallide moodustumist, mis näitavad otseselt elusrakkude osakaalu (joonis 3). Vastupidi, CCK-8 test näitas, et rakkude elujõulisus vähenes oluliselt pärast töötlemist 12,5, 25 ja 50 µM ühendiga 1, 2 või 3 (75,5%, 45,1% ja 43,7% ühendi 1 puhul, 85,5%. 51,8% ja 34,3% ühendil 2 ning vastavalt 64,5%, 48,2% ja 36,4% vastavalt ühendil 3, p < 0,05, võrreldes kontrollrakkudega (joonis 2B). Ühend 4 ei mõjutanud rakkude elujõulisust ei MTT ega CCK-8 testis. Kahe testiga saadud tulemuste lahknevus viitab sellele, et üks kahest analüüsist ei pruugi täpselt kajastada ühendite 1 ja 2 mõju EA.hy926 rakkude elujõulisusele.

2.3. Hoechsti apoptoosi hindamine

Värvimine Hoechst 33342 on rakke läbilaskev DNA plekk, mis ergastab ultraviolettvalgust ja kiirgab sinist fluorestsentsi lainepikkusel 460–490 nm. Apoptootiliste rakkude kondenseerunud kromatiin värvub eredamalt kui normaalsete rakkude kromatiin [6]. Kui kontrollrakkudel oli ühtlaselt hajutatud kromatiin, normaalsed organellid ja terved rakumembraanid, siis 48 tundi 50 μM ühenditega 1, 2 või 3 inkubeeritud rakud näitasid apoptootiliste rakkude tüüpilist värvumist (joonis 4A). Seevastu rakkude kokkupuude 50 μM ühendiga 4 ei suurendanud apoptootiliste tuumade arvu võrreldes kontrollraviga.

2.4. Apoptootiliste rakkude voolutsütomeetriline analüüs

Anneksiin V-FITC/PI topeltvärvimise test identifitseerib apoptootilised rakud anneksiin V-FITC kõrge afiinsusega seondumise järgi fosfatidüülseriiniga, mis eksterniseeritakse apoptoosi läbivates rakkudes [7]. Selles testis ei seondu elujõulised rakud anneksiin V ega PI-ga ja seetõttu ei värvu (alumine vasak kvadrant), varajased apoptootilised rakud värvuvad roheliseks anneksiin V-FITC (alumine parem kvadrant) ja hilised apoptootilised rakud. värvuvad roheliseks ja punaseks anneksiin V-FITC seondumisel fosfatidüülseriiniga ja PI nekrootiliste rakkudega (ülemine parem kvadrant). Nagu on näidatud joonisel 4B, inkubeeriti rakke 50 µM ühenditega 1, 2 või 3 48 tundi, apoptootiliste rakkude protsent suurenes 3,74%-lt (kontrollrakud) vastavalt 10,32%-ni, 12,95%-ni ja 11,30%-ni. Võrreldes kontrollrakkudega ei suurendanud ühend 4 apoptootiliste EA.hy926 rakkude protsenti.

Kooskõlas CCK-8 testi ja Hoechst 33342 värvimisega saadud tulemustega näitas voolutsütomeetria test, et ühendid 1, 2 ja 3 indutseerisid EA.hy926 rakkudes apoptoosi. Kokkuvõttes viitavad need tähelepanekud sellele, et MTT testiga täheldatud EA.hy926 rakkude elujõulisuse suurenemine pärast töötlemist ühenditega 1–3 oli valepositiivne tulemus.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Arutelu

1983. aastal töötas Mosmann välja kolorimeetrilise MTT mikroplaadi analüüsi rakkude proliferatsiooni ja tsütotoksilisuse mõõtmiseks [8]. Seda lihtsat analüüsi ja selle modifikatsioone kasutatakse nüüd laialdaselt rakubioloogia laborites üle kogu maailma. Imetajate rakkude fraktsioneerimisuuringud näitasid, et redutseeritud püridiini nukleotiidi kofaktor NADH vastutab enamiku MTT vähenemise eest. Seda toetasid uuringud, milles kasutati terveid rakke [9]. Seetõttu seostatakse MTT vähenemist metaboolselt aktiivsete rakkudega ja mitte ainult mitokondriaalse hingamisega, vaid ka tsütoplasma ja mittemitokondriaalsete membraanidega, sealhulgas endosoomi/lüsosoomi sektsiooni ja plasmamembraaniga [10]. MTT molekuli positiivne netolaeng on selle raku omastamise peamine tegur plasmamembraani potentsiaali kaudu.

Eelkõige ei pruugi MTT test mõnikord täpselt kajastada tegelikku mõju, mida testitav ühend avaldab konkreetsetele rakkudele. Siiski ei ole tuvastatud keemilisi struktuure või rühmi, mis võivad MTT testis vastuolulisi tulemusi põhjustada. Hiljutised uuringud on näidanud, et MTT analüüs võib alahinnata (-)-epigallokatehhiin-3-gallaadi, rohelise tee enim leiduva polüfenooli [11] proliferatsioonivastast toimet. Uuringutes, milles kasutati kasvaja kemosensitiivsuse tuvastamiseks MTT testi, näitasid vähivastased kemoterapeutilised ained, nagu epirubitsiin, paklitakseel, dotsetakseel ja imatiniibmesülaat (Gleevec), rakkude elujõulisuse suurenemist [12,13]. Lisaks on mitmed uuringud teatanud, et teatud taimeekstraktid ja redoks-aktiivsed polüfenoolid võivad MTT testi häirida, kuna need vähendavad otseselt MTT tetrasooliumi soola rakkude puudumisel [14].

Vajadus solubiliseerida MTT formatsaani kristallid enne spektrofotomeetrilist analüüsi mikroplaadilugejas ja reaktsioonile omane lõpp-punkti iseloom piiravad MTT testi kasutamist teatud rakendustes. See viis tetrasooliumi analoogide väljatöötamiseni, milles fenüülrühmad olid kaunistatud negatiivselt laetud sulfonaatrühmadega, nagu 2,3-bis-(2-metoksü-4-nitro- 5- sulfofenüül)-2H-tetrasoolium-5-karboksaniliid (XTT), negatiivselt laetud sisesool [15] ja 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül) -5-(3-karboksümetoksüfenüül)-2-(4-sulfofenüül)-2H-tetrasoolium (MTS), nõrgalt happeline sisesool, mis on tihedalt seotud MTT-ga [16] . Nende modifikatsioonide tulemuseks oli söötmes lahustuvate formazaanide tootmine, mis välistas enne kvantifitseerimist solubiliseerimisetapi nõude. Vastavalt sellele, kuna nende molekulide suurenenud negatiivne laeng vähendas nende võimet liikuda läbi rakumembraanide [17], vahepealsed elektronaktseptorid (IEA), nagu 1-metoksü-5-metüülfenasiinmetüülsulfaat ({{25) }}metoksü PMS) olid vajalikud tetrasoolvärvi redutseerimise hõlbustamiseks või redutseerimise kiiruse suurendamiseks.

Hiljuti töötati välja uue põlvkonna vees lahustuvad tetrasooliumisoolad, mille prototüüp on WST-1 [18]. WST-1, negatiivse laenguga disulfoonitud sisesool, mis sisaldab joodijääki, on stabiilsem kui XTT ja MTS 1-metoksü PMS juuresolekul, see on kohustuslik IEA. See viis WST{5}}/1-metoksü-PMS-i turustamiseni mugava ühe reagendi rakuproliferatsioonikomplektina. WST-seerias on välja töötatud mitmeid teisi tetrasooliumisooli, millest kõige kasulikum on võib-olla WST-8 [19]. Tundub, et WST-8-l on väga sarnased rakkude arvu vähendamise omadused WST{10}}-ga ja seda turustatakse iseseisvalt CCK-8-testina. WST-8 on rakku mitteläbilaskev ja seetõttu redutseeritakse rakuväliselt elektronide transpordi kaudu rakusisesest NADH-st WST-sse -8 läbi plasmamembraani, mida vahendab 1-metoksü-PMS. Kuigi nii MTT kui ka WST{15}}/1-metoksü-PMS-i vähendamist juhib rakusisene NADH, näib NADH allikas nende kahe meetodi puhul erinevat. WST-8/1-metoksü PMS-i vähendamine sõltub rohkem malaadi/aspartaadi süstikust, mis seob mitokondriaalse trikarboksüülhappe tsükli-NADH ekstramitokondriaalse ruumiga [20].

Esialgsetes katsetes kinnitasime, et ühendid 1, 2, 3 ja 4 ei suutnud MTT tetrasooliumisoola otseselt redutseerida (pole näidatud). Käesolevas uuringus kõrvaldati ühendite endi otsene mõju reagendile, pestes mikroplaate hoolikalt fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) enne MTT või CCK-8 lahuse lisamist, nagu on näidatud tootja protokollides. Sellegipoolest olid kahe meetodi abil saadud tulemused endiselt vastuolulised (joonis 2). Ootuspäraselt suurendas rakkude inkubeerimine ühenditega 1, 2 ja 3 tetrasooliumisoola redutseerumist lillaks formasaaniks võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3), mis viitab sellele, et tetrasooliumisoola redutseerimine konkreetse ühendi juuresolekul ei ole piisav, et hinnata ühendi võimet mõjutada MTT testi.

Et teha kindlaks, kas ühendid 1, 2, 3 ja 4 võivad indutseerida EA.hy926 rakkudes apoptoosi, hinnati raku morfoloogilisi muutusi ja fosfatidüülseriini eksternaliseerumist. Kooskõlas CCK-8 testiga täheldatud rakkude elujõulisuse vähenemisega näitasid Hoechsti värvimise ja voolutsütomeetria analüüsi tulemused anneksiin V-FITC/PI abil, et pärast ühenditega 1, 2 ja 3 töötlemist täheldatud kasvu pärssimine oli vähemalt osaliselt tingitud EA.hy926 raku apoptoosist. Meie tulemused toetasid ka ideed, et nii ühendites 1 kui ka 2 esinev kofeüülrühm oli vastutav MTT testiga saadud vastuoluliste tulemuste eest.

Sarnaselt meie leidudele ei näidanud Rottlerin, võimas suure juhtivusega kaaliumikanali avaja, MTT suhtes in vitro reaktsiooni. Kuid see suurendas tugevalt formazaani kristallide moodustumist rakkudes, mis oli ilmselges vastuolus Rottlerini NF-κB inhibeerimise ja rakkude proliferatsiooniga, mida täheldati [3H]-tümidiini DNA-sse inkorporeerimise analüüsil [21]. Mehhanism, mille abil Rottlerin suurendas MTT vähenemist, omistati selle mitokondriaalsele lahtisidumise efektile [22]. Rottlerinil on kanemoüülhappe asendusrühm. Võrreldes kanemoüülhappega on ühendil 3 veel kaks hüdroksüüljääki, mis asuvad C-3 ja C-4. Seetõttu oletame, et mehhanism, mille abil ühendid 1 ja 2 põhjustavad MTT testis vastuolulisi tulemusi, võib olla seotud ka nende mitokondriaalse lahtisidumise mõjuga. Selle hüpoteesi kontrollimiseks on vaja ühendite 1 ja 2 võrdlevaid uuringuid ning keemilist lahtisidurit, nagu trifluorokarbonüültsüaniidfenüülhüdrasoon (FCCP).

 LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Eksperimentaalne osa

3.1. Reaktiivid ja kemikaalid

Ühend 3 (kohvhape-pulber, puhtus=98,6%) osteti ettevõttelt Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina). Ühend 4 (3, 4-dihüdroksülfenüületanool-õli, puhtus=98,5%) saadi ettevõttest Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina). MTT ja dimetüülsulfoksiid (DMSO) saadi firmast Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). CCK{11}} test osteti ettevõttest Dojin Laboratories (Kumamoto, Jaapan). Hoechst 33342 ja anneksiin V-FITC/PI apoptoosi tuvastamise komplektid osteti Beyotime'i biotehnoloogia instituudist (Haimen, Hiina).

3.2. Taimne materjal

C. tubulosavarred koguti Hiinast Xinjiangi Uiguuri autonoomsest piirkonnast Yutiani prefektuurist. Voucheri näidised deponeeriti Kolmanda sõjaväemeditsiini ülikooli (Chongqing, Hiina) kõrgmäestiku meditsiini võtmelaboratooriumis ja nende autentsuse kinnitas Yi Zhang Chengdu traditsioonilise hiina meditsiini ülikoolist (Chengdu, Hiina).

3.3. Taimse materjali ekstraheerimine ja eraldamine

Õhukuivatatud C. tubulosa (0,6 kg) varred pulbristati ja ekstraheeriti 50% etanooliga 2 tundi 70 kraadi juures. Pärast lahusti eemaldamist alandatud rõhul lahustati etanooliekstrakt (212,5 g) ja suspendeeriti vees (2 I) ja ekstraheeriti n-butanooliga (2 L x 3). Butanooli ekstrakt (110 g) kromatografeeriti polüamiidkolonnis ja elueeriti etanooli/veega (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), saades viis fraktsiooni (A-E) . Fraktsioon B (65 g) fraktsioneeriti ODS kolonnis; elueerimine etanool:vesi (1:9) eraldas ühendi 1 (3 g). Fraktsioon D (10,5 g) fraktsioneeriti ODS kolonnis; elueerides etanooli/veega (1:4), eraldati ühend 2 (1 g).

NMR spektrid registreeriti Bruker Avance 600 spektromeetriga CD3OD-s, kasutades sisestandardina tetrametüülsilaani (TMS). Massispektrid viidi läbi BioTOF-Q massispektromeetriga.

3.4. Rakukultuur

EA.hy926 rakuliinid saadi Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (Manassas, VA, USA). Rakke kultiveeriti RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 10% (maht/maht) veise loote seerumit ja 1% (maht/maht) penitsilliini-streptomütsiini, niisutatud keskkonnas 5% CO2-ga 37 kraadi juures.

3.5. Rakkude elujõulisus

Rakkude elujõulisust hinnati MTT ja CCK{{0}} testide abil. Ühendid 1 ja 2 ning nende aglükoonid, kohvhape (3) ja 3, 4-dihüdroksülfenüületanool (4) lahustati DMSO-s kuni DMSO lõppkontsentratsioonini < 0,1% (maht/maht) söötmes.

EA.hy926 rakud külvati 96-süvendiga plaatidele tihedusega 4 × 103 rakku süvendi kohta. Pärast 24-tunnist inkubeerimist töödeldi rakke 24 tundi 6,25–50 μM ühendiga 1, 2, 3 või 4. Kultuurisööde eemaldati ja rakke pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Igasse süvendisse, mis sisaldas 100 µl söödet, lisati alikvoodid (10 μL) MTT põhilahust (5 mg · ml-1) ja inkubeeriti rakkudega 4 tundi. Pärast inkubeerimist sööde eemaldati ja formasaani kristallide lahustamiseks lisati igasse süvendisse 150 µl DMSO alikvoodid. Neeldumist mõõdeti 490 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Rakkude elujõulisust väljendati MTT vähenemise protsendina, määrates 100% väärtuse kontrollrakkude neeldumisele. Kõik katsed viidi läbi kolm korda ja esitati kui keskmine ± standardhälve (SD).

CCK-8 test viidi läbi, järgides kirjandust väikeste muudatustega [23]. Täpsemalt töödeldi rakke 6,25–50 µM ühenditega 1, 2, 3 või 4 24 tundi ja pesti kaks korda PBS-iga, enne kui lisati 10 µl CCK-8 lahust ja 100 µL söötme. Pärast mikroplaadi inkubeerimist 37 kraadi juures 2 tundi, mõõdeti neeldumist lainepikkusel 450 nm, kasutades mikroplaadilugejat. Rakkude elujõulisust väljendati elujõuliste rakkude protsendina kontrollrakkude suhtes (100%). Kõik katsed viidi läbi kolm korda ja väljendati keskmisena ± SD.

3.6. Apoptoosi hindamine Hoechst 33342 värvimisega

Apoptootilisi morfoloogilisi muutusi täheldati Hoechst 33342 värvimisega. Lühidalt, EA.hy926 rakud külvati 48-süvendiga plaatidele (2 × 104 rakku süvendi kohta) ja töödeldi 50 µM ühendiga 1, 2, 3 või 4 48 tundi 37 kraadi juures, pesti kaks korda PBS-ga. ja fikseeriti 4% (maht/maht) paraformaldehüüdiga 15 minutit toatemperatuuril. Pärast kahekordset loputamist PBS-ga värviti rakke Hoechst 33342-ga (10 ug·mL-1) 5 minutit toatemperatuuril ja pesti kaks korda PBS-iga. Hoechstiga värvitud tuumad visualiseeriti fluorestsentsmikroskoobi abil (Olympus, Tokyo, Jaapan).

3.7. Apoptoosi analüüs voolutsütomeetria abil

Apoptootilised rakud tuvastati anneksiin V-FITC/PI topeltvärvimise ja voolutsütomeetria analüüsiga. Lühidalt, pärast 48-tunnist töötlemist 50 µM ühendiga 1, 2, 3 või 4 rakud koguti ja resuspendeeriti PBS-is 1 × 105 rakku · ml-1. Pärast tsentrifuugimist 500 × g juures 5 minutit 25 kraadi juures lisati 195 μL anneksiin V-FITC sidumispuhvrit ja 5 μL anneksiin V-FITC. Pärast õrna keerisega segamist inkubeeriti segu 10 minutit toatemperatuuril pimedas. Pärast tsentrifuugimist 500 × g juures 5 minutit 25 kraadi juures lisati 190 μl FITC-konjugeeritud anneksiin V sidumispuhvrit ja 10 μL PI. Pärast õrna keerisega segamist analüüsiti proove FACSCaliburi voolutsütomeetriga (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 30 minuti jooksul.

3.8. Statistiline analüüs

Kõik katseandmed väljendati keskmisena ± SD. Katseproovide ja vastava kontrolli vaheliste erinevuste olulisust hinnati ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades SPSS tarkvara (versioon 11.5). Statistiline olulisus määrati p < 0,05.

4. Järeldused

Meie tulemused viitavad sellele, et MTT testis täheldatud elujõuliste rakkude arvu ülehindamine võib varjata teatud ühendite tsütotoksilisust. Seetõttu soovitame ravimite sõelumisprotsesside ajal kasutada erinevaid meetodeid, et määrata kindlaks konkreetse ühendi mõju rakkude elujõulisusele (nt CCK-8 ja 3 H-TdR testid), et vältida eksitavate tulemuste loomist.

LOODUSLIK TUBULOOS TESTOSTEROONI SEKRETSIOONI EDENDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%