Madin-Darby veise neeru (MDBK) rakkude in vitro nakatamine Eimeria Acervulina sporozoiitidega: parasiitide rakkude invasiooni ja replikatsiooni kvantitatiivne analüüs, kasutades reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR)
Mar 17, 2022
Abstraktne
Kodulindude koktsidioos põhjustab loomakasvatusele märkimisväärset majanduslikku kahju. Selle haiguse eest vastutavad Eimeria parasiidid. Maailma mastaabis on E. acervulina ja E. tenella üks levinumaid Eimeria spp. nakatavad broilerid. E. tenellat kasutatakse tavaliselt infektsioonimudelina in vivo ja in vitro uuringutes. Teisest küljest on E. acervulinat in vitro tingimustes vähe uuritud. Väljakujunenud ja laialdaselt kasutatav E. tenella nakkuse in vitro mudel on Madin Darby veisneerudrakuliin (MDBK); MDBK rakkude sobivuse kohta E. acervulina peremeesrakkudeks on siiski vähe teada. Nakatasime MDBK monokihte kahe erineva E. acervulina sporosoiitide annusega, 5 × 104 ja 2 × 105, ning hindasime kultuure 24 ja 96 tundi pärast nakatumist (hpi). Võrdluseks viisime läbi identse infektsioonianalüüsi, kasutades E. tenella sporozoite. Parasiitide paljunemise hindamiseks kvantifitseeriti E. acervulina SCAR markeri ja E. tenella ITS-1 geeni DNA koopiate arv reaalajas kvantitatiivse PCR abil. Leidsime, et E. acervulina koopiate arv suurenes oluliselt 24 hpi juures võrreldes E. tenellaga (p<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">
Märksõnad:Koktsidioos; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Linnuliha; MDBK rakud; Neer
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Sissejuhatus
Koktsidioos on linnukasvatuses majanduslikult oluline haigus (Blake et al. 2020). Haigust põhjustavad Eimeria perekonna apicomplexan parasiidid. Nakatumine toimub sporuleerunud ootsüstide suukaudse allaneelamise kaudu. Peremeesorganismi sattudes vabastavad ootsüstid sporosoite, mis tungivad sooleepiteelirakkudesse. Peremeesrakkude sees läbivad sporosoidid aseksuaalse ja seksuaalse paljunemise tsüklit. Seeläbi tekivad ootsüstid ja erituvad need väljaheitega. Nakatunud loomadel võib esineda kaalulangus, kõhulahtisus, vähene munatoodang ja haigus võib mõnel juhul lõppeda surmaga (López-Osorio et al 2020). Seitse Eimeria liiki (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox ja E. tenella) põhjustavad kogu maailmas lindude koktsidioosi. Ootsüstide morfoloogia, patoloogia ja haiguse raskusaste on nende liikide puhul tavalised eristavad tegurid. Kõigist seitsmest eimeriast on broilerifarmides enim levinud E. acervulina, E. tenella ja E. maxima (Jordan et al 2018; Moraes jt 2015; Györke jt 2013). Nendest kolmest liigist peetakse E. tenellat kõrge patogeensusega, samas kui E. acervulina ja E. maxima on mõõduka patogeensusega (López-Osorio et al. 2020). Vaatamata patogeensuse erinevustele, on mõõduka patogeensusega Eimeria spp. nagu E. acervulina, võib kaasinfektsiooni ajal suurendada haiguse tõsidust (Hiob et al. 2017). Loommudelid on nakkusuuringute väärtuslik element. Koktsidiaparasiitide in vitro uuringud võivad aga aidata kaasa haiguse algtaseme mõistmisele rakutasandil (Marugán-Hernández jt 2020, Bussite jt 2018, Thabet jt 2017). Lisaks võivad need olla kasulikud vahendid tulevaste ravimeetodite lähteandmete saamiseks (Thabet et al. 2017; Khalafalla jt 2011). Tänu oma võimele kasvada mittelindude rakuliinides (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet jt 2017), on E. tenellat laialdaselt kasutatud mudelorganismina in vitro uuringutes (Marugán-Hernández jt 2020). Thabet jt 2019, 2017; Khalafalla jt 2011) ja märkimisväärseid jõupingutusi on tehtud E. tenella in vitro ja in vivo uuringutele, sealhulgas molekulaarsete lähenemisviiside, nagu reaalajas kvantitatiivne PCR (RT-qPCR) kasutamine. (Marugán-Hernández jt 2020; Thabet jt 2019, 2017; Hiob jt 2017; Raj jt 2013). Teiste Eimeria liikide, sealhulgas E. acervulina puhul on tehtud vähem jõupingutusi (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki jt 1974; Strout et al. 1965; Hiob jt 2017). Selle uuringu eesmärk oli hinnata E. acervulina sporosoiitide in vitro invasiooni ja replikatsiooni MDBK rakkude monokihtides, kasutades reaalajas kvantitatiivset PCR-i.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
materjalid ja meetodid
E. acervulina ja E. tenella ootsüstide läbimine OotsüstidE. acervulina ja E. tenella bakterid eraldati tervetel 11-päevastel tibudel Eckerti jt. modifitseeritud meetodil. (1995). Sporuleerunud ootsüstid koguti ja säilitati kuni edasise kasutamiseni 4% kaaliumdikromaadi lahuses 4 kraadi juures.Ootsüstide puhastamine ja ekstsüsteerimineMõlema Eimeria liigi ootsüstid puhastati 4-protsendilisest kaaliumdikromaadi lahusest. Seejärel ergutati sporosoite ja puhastati vastavalt modifitseeritud meetodile, mida on kirjeldanud Rentería-Solís et al. (2020).RakukultuurMadin-Darby veisneerudInfektsioonimudelina kasutati (MDBK) monokihte (DSMZ, Braunschweig, Saksamaa). MDBK rakud külvati (2 × 105 rakku süvendi kohta) 24-süvendiga plaatidele Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmega (DMEM), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS), 100 IU penitsilliini, 100 ug/ml streptomütsiini ja 2,5 ug/ml amfoteritsiini ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris, kuni saavutati 80% konfluentsus.MDBK rakkude nakatamine Eimeria sporozoiitidegaKonfluentsed MDBK monokihid inokuleeriti E. acervulina sporozoididega. Esialgsed uuringud viidi läbi selleks, et valida infektsiooni doos, mis põhines erinevatel infektsioonide (MOI) määradel (parasiit:rakk): {{0}}.25, 0.5, 1.{101} {9}}, 1.5 ja 5.0 (Taha et al. avaldamata andmed). Infektsiooniks valiti kaks eraldi annust: 5 × 104 (MOI: 0,25) või 2 × 105 sporosoiiti süvendi kohta (MOI: 0,5). Infektsiooniga kokku puutunud kultuure inkubeeriti seejärel 41 kraadi juures DMEM söötmes, mis sisaldas 2% FBS-i, 100 RÜ penitsilliini, 100 ug/ml streptomütsiini ja 2,5 ug/ml amfoteritsiini. Rakendati kaks erinevat inkubatsiooniaega: 24 h pärast nakatumist (hpi) ja 96 hpi. E. tenella sporosoitide puhul viidi läbi identne infektsioonidooside ja inkubatsiooniaegade komplekt. Kõik katsed hõlmasid ühte negatiivset kontrolli, mis koosnes nakatamata MDBK monokihtidest (NC-nakatamata rakud). Kõik analüüsid viidi läbi kolmes korduses. 24 hpi pärast pesti rakke kolm korda steriilse PBS-ga (pH 7,2) ja 96 hpi rühmale lisati uus sööde, samas kui 24 hpi kultuurid lõpetati. Monokihid trüpsiiniti iga inkubatsiooniperioodi lõpus (vastavalt 24 hpi või 96 hpi).
DNA ekstraheerimine ja reaalajas kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (RT-qPCR)DNA ekstraheeriti trüpsiiniga töödeldud rakkudest, kasutades DNeasy Blood & Tissue komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt tootja protokollile. RT-qPCR viidi läbi, et kvantifitseerida E. acervulina järjestuse iseloomustatud amplifitseeritud piirkonna (SCAR) markeri Ac-R01-1731 ja E. tenella ribosomaalse DNA (ITS-1) sisemise transkribeeritud speisseri 1 koopiad. parasiitide replikatsiooni korrelatsioon. RT-qPCR analüüsid viidi läbi vastavalt Blake et al. kirjeldatud meetoditele. (2008) ja Kawahara jt. (2008) vastavalt mõningate muudatustega. Lühidalt, 20 µl mahuga reaktsioon sisaldas 10 µl SYBR Green® põhisegu (Thermo Scientific, Dreieich, Saksamaa), 500 nM päri- ja tagurpidi praimereid (tabel 1), 2 µl DNA matriitsi ja 7 µl nukleaasivaba vett. Igale analüüsile lisati nukleaasivabast veest koosnev mittematriitsiline kontroll (NTC). RT qPCR reaktsioone amplifitseeriti kolmes korduses ja viidi läbi Bio-Rad CFX Connect reaalajas PCR tuvastamissüsteemis (Bio-Rad, Feldkirchen, Saksamaa). RT-qPCR tingimused olid 95 kraadi 5 minutit, millele järgnes 40 95 kraadi tsüklit 30 sekundit. Lõõmutamine viidi läbi 59,8 kraadi ja 58 kraadi juures 20 sekundi jooksul E. acervulina ja E. tenella puhul, millele järgnes üks pikendustsükkel 20 sekundit 72 kraadi juures. Dissotsiatsioonikõvera loomiseks rakendati sulamiskõvera programmi, mis hõlmas temperatuurivahemikku 60 kuni 95 kraadi. Lõpuks genereeriti E. acervulina ja E. tenella standardkõverad vastavalt genoomse DNA jadalahjendusega ja kloonitud ITS-1 geenifragmentide seerialahjendusega (vastavalt Thabet et al. 2015).
Statistiline analüüs
D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism 9 tarkvaras (San Diego, CA, USA).
Tulemused ja arutlus
E. acervulina SCAR-markeri ja E. tenella ITS-1 geeni geenikoopiaid amplifitseeriti ja tuvastati RT-qPCR abil igas reaktsioonis. Pärast 24 hpi inkubatsiooniperioodi oli pärast 5 × 104 sporosoidi annuse manustamist tuvastatud koopiate arv oluliselt suurem (p=0,0002) E. acervulina (1,88 × 105±5,56 × 104 ) puhul kui E. tenella (3,60× 104±5,37× 103 ) puhul (joonis 1). Samamoodi saadi E. acervulina (4,82×105±8,50×104) puhul oluliselt suurem (p=0.0002) koopiate arv kui E. tenella puhul (1,27×105±9,32×103) pärast 24 hpi. 2×105 sporosoitide pealekandmine (joon. 1). Seevastu 96 hpi pärast nakatumist 5 × 104 sporosoidiga oli koopiate arv E. acervulinaga nakatunud kultuurides oluliselt (p=0,0044) madalam (6,96 × 103 ± 3,87 × 103) võrreldes E-ga. tenella (1,24 × 105 ± 1,01 × 105). Samuti põhjustas suurem annus 2 × 105 sporosoidi, mida inkubeeriti ühekihiliste kihtidega pikema perioodi jooksul 96 hpi, oluliselt (p{58}},0044) väiksemad kogused E. acervulina koopiaid (3,35 × 104±1,53 × 104 ). võrdlus E. tenellaga (4,98× 105±1,28× 105 ) (joonis 1).
Testisime E. acervulina võimet tungida MDBK monokihtidesse ja seejärel paljuneda üle 24 ja 96 hpi. Varasemad katsed hinnata E. acervulina kultuuri on tehtud erinevate tulemustega. Strout et al. (1965) nakatanud erinevat primaarset (kana embrüoneerudja fibroblastid) ja püsivad rakuliinid (hiire fibroblastid, HeLa rakud). Strout et al. (1965) teatasid äratuntavast rakuinfektsioonist 24 hpi juures kõigis rakuliinides. Huvitaval kombel ei täheldanud nad üheski testitud rakumudelis (Strout et al. 1965) parasiitide kasvu perioodidel, mis ületasid 24 hpi, mis on kooskõlas meie tähelepanekutega geenide arvu vähenemise kohta.
koopiad 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) teatas E. acervulina kasvust kanadelneerudrakud kuni 93 hpi ja täheldati ootsüstide moodustumist pärast merozoiitide inokuleerimist. Kuid meile teadaolevalt ei leidnud hilisemad publikatsioonid neid leide kinnitust E. acervulina sporozoididega nakatunud MDBK monokihtide kohta on avaldatud ainult üks artikkel (Talebi 2001). Lühidalt, autor eksponeeris eelnevalt hüperimmuunse kana või küüliku antiseerumiga töödeldud MDBK rakke E. acervulina sporosoididele 24 hpi. Kultuurid värviti ja intratsellulaarsed sporosoidid loendati mikroskoopiliselt. Kahjuks on uuringus esitatud ainult parasiitide inhibeerimise protsent antiseerumi poolt (Talebi 2001) ja seega ei saa selles mudelis hõlpsasti teha järeldusi nakkuse tõhususe kohta. Meile teadaolevalt ei ole teatatud edasistest katsetest kasutada MDBK rakke E. acervulina nakkusmudelitena. Vastavalt Strouti et al. (1965) täheldasime parasiitide paljunemise tippu 24 hpi juures ja selget langust, mida hiljem esindas madal koopiate arv 96 hpi juures. Strout et al. (1965) ja Naciri-Bontemps (1976) esitasid kvalitatiivsed andmed, mis pärinesid ainult mikroskoopia analüüsist. RT-qPCR on aga täpsem ja tundlikum vahend parasiitide paljunemise hindamiseks. Tegelikult kasutatakse RT-qPCR-i tänapäeval sageli kvantitatiivseks hindamiseks ja see on edukalt loodud koktsiidide paljunemise hindamiseks (nt Marugán-Hernández jt 2020, Rentería Solís jt 2020, Thabet jt 2019, Bussiere jt 2018, Hiob jt 2017, Thabet jt 2017, Raj jt 2013, Khalafalla jt 2011)
Siiski võib elektronmikroskoopia anda väärtuslikke andmeid E. acervulina rakusisese arengu analüüsiks MDBK rakkudes. Seetõttu tuleks seda kaaluda E. acervulina edasistes in vitro uuringutes. Teoreetiliselt oleksid kana Eimeria in vitro nakkusmudelina eelistatavad linnurakuliinid, kuna need pärinevad looduslikust peremeesorganismist ja võivad anda parema ülevaate parasiidi ja peremehe vastastikmõjudest kui imetajatest pärinevad rakukultuurid. Enamik kodulindude koktsidioosi uurimiseks sobivatest kanarakukultuuridest on siiski primaarsed (Bussiere et al. 2018, Strout jt 1965; Naciri-Bontemps 1976). Primaarsetel rakkudel on püsikultuuridega võrreldes mitmeid piiranguid. Üks on üldine vajadus värske loomse koe järele laboratoorsete katsete alustamiseks, mis võib olla seotud saastumise ohuga (Verma et al. 2020). Veelgi enam, primaarsete rakkude saamiseks tuleb loomi ohverdada, mis on vastuolus eetiliste kaalutlustega. Lõpuks võib primaarsete rakuliinide standardimine olla seotud raskustega.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Seetõttu on immortaliseeritud rakuliinide kasutamine enamikus lindude koktsiidide in vitro kultiveerimisega tegelevates uurimisrühmades üldine tava. Üldiselt valitakse imetajatest pärinevad püsikultuurid, kuna need on kaubanduslikest allikatest kergesti kättesaadavad ja luuakse vahendid, nagu antikehad, markerid, avaldatud protokollid, genoomsed järjestused jne, samas kui harvemini kasutatavate kanarakuliinide puhul see alati nii ei ole. . MDBK rakud on veistelt saadud püsiliin, mida kasutatakse paljude rakenduste in vitro mudelina. MDBK rakud on E. tenella in vitro uuringute jaoks hästi välja kujunenud (Marugán-Hernández jt 2020, Rentería-Solís jt 2020, Thabet jt 2019, Bussiere jt 2018, Thabet jt 2017, Khalafalla et al. al. 2011). Marugán-Hernández jt. (2020) kirjeldas näiteks E. tenella rakusisest arengut MDBK rakkudes. Selles uuringus jälgisid autorid RT-qPCR ja pöördtranskriptaasi reaalajas PCR abil rakkude jagunemist ja E. tenella transgeensete tüvede arengut.
Meie eesmärk oli kvantifitseerida E. acervulina paljunemine MDBK rakkudes PCR-tehnoloogia abil. Meie praeguste teadmiste kohaselt pole selliseid andmeid varem avaldatud. Morfoloogilist analüüsi meie katses ei arvestatud. Siiski on korduvalt (Marugán-Hernández jt 2020, Thabet jt 2017 ja Raj jt 2013) näidatud, et geenikoopiate arvu suurenemine on tegelikult seotud paljunemisega merogoonia ajal. Areng väljaspool seda aseksuaalse paljunemise faasi on meie katses antud tingimustes üsna ebatõenäoline. Leidsime, et võrreldes E. tenellaga tungivad E. acervulina sporosoidid rakku ja paljunevad esimese 24 hpi jooksul kiiremini. Kuid geenikoopiate arv langeb märkimisväärselt 96 hpi võrra, mis näitab parasiitide paljunemise dünaamikat E. acervulina puhul, mis erineb selgelt E. tenella omast. Seega näib tõenäoline, et erinevad Eimeria liigid käituvad in vitro kultuuris erinevalt ja et E. tenella kui ainsa väljakujunenud mudelorganismi kohta tehtud üldisi järeldusi tuleks teha ettevaatlikult. Rohkemate ajapunktide lisamine võib olla abiks in vitro paljundamise dünaamika üksikasjalikumaks hindamiseks. Selle perioodi jooksul toimuva selgitamiseks ja selle kohta, kas nendest tulemustest saab tuletada praktilisi rakendusi tulevaste ravimeetodite jaoks, saab rakendada täiendavaid meetodeid.
Sellegipoolest oleme näidanud parasiitide sissetungi edu selles rakuliinis. Seetõttu võiks MDBK rakke edasi kasutada nakkusmudelitena E. acervulina sporozoidi rakkude invasiooni korral. Samuti on soovitatav kasutada RT-qPCR-i ja muid tundlikke tööriistu. Veelgi olulisem on see, et see rakuliin toetab ka E. tenella infektsiooni. Seda võib tõlkida mõlema Eimeria liigi võrdlusuuringuteks. Tuleks teha täiendavaid üksikasjalikke kvantitatiivseid ja kvalitatiivseid analüüse, et hinnata MDBK kultuuri sobivust in vitro maatriksiks E. acervulina ja teiste kanade Eimeria liikide arengufaaside jaoks. abi; Samuti oleme tänulikud M. Fritschele, B. Schneidewindile ja R. Schumacherile (Leipzigi ülikooli parasitoloogia instituut) suurepärase abi eest loomapidajana. Suur tänu ka R. Zhangile (Looma- ja Veterinaarteaduste Kolledž, Southwest Minzu Ülikool) väärtusliku abi eest laboritöödel. Autorid soovivad tänada ka R. Schmäschket (Leipzigi ülikooli parasitoloogia instituut) väärtusliku töö eest loomalubade koostamisel.
