Looduslike polüfenoolantioksüdantide fotoreaktiivsuse ja fototoksilisuse in vitro hindamine

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem teada saada.

Abstraktne:Polüfenoolid on suur looduslike ühendite perekond, mida kasutatakse laialdaselt kosmeetikatoodetes tänu nende antioksüdantsetele ja põletikuvastastele kasulikele omadustele ning võimele ära hoida UV-kiirguse poolt põhjustatud oksüdatiivset stressi. Kuna need ühendid sisaldavad kromofoore ja neid kantakse otse nahale, võivad nad reageerida päikesevalgusega ja avaldada fototoksilist toimet. Olemasolev teaduslik teave nende looduslike ühendite fototoksilise potentsiaali kohta on napp ja seetõttu oli selle uuringu eesmärk hinnata viie fenoolhappe fotoreaktiivsust ja fototoksilisust.antioksüdandiddokumenteeritud kasutamine kosmeetikatoodetes. Standardne ROS-analüüs valideeriti ja rakendati looduslike fenoolsete antioksüdantide kohvhappe, feruulhappe, p-kumaarhappe, 3,4-dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC) ja rutiini fotoreaktiivsuse skriinimiseks. Fototoksilisuse potentsiaal määrati inimese keratinotsüütide rakuliini (HaCaT) abil, mis põhineb fototoksilisuse 3T3 Neutral Red Uptake fototoksilisuse testil. Kuigi kõikuuris fenoolseid antioksüdanteneeldunud UV/Vis kiirgust vahemikus 290–700 nm, suutis ainult DOPAC genereerida singletthapnikku. Reaktiivsete hapnikuliikide teke on fototoksilisuse mehhanismi osana varajases staadiumis keemiline reaktsioon. Siiski ei vähendanud ükski uuritud ühenditest keratinotsüütide elujõulisust pärast kiiritamist, mis viis järeldusele, et neil ei ole fototoksilist potentsiaali. Selle tööga saadud andmed viitavad sellele, et need ühendid on kosmeetikatoodetesse lisatuna ohutud.

Märksõnad:fotode ohutus; fotoreaktiivsus; fototoksilisus; polüfenoolid;looduslikud fenoolsed antioksüdandid; reaktiivsed hapniku liigid; keratinotsüüdid; nahahooldus; kosmeetikatooted

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus 

Polüfenoolid (PP-d) moodustavad ühe arvukamatest ja laialdasemalt levinud loodustoodete rühmadest taimeriigis. PP keemilist struktuuri iseloomustab ühe või mitme fenoolse hüdroksüülrühma olemasolu, mis on seotud ühe või mitme benseenitsüklisüsteemiga [1]. Polüfenoolidel on inimestele mitmesuguseid kasulikke bioloogilisi toimeid, sealhulgas viirusevastane, antibakteriaalne, kantserogeenne, hepatoprotektiivne, põletikuvastane ja antioksüdantne toime [2–5].Antioksüdantidena, võivad polüfenoolid kaitsta raku koostisosi reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) oksüdatiivsete kahjustavate mõjude eest, nagu üksikud hapniku-, superoksiidi- ja hüdroksüülradikaalid, piirates mitmete oksüdatiivse stressiga seotud haiguste riski [6,7]. Tänu oma keemilistele omadustele on PP-d võimelised eemaldama ROS-i ja kelaadima siirdemetalliioone, nagu raud ja vask, mis on äratanud kosmeetikatööstuses huvi nende kasutamise vastu nahahoolduspreparaatides [8–10]. Ultraviolettkiirgus (UV) on üks peamisi nahavähki esilekutsuvaid tegureid ja naharakke võib kahjustada otseselt UV-kiirgus või kaudselt UV-vahendatud ROS-i ületootmine [11]. Eksperimentaalsed ja epidemioloogilised uuringud on näidanud, et polüfenoolid kaitsevad nahka UV-kiirguse kahjulike mõjude eest mitmel viisil [12]. Seetõttu kasutatakse mitmeid sellesse perekonda kuuluvaid ühendeid juba mitmete turul saadaolevate kaubanduslike kosmeetikatoodete koostisosadena [13]. Tarbijate suurenenud nõudlus looduskosmeetika järele kutsus tööstust välja töötama preparaate, mis sisaldavad paljulubava ja tõhusa nahahoolduse lahendusena toimeaineid, näiteks polüfenoole, sisaldavaid looduslikke ekstrakte [13]. Polüfenoolide struktuuris esinevad kromofoorid on aga võimelised absorbeerima UV/Vis-kiirgust ja läbima keemilisi reaktsioone, mille tulemuseks on sündmuste kaskaadi, mis võib põhjustada fototoksilisi reaktsioone [14]. Fototoksilisus on defineeritud kui toksiline reaktsioon, mille põhjustavad paikselt või süsteemselt manustatud fotoreaktiivsed kemikaalid pärast keha kokkupuudet keskkonnavalgusega [15]. Aktiivsed farmatseutilised koostisosad ja abiained süsteemseks manustamiseks, paikseks manustamiseks mõeldud kliinilised preparaadid, nahaplaastrid ja muud omavad fototoksilist potentsiaali ja võivad põhjustada märkimisväärseid fototoksilisi reaktsioone. Järelikult annavad reguleerivad asutused, USA FDA, EU EMA ja ICH fotode ohutusjuhised, tutvustades katsemeetodeid ja hindamisstrateegiaid [15–17]. Kosmeetikatoodete ohutuse hindamine on Euroopa Liidu õigusaktide kohaselt kohustuslik [18]. Nõutav ohutushinnang hõlmab kosmeetikatoodete koostisosade asjakohaseid toksikoloogilisi uuringuid, sealhulgas fotoga indutseeritud toksilisuse hindamist [18]. Kuna kosmeetikatoodete loomkatsed on keelatud, on viimastel aastatel välja pakutud mitmeid in vitro fotoohutuse katseid, sealhulgas UV-spektri analüüs, 3T3 neutraalse punase omastamise fototoksilisuse test (3T3 NRU PT) ja reaktiivsed hapniku liigid ( ROS) analüüs [18–20]. ROS test oli mõeldud ravimite fotoreaktiivsuse hindamiseks, mille põhimõte on jälgida fotokeemilisi reaktsioone uuritavates kemikaalides, mis on eksponeeritud simuleeritud päikesevalgusele [19,20]. Nende fotokeemiliste reaktsioonide kaudu saab tekitada ROS-i, nagu superoksiidi anioon ja singletthapnik, ning need fotokeemilised protsessid võivad olla ravimite põhjustatud fototoksilisuse vallandajaks [19, 20]. ROS-i kõrge tase võib põhjustada tsütotoksilisust DNA, lipiidide ja valkude kahjustuse tõttu oksüdatiivse stressi tõttu.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlIn vitro metoodikas 3T3 NRU-PT kasutab tsütotoksilisuse lõpp-punktina hiire fibroblastide rakuliini Balb/c 3T3 ja neutraalse punase omastamist. Fototoksilisus määratakse seejärel uuritava kemikaaliga kokku puutunud rakkude elujõulisuse suhtelise vähenemise järgi päikesevalgust simuleeriva valguse juuresolekul või puudumisel. Kirjanduses avaldatud uuringutes jõuti järeldusele, et see test on liiga tundlik, ennustades ekslikult loomade ja inimeste fotode ohutuse riske, mis toob kaasa suure arvu valepositiivseid tulemusi võrreldes in vivo tulemustega [21–23]. Arvestades seda piirangut, pakkus meie rühm välja 3T3 NRU-PT metoodika modifikatsiooni, mis põhineb inimese keratinotsüütide rakuliini (HaCaT) kasutamisel [24]. Kuna see metoodika kasutab inimese keratinotsüütide rakke, esindab see realistlikumat mudelit, arvestades, et need on kõige levinumad rakutüübid naha väliskihis, kus kasutatakse paikseid ühendeid ja eksponeeritakse päikesevalguse kiirgusele [24]. Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata looduslike polüfenoolide p-kumaarhappe, kofeiinhappe, 3-4-dihüdroksüfenüüläädikhappe (DOPAC), feruulhappe ja rutiini fotoindutseeritud toksilisuse potentsiaali (joonis 1). mida juba kasutatakse kosmeetikatoodete koostisosadena või kaalutakse nende huvitavate keemiliste ja antioksüdantsete omaduste tõttu [25–27]. Ühendite uurimuslikuks fotoohutuse hindamiseks valideeriti ja rakendati ROS-test ning nende tsütotoksilisust ja fototoksilisust hinnati täiendavalt inimese keratinotsüütide rakuliini (HaCaT) abil.

2. Tulemused ja arutelu 

Fotoreaktiivse potentsiaali hindamisel tuleb algselt kaaluda, kas ühend neelab footoneid mis tahes lainepikkusel vahemikus 290–700 nm. Ühendit, mille molaarne ekstinktsioonikoefitsient (MEC) on suurem kui 1000 l mol-1 cm-1 mis tahes lainepikkusel vahemikus 290–700 nm, loetakse piisavalt fotoreaktiivseks, et tekitada otsest fototoksilisust [15]. Kohv-, p-kumaar- ja feruulhapete, DOPAC-i ja rutiini neeldumisspektrid DMSO-s UV-nähtava valguse käes on näidatud joonisel 2. Kõik ühendid neelduvad spektrivahemikus 200–700 nm, maksimaalse lainepikkusega või üle 290 nm ja MEC-ga tavaliselt suurem kui 4000 L mol-1 cm-1 (tabel 1). Polüfenoolid on bioloogilised ühendid, mis sisaldavad π konjugeeritud süsteeme fenoolsete hüdroksüülrühmadega. π-tüüpi molekulaarorbitaalide elektroonilised üleminekud vastutavad selle ühendirühma UV-nähtava spektri eest [28]

Kõigi testitud ühendite MEC oli suurem kui 1000 L mol-1 cm-1, mis tähendab, et kõik on võimalikud fototoksilised ühendid, mida tasub uurida [15]. Enne ROS-testi läbiviimist hinnati päikesesimulaatorit ja katsetingimusi optimeeriti tagamaks, et üksiku hapniku (SO) ja superoksiidi aniooni (SA) mõõdetud väärtused oleksid lähedased kirjanduses mainitutele [29]. ROS-i genereerimise testi optimeerimine viidi läbi positiivsete ja negatiivsete kontrollide abil ning teostatavusuuring viidi läbi võrdluskemikaalide abil. Kasutatud katsetingimustes vastasid kõik teostatavusuuringus testitud ained aktsepteerimiskriteeriumidele, mis andsid SO ja SA väärtused lubatud väärtuste vahemikes [29].

ROS-analüüs viidi läbi polüfenoolsete ühendite jaoks ja testitud ainete võime tekitada ROS-i kontsentratsioonil 200 uM on näidatud tabelis 2. Tabel 2. Tulemused saadi testitud ühendite kohta ROS-testi abil.

Saadud tulemused näitavad, et kõik ühendid, välja arvatud DOPAC, võib klassifitseerida mittefotoreaktiivseteks. Kuigi need ained näitasid UV-nähtava valguse neeldumist ja MEC üle 1000 L mol−1 cm−1, ei tekitanud nad testitud tingimustes ROS-i, ei SO ega SA liike. Üllataval kombel suutis DOPAC indutseerida SO liikide teket ja seetõttu klassifitseeriti see fotoreaktiivseks, hoolimata sellest, et sellel ühendil oli kõigi uuritud ühendite hulgas madalaim MEC väärtus UV-nähtavas vahemikus. DOPAC-i kohta saadud tulemuste mõistmiseks on vaja rohkem uuringuid, mis võivad samuti lähitulevikus olla olulised, et luua seos ühendi keemilise struktuuri ja selle võime vahel olla fotoreaktiivne. Hinnati DMSO tsütotoksilisust, mida kasutati fototoksiliste mõjude hindamiseks kiiritamise juuresolekul ja ilma, pärast 1-tunnist kokkupuudet. Kiiritamata plaadi puhul ei näidanud DMSO statistiliselt olulist erinevust negatiivsete kontrollidega võrreldes. Kuid kiiritatud plaadi puhul oli 1-protsendilise DMSO ja lahustikontrolli vahel märkimisväärne erinevus võrreldes negatiivsete kontrollidega (p < 0,0001),="" mis="" õigustas="" lahustikontrolli="" kasutamist="" kõigis="" katsetes,="" et="" tagada="" rakkude="" elujõulisuse="" erinevused.="" omistati="" ainult="" uuritavatele="" ühenditele.="" inimese="" keratinotsüütide="" rakuliini="" (hacat)="" kasutava="" fototoksilisuse="" analüüsi="" teostatavuse="" tagamiseks="" testiti="" positiivsete="" kontrollidena="" 5-metoksüpsoraleeni,="" kloorpromasiinvesinikkloriidi="" ja="" kiniini="" ning="" negatiivsete="" kontrollidena="" atsetüülsalitsüülhapet,="" heksaklorofeeni="" ja="" naatriumlaurüülsulfaati.="" [24].="" fototoksilisuse="" analüüsi="" tulemused,="" milles="" võrreldakse="" kiiritatud="" ja="" kiiritamata="" hacat="" rakkude="" elujõulisust="" testitud="" (polü)fenoolsete="" ühendite="" juuresolekul,="" on="" kujutatud="" joonisel="" 3.="" nende="" juuresolekul="" testitud="" kemikaalide="" kontsentratsioonide="" vahemikud="" (irr="" plus="" )="" ja="" valguse="" puudumine="" (irr−)="" määrati="" doosivahemiku="" leidmise="" katsetes,="" võttes="" arvesse="" maksimaalset="" kontsentratsiooni="" 1000="" µm.="" kasutati="" geomeetrilist="" lahjendusseeriat="" ja="" kohandati="" seda="" vajaduse="" korral="" kontsentratsiooni-vastuse="" funktsioonina="" kiirituse="" juuresolekul="" ja="" puudumisel.="" testitud="" kontsentratsioonivahemikus="" (12,5;="" 31,25;="" 62,5;="" 125;="" 250;="" 500="" ja="" 1000="" µm)="" ei="" põhjustanud="" ükski="" uuritav="" aine="" rakkude="" elujõulisuse="" 50="" protsenti,="" mistõttu="" ei="" olnud="" võimalik="" arvutada="" vastavaid="" ic50="" ja="" pif="" väärtusi.="" .="" vastupidi,="" katsetatud="" ainete="" juuresolekul="" oli="" võimalik="" tajuda="" kiiritatud="" rakkude="" elujõulisuse="" annusest="" sõltuvat="" suurenemist,="" mis="" võib="" olla="" tingitud="" nende="" antioksüdantide="" fotoprotektiivsest="" toimest="" kiirgusest="" põhjustatud="" oksüdatiivsete="" kahjustuste="" vastu,="" mis="" põhjustab="" suurema="" protsendi.="" elujõuliste="" rakkude="" arv="" võrreldes="" kontrollrühmaga="" (töötlemata="" kiiritatud="" rakud).="" kirjanduses="" on="" kirjeldatud,="" et="" uv-kiirgus="" põhjustab="" ros-i="" teket,="" lämmastikoksiidi="" ületootmist="" ja="" antioksüdantide="" kaitsevõime="" vähenemist="" keratinotsüütides="" [30].="" nendel="" põhjustel="" on="" antioksüdantse="" võimega="" polüfenoole="" uuritud="" fotoprotektiivsete="" ainetena.="" kuigi="" enamik="" uuringuid="" keskendus="" polüfenoolide="" fotokaitsevõimele,="" ei="" uuritud="" nende="" fototoksilist="" potentsiaali.="" varasemad="" uuringud="" kinnitasid="" kohv-,="" feruliin-="" ja="" p-kumaarhapete="" võimet="" eemaldada="" ros-i="" ja="" reaktiivseid="" lämmastikuliike="" (rns).="" lisaks="" loodi="" nende="" kolme="" fenoolühendi="" puhul="" kaitse="" uv-kiirguse="" kahjulike="" mõjude="" eest="" ka="" in="" vivo="" või="" naharakkudes="" [31–34].="" need="" andmed="" võivad="" seletada="" elujõuliste="" rakkude="" protsendi="" suurenemist,="" kui="" neid="" kiiritatakse="" uuritavate="" ühendite="" juuresolekul.="" rutiin,="" nagu="" ka="" kohv-,="" feruuliin-="" ja="" p-kumaarhape,="" osutus="" ros-i="" genereerimise="" testis="" negatiivseks="" ja="" ei="" kutsunud="" esile="" fototoksilisust="" hacat="" rakuliinis.="" kirjanduses="" on="" rutiini="" fototoksilise="" potentsiaali="" kohta="" vastuolulist="" teavet,="" millest="" tuleneb="" saadud="" tulemuste="" huvi.="" fototoksilise="" potentsiaali="" hindamine="" keratinotsüütide="" rakusüsteemi="" (hacat)="" abil="" näitas,="" et="" rutiin="" näitas="" fototoksilisust="" [35].="" vastupidi,="" kasutades="" eksperimentaalset="" seadet,="" mis="" kasutab="" elektrokeemilise="" ja="" uv-detektoriga="" kapillaarelektroforeesi,="" et="" testida="" taimeekstraktide="" ja="" -komponentide="" fototoksilisust="" hapnikutarbimise="" ja="" reaktiivsete="" hapnikuliikide="" tekitamise="" osas="" nähtava="" valgusega="" kiiritamisel,="" võis="" järeldada,="" et="" rutiin="" oli="" ei="" ole="" fototoksiline="" [36],="" mis="" oli="" kooskõlas="" selle="" töö="" tulemustega,="" kus="" rutiin="" ei="" näidanud="" fotoreaktiivsust,="" kuna="" see="" ei="" tekitanud="" ros-i="" genereerimise="" testis="" ei="" so-d="" ega="" sa-d.="" teisest="" küljest="" näidati="" selles="" töös="" ka,="" et="" rutiin="" iseenesest="" ei="" oma="" hacat="" rakuliinis="" fototoksilist="" potentsiaali.="" need="" vastuolulised="" leiud="" rõhutavad="" standardiseeritud="" katsetingimuste="" kasutamise="" ja="" ka="" sobiva="" valgusallika="" kasutamise="" tähtsust,="" et="" vältida="" eksitavaid="" tulemusi.="" huvitav="" on="" see,="" et="" vaatamata="" dopac-i="" ja="" teiste="" uuritud="" pp-de="" struktuursele="" sarnasusele,="" tekitas="" dopac="" ros-i="" genereerimise="" testis="" so-d="" ja="" klassifitseeriti="" fotoreaktiivseks.="" kui="" aga="" testiti="" hacat="" rakuliinis,="" näitas="" dopac="" mitte="" fototoksilist="" toimet.="" saadud="" tulemuste="" põhjal="" näib,="" et="" dopac="" on="" fotoreaktiivne,="" kuid="" mitte="" fototoksiline,="" seega="" ei="" eeldata,="" et="" pärast="" selle="" ühendi="" paikset="" manustamist="" tekiks="" fototoksilisi="">

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Reaktiivid

3,4-Dihüdroksüfenüüläädikhape (DOPAC), kohvhape, trans-feruulhape, p-kumaarhape, rutiin, kloorpromasiinvesinikkloriid, dinaatriumvesinikfosfaatdodekahüdraat, naatriumfosfaadi monohüdraat, neutraalpunane (NR) ja dimetüülsulfoksiid (DMSO) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Madrid, Hispaania). Kiniinvesinikkloriid, bensokaiin, diklofenak ja erütromütsiin osteti firmalt Acofarma (Madrid, Hispaania). Immortaliseeritud inimese keratinotsüütide (HaCaT) rakuliin saadi ettevõttest Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Saksamaa). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) 4,5 g/l D-glükoosi, L-glutamiini, 25 mM HEPES-iga ja DMEM 4,5 g/l D-glükoosi, L-glutamiini, 25 mM HEPES-ga ilma fenoolpunaseta, Dulbecco puhverdatud fosfaadiga (DPBS), Fetal Bovine Serum (FBS) ja trüpsiin EDTA osteti firmalt Gibco Life Technologies (Waltham, MA, USA). Etanooli tarnis Aga (Lissabon, Portugal). N,N-dimetüül-4-nitroguanidiin (RNO), imidasool ja Nitro Blue Tetrazolium (NBT) osteti firmalt Alfa Aesar (Kandel, Saksamaa).

3.2. Spektri neeldumine 

Iga uuritud ühendi neeldumisspekter määrati vahemikus 290–700 nm vastavalt OECD katsejuhisele 101, kasutades Jasco V650 UV/VIS spektrofotomeetrit [37]. Ained lahustati DMSO-s, et saada lõppkontsentratsiooniks 10 µg/mL ja neeldumisspektrid mõõdeti UV-läbipaistvate kvartsküvettide abil (tee pikkus=10 mm). Iga spektrit korrigeeriti lahustispetsiifilise baasjoone absorptsiooni suhtes. Molaarsed ekstinktsioonikoefitsiendid (MEC) arvutati, kasutades kõrgeimaid neeldumispiike vahemikus 290 kuni 700 nm [15].

3.3. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) test 

Kehtestati ROS-analüüsi protokoll ja valideerimisuuringud viidi läbi vastavalt kirjanduses kirjeldatud protseduurile [19,29]. Kõikide testitud ainete põhilahused valmistati 10 mM kontsentratsiooniga DMSO-s ja kasutati valguse eest kaitstult sama päeva jooksul. Lühidalt, singletthapniku (SO) teke tuvastati p-nitrosodimetüülaniliini (RNO) pleegitamise spektrofotomeetrilise mõõtmisega lainepikkusel 440 nm, kasutades imidasooli üksiku hapniku selektiivse aktseptorina. Proovid, mis sisaldasid testitavat kemikaali (200 µM), RNO (50 µM) ja imidasooli (50 µM) 20 mM naatriumfosfaatpuhvris (PB, pH 7,4), pandi katsutisse ja segati vortex-segistiga ning töödeldi ultraheliga. valguse eest kaitstult, 10 min. Segu kanti Hellma kvartsklaasist suure jõudlusega kambrisse ja enne valgusega kokkupuudet kontrolliti mikroskoobi all sademete tekkimist. Seejärel kiiritati proove Fitoclima S600PL termostaatilise päikesesimulaatoriga (Aralab, Portugal), mis oli varustatud kaheksa Repti Glo (20 W) UV-Vis lambiga, 90 minutit temperatuuril 25 ◦C. Pärast kiiritamist loeti neelduvus uuesti 440 nm juures. Superoksiidi anioonide (SA) teke tuvastati, jälgides nitrosinise tetrasooliumi (NBT) redutseerumist monoformasaaniks (NBT pluss), mille moodustumist saab jälgida spektrofotomeetriliselt 560 nm juures. Proove, mis sisaldasid testitud ühendeid (200 uM) ja NBT (50 uM) 20 mM NaPB-s, kiiritati ja NBT vähenemist mõõdeti neeldumise suurenemisega 560 nm juures samamoodi nagu SO määramisel. Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Kuna kasutatud päikesesimulaator erines soovitatud mudelitest, oli vaja kiiritustingimusi valideerida. Viidi läbi ROS-analüüs, et tagada kiiritustingimuste vastavus soovitatud kriteeriumidele, kasutades positiivseid (kiniin) ja negatiivseid kontrolle (sulisobensoon) ja võrdluskeemilisi ühendeid [29]. Vastavalt ROS-analüüsi tulemusele (kolmekordsete määramiste keskmine) klassifitseeriti testitud polüfenoolsed ühendid fotoreaktiivseteks aineteks, kui mõõdeti SO väärtust 25 või rohkem ja/või SA väärtust 20 või rohkem; omakorda määrati see mittefotoreaktiivseks aineks, kui SO väärtused olid alla 25 ja SA väärtused alla 20 [29].

3.4. Rakukultuur 

HaCaT rakke hoiti temperatuuril 37 ◦C niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 95 protsenti õhku ja 5 protsenti CO2, inkubaatoris DMEM-is koos 1 0 protsendi FBS ja 1 protsendi antibiootikumidega. Pööratud mikroskoobi abil täheldati rakkude liitumist ja kui rakud saavutasid 70–80% konfluentsuse, tehti rakusurma vältimiseks subkultuur. Sel eesmärgil aspireeriti sööde ja rakke pesti DPBS-ga, lisati 2 ml 0,25% trüpsiini ja inkubeeriti 7–8 minutit temperatuuril 37 °C 5% CO2 atmosfääris. Pärast rakkude eraldumist lisati trüpsiini toime blokeerimiseks värske sööde. Rakkude loendamiseks pandi 10 µl rakususpensiooni Neubaueri kambrisse, kus rakud loendati. Saadud rakususpensioon jaotati seejärel uutesse kolbidesse värske rakukultuurisöötmega. Rakkude külmutamiseks kasutati DMSO-d (5 mahuprotsenti) krüokonservandina, et vältida kristallide moodustumist säilitusfaasis. Rakkude dubleerimiseks vajaliku aja määramiseks külvati 1 × 106 rakku viide 75 cm2 kolbi ja inkubeeriti 24 tundi 37 °C juures 5% CO2 atmosfääris, et saavutada täielik kleepumine. Seejärel loendati iga kolvi rakud erinevatel aegadel. Tulemused esitati graafikul, mis kujutas rakkude arvu ja aega, millest kahekordistumise aeg arvutati lineaarse regressioonianalüüsi abil. Saadud arvutatud kahekordistumisaeg oli 20, 43 tundi, mis on kooskõlas kirjanduses esitatud väärtustega, kinnitades seega, et kasutatud rakud olid normaalsetes kasvutingimustes [38]. 3.5. Fototoksilisuse test Fototoksilisuse uurimiseks järgiti meie laboris rakendatud varasemat protokolli [24]. UVA/UVB Osram-lambi (240V E27) kõrgust reguleeriti vastavalt OECD juhistele [23], et kiiritada rakke UVA kiirgusdoosiga 1,7 mW/cm2 (Cosmedico radiomeeter, UVM-7). . Kiiritamise ajal (10 min) hoiti plaate vesijahutussüsteemi sisaldavas vahtpolüstüroolist vastuvõtjas ja temperatuuri jälgiti kogu protseduuri vältel. Lühidalt, NR-i omastamise testi läbiviimiseks külvati HaCaT rakud (2 × 104 rakku süvendi kohta) ja inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2 atmosfääris 24 tundi. Seejärel sööde eemaldati, lisati erinevates kontsentratsioonides uuritavaid aineid ja rakke inkubeeriti samades tingimustes 1 tund. Ühte plaati hoiti pimedas, samal ajal kui teist plaati kiiritati 10 minutit temperatuuril 29–32 ◦C. Seejärel asendati rakusööde värske DMEM-iga ilma fenoolpunaseta ja inkubeeriti 18–22 tundi. Pärast seda inkubeerimisperioodi pesti mõlema plaadi rakke DPBS-ga ja igasse süvendisse lisati täielik DMEM, mis sisaldas 50 µg/ml NR, ja inkubeeriti 3 tundi. Pärast NR-ga inkubeerimist eemaldati NR-i lahus ja lisati NR-i desorbeerimislahus (50% etanool:1% äädikhape:49% destilleeritud vesi), et ekstraheerida NR-värvi rakkudest. Lugemisprotseduuri jaoks mõõdeti neeldumist lainepikkusel 540 nm. Igas plaadis testiti DMSO kontrolle. Igalt plaadilt saadud rakkude elujõulisuse andmed väljendati töödeldud rakkude ja lahusti kontrollrakkude neeldumissuhtena ning neid kasutati täiendavalt IC50 väärtuste hindamiseks lineaarse regressioonianalüüsi abil. Iga uuritava aine fotoärritusteguri (PIF) väärtus arvutati kiiritatud rakkude (Irr pluss) IC50 väärtuse ja mittekiiritatud (Irr−) rakkude IC50 väärtuse suhtena. OECD juhiste kohaselt ennustab PIF-indeks, mis on madalam kui 2, fototoksilise toime puudumist, PIF-indeks vahemikus 2–5 ennustab tõenäolist fototoksilist toimet ja kõrgem PIF kui 5 ennustab fototoksilist toimet [23]. Testitud ühendeid hinnati kontsentratsioonide vahemikus: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 ja 1000 uM. 3.6. Statistiline analüüs Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve (SD) vähemalt kolmest sõltumatust katsest, mis viidi läbi kolmes korduses. Dispersiooni normaalsuse ja homogeensuse kinnitamiseks kasutati D'Agostino-Pearsoni omnibussi normaalsuse testi ja seejärel ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA), millele järgnes Dunnetti post hoc test (võrdlus negatiivsete kontrollrakkudega lahustiga). esitati. Graafikud genereeriti tarkvaraga GraphPadPrism for Windows (versioon 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, USA).

4. Järeldused

Selles uuringus kasutati reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) testi ja 3T3 neutraalse punase omastamise fototoksilisuse analüüsi (3T3 NRU-PT), et uurida looduslike fenoolsete antioksüdantide käitumist päikesevalgust matkiva kiirgusega kokkupuutel, et uurida nende fotoreaktiivsust ja fototoksilisust. potentsiaal. Saadud tulemused võimaldasid järeldada, et kuigi rutiin ja kohv-, p-kumaar- ja feruulhape neelavad UV-nähtavat valguskiirgust ja nende MEC on suurem kui 1000 L mol-1cm-1, klassifitseeritakse need mittefotoreaktiivseteks. Veelgi enam, need ühendid ei kutsunud esile fototoksilisust, kui neid testiti HaCaT rakuliiniga. Leitud andmed viitavad selleleneed antioksüdandidEeldatavasti ei põhjusta need iseenesest fototoksilisust ja seetõttu võib neid pidada ohutuks kasutamiseks kosmeetikatoodetes. Teisest küljest oli võimalik jälgida kiirgusega kokkupuutunud raku elujõulisuse suurenemist, kui nende antioksüdantide juuresolekul ilmnes võimalik fotoprotektiivne toime, mida võiks olla huvitav uurida, et toetada nende kasutamist võimalike fotoprotektiivsete ainetena kosmeetikatoodetes. DOPACi puhul osutus see ühend fotoreaktiivseks, kuigi 3T3 neutraalse punase omastamise testis fototoksilisust ei täheldatud. Siiski tuleks läbi viia rohkem uuringuid, et mõista DOPAC-i fotoreaktiivsuse taga olevaid mehhanisme, tagada selle foto ohutus ning mõista ka rolli ja seost keemilise struktuuri ja ühendi potentsiaali vahel olla fotoreaktiivne. Autori kaastööd: Formaalne analüüs, BA; Kirjutamine – originaalkavandi ettevalmistamine, BA; Kontseptualiseerimine IFA, HC ja JG: ressursid, IFA, HC, JMSL ja JG; Kirjutamine – läbivaatamine ja redigeerimine, IFA, HC, JMSL ja JG; Järelevalve, IFA, HC ja JG; Rahastamise hankimine, IFA, HC, JMSL ja JG Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud. Rahastamine: see uurimus ei saanud välist rahastamist. Institutsioonilise ülevaatekomisjoni avaldus: ei kohaldata. Teadlik nõusolekuavaldus: ei kohaldata. Andmed Kättesaadavus: Kõik selles uuringus esitatud andmed sisalduvad artiklis. Tänuavaldused: Seda tööd rahastatakse riiklikest vahenditest FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP projekti UIDP/04378/2020, UIDB raames. /04378/2020 rakendusmolekulaarsete bioteaduste uurimisüksuses-UCIBIO ja projekti LA/P/0140/2020 of the Associate Laboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB ja UIDB/00081/2020, mida rahastab stipendium (FCT/ACMCTES). Huvide konflikt: autorid deklareerivad, et huvide konflikti ei ole. Näidise saadavus: Ei kohaldata.

Viited

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polüfenoolid kosmeetikatoodete toimeainetena. Int. J. Cosmet. Sci. 2015, 37, 455–464. [CrossRef]
2. Jelena, CH; Giorgio, R.; Justyna, G.; Neda, M.-D.; Natasa, S.; Artur, B.; Giuseppe, G. Polüfenoolide kasulik mõju kroonilistele haigustele ja vananemisele. Polüfenoolides: omadused, taastamine ja rakendused; Galanakis, CM, toim.; Woodhead Publishing: Kidlington, Suurbritannia, 2018; lk 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Tamez, M.; Mattei, J. Polüfenoolide roll inimeste tervise- ja toidusüsteemides: miniülevaade. Esiosa. Nutr. 2018, 5, 87. [CrossRef]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, DO; Tomás-Barberán, FA Polüfenoolide ja muude bioaktiivsete ainete mõju inimeste tervisele. Toidu funktsioon. 2019, 10, 514–528. [CrossRef]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polüfenoolid: teooriast praktikani. Foods 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, NM; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MY; Nikolenko, VN; Bulygin, KV; Mihhaleva, LM; et al. Mitokondriaalsed mutatsioonid ja mitoepigeneetika: keskenduge oksüdatiivse stressi poolt põhjustatud reaktsioonide reguleerimisele rinnavähi korral. Semin. Cancer Biol. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Oksüdatiivse stressi sihtimine haiguste korral: antioksüdantravi lubadus ja piirangud. Nat. Rev. Drug Discov. 2021, 20, 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC Kas taimsed fenoolsed ühendid võivad kaitsta nahka õhus lenduvate tahkete osakeste eest? Antioksüdandid 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pei, P.; Aslam, M.; Huang, N. Sargassum vachellianumi polüfenoolirikka ekstrakti ja polüsahhariidirikka ekstrakti nahakaitseaktiivsuse võrdlev uuring. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Phytoconstituents kui fotoprotektiivsed uudsed kosmeetilised preparaadid. Pharmacogn. Rev 2010, 4, 1–11. [CrossRef]