Kõige aktiivsemate probiootiliste tüvede in vitro hindamine, mis on võimeline parandama soolebarjääri funktsioone ja ennetama seedetrakti põletikulisi haigusiⅡ

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Rakukultuurid

Inimese kaukaasia käärsoole adenokartsinoomi Caco{{0}} rakud (ATCC® HTB-37™) ja inimese käärsoole epiteeli lima sekreteerivad HT29-MTX rakud (Sigma Aldrich) kultiveeriti esmalt eraldi, mõlemat kasutades DMEM (Gibco) sööde, millele on lisatud 10% veise loote seerumit (Gibco), 100 IU/ml penitsilliini, 100 mg/ml streptomütsiini (Gibco) ja 2 mM glutamiini (Gibco), temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 atmosfääris. Seejärel paigutati kaaskultuurid 12-wellTranswell® plaatidele (12 mm polükarbonaadist sisetükiga ja 0,4 µm pooridega), plaadistades rakud basolateraalsesse kambrisse vahekorras 75:25 Caco-2:HT 29-MTX ja viidi läbi 21 päeva, vahetades kandjat iga 2 päeva järel.

Kõhukinnisuse kiireks leevendamiseks klõpsake nuppu

2.2. Bakteritüved

Lactobacillus'e tüved, sealhulgas pühvlipiimast eraldatud Limosilactobacillus fermentum [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 ja Lacticaseibacillus reuteri LR92 ja Racticaseibacillus paracasei projektist Farmceatic, Inc. Italia, kasvatati bioreaktoris kääritamisel ja külmkuivatatakse, et saada lähteainena kasutatud pulbrid. Enne katset resuspendeeriti pulbrid ja kasvatati Man, Rogosa ja Sharpe puljongis (MRS-Oxoid) temperatuuril 37 °C mikroaerofiilsetes tingimustes 24 tundi.

2.3. Raku ravi

Koos kultiveeritud rakke töödeldi Lactobacillus spp. erinevate tüvedega. (108 CFUs/mL) nakkuse kordsusega (MOI) 100, üksi või kombinatsioonis 20 µg/ml S. Typhimurium'i lipopolüsahhariidiga (LPS), 24 tundi temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 juures DMEM-is ilma antibiootikumideta.

2.4. Reaalajas PCR

Pro- ja põletikuvastaste tsütokiinide, HBD-2 ja TJ-de ekspressiooni hindamiseks pesti rakke ravi lõpus kolm korda steriilse PBS-ga ja kogu RNA ekstraheeriti High Pure RNA Isolation Kit abil. Roche Diagnostika). 42 ◦C 45 min, vastavalt tootja juhistele. Reaalajas PCR IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, Occludini, Zonuliini-1 ja Claudini{{ jaoks 14}} viidi läbi LC Fast Start DNA Master SYBR Green komplektiga (Roche Diagnostics), kasutades 2 µL cDNA-d, mis vastab 10 ng kogu RNA-le 20 µl lõppmahus, 3 mMMgCl2 ja 0,5 µM senss- ja antisenss-praimereid ( Tabel 1). Pärast võimendamist viidi sulamiskõvera analüüs läbi kuumutades temperatuurini 95 ◦C 15 s temperatuuri üleminekukiirusel 20 ◦C/s, jahutades temperatuurini 60 ◦C 15 sekundit temperatuuri ülemineku kiirusega 20 ◦C/s ja seejärel proovi kuumutamine 0,1 ◦C/s kuni 95 ◦C. Seejärel analüüsiti tulemusi LightCycleri tarkvara (Roche Diagnostics) abil. Iga praimeripaari standardkõver määrati cDNA seerialahjendustega. Kõik PCR-id viidi läbi kolmes eksemplaris. Spetsiifilisusamplifikatsiooniproduktide arvu kontrolliti elektroforeesiga 2% agaroosgeelil ja visualiseerimisega etiidiumbromiidiga värvimisega [6].

2.5. ELISA analüüs

IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonuliini-1, Occludini ja Claudiini{{7 }} analüüsiti erinevate laktobatsillide tüvedega nakatunud Caco-2/HT29- MTX kaaskultuuride rakulüsaatides LPS-iga või ilma, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA; Invitrogen, IL{{12). }}, IL-8, IL-1 alfa, TNF alfa ja TGF beeta-1 HumanELISA komplekt; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beeta (inimene) – ELISA komplekt; Elabscience Biotechnology Inc. Human Zonulin, Human OCLN (Occludin) ja Human CLDN1 (Claudin 1) ELISA Kit).

2.6. Adhesiooni ja invasiivsuse test

L. brevise, L. reuteri ja L. rhamnosuse võimet vähendada S. Typhimurium'i ja EIEC kleepuvust ja invasiivsust soolestiku kookultuurides uuriti kolme erineva katsetüübiga: (i) konkureeriv test, mille käigus inkubeeriti üheaegselt sooleepiteelirakke. laktobatsillidega (108 CFU/mL) ja S. Typhimuriumor EIEC-ga (108 CFUs/mL) 2 tundi. (ii) Inhibeerimise test, milles rakke eelinkubeeriti laktobatsillidega (108 CFU/ml) 2 tundi, seejärel lisati S. Typhimurium või EIEC (108 CFUs/ml) ja inkubeeriti veel 2 tundi. (iii) Asendustest, milles rakke eelinkubeeriti S. Typhimurium'i või EIEC-ga (108 CFUs/mL) 2 tundi ja seejärel lisati laktobatsillid (108 CFUs/ml) ja inkubeeriti veel 2 tundi. Selle aja lõpus pesti nakatunud monokihte põhjalikult PBS-is, seejärel lüüsiti 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) lahusega PBS-is 10 minutit toas. temperatuuri, et loendada sisestatud baktereid. Rakulüsaatide alikvoodid lahjendati seeriaviisiliselt ja kanti Hektoeni agarile (OXOID) ja inkubeeriti 37 °C juures öö läbi, et kvantifitseerida kogueluvõimeliste rakkudega seotud bakterid (CFU/ml). Invasiivsustestide jaoks pesti nakatunud monokihte pärast inkubeerimist bakteritega põhjalikult steriilse PBS-iga ja inkubeeriti veel 2 tundi DMEM söötmes, millele oli lisatud gentamütsiinsulfaati (250 µg ml-1) (Sigma-Aldrich), et tappa rakuvälised bakterid. seejärel rakud lüüsiti ja plaaditi nagu eelnevalt kirjeldatud, et kvantifitseerida internaliseeritud bakterite koguarv (CFU/mL).

2.7. Statistiline analüüs

Olulisi erinevusi rühmade vahel hinnati kahesuunalise ANOVA abil, kasutades GraphPad Prism 8.0, ja keskmiste võrdlus arvutati aStudendi t-testi abil. Andmed on väljendatud kolme sõltumatu katse keskmistena ± standardhälbe (SD).

Looduslik taimne ravim kõhukinnisuse leevendamiseks-Cistanche

Cistanche on parasiittaimede perekond, mis kuulub sugukonda Orobanchaceae. Need taimed on tuntud oma raviomaduste poolest ja neid on traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) kasutatud sajandeid. Cistanche liike leidub valdavalt Hiina, Mongoolia ja teiste Kesk-Aasia kuivades ja kõrbepiirkondades. Cistanche taimi iseloomustavad nende lihavad, kollakad varred ja neid hinnatakse kõrgelt nende võimaliku tervisega seotud eeliste tõttu. TCM-is arvatakse, et Cistanche'il on toonilised omadused ja seda kasutatakse tavaliselt neerude toitmiseks, elujõu suurendamiseks ja seksuaalfunktsiooni toetamiseks. Seda kasutatakse ka vananemise, väsimuse ja üldise heaoluga seotud probleemide lahendamiseks. Kuigi Cistanche on traditsioonilises meditsiinis kasutatud pikka aega, on selle tõhususe ja ohutuse teaduslikud uuringud käimas ja piiratud. Siiski on teada, et see sisaldab mitmesuguseid bioaktiivseid ühendeid, nagu fenüületanoidglükosiidid, iridoidid, lignaanid ja polüsahhariidid, mis võivad kaasa aidata selle ravitoimele.

Wecistanche'i omacistanche pulber, tsitanche tabletid, cistanche kapslidja muud tooted on välja töötatud kasutadeskõrbcistanchetoorainena, mis kõik mõjuvad hästi kõhukinnisust leevendavalt. Spetsiifiline mehhanism on järgmine: Cistanche'il arvatakse olevat potentsiaalne kasu kõhukinnisuse leevendamisel, tuginedes selle traditsioonilisele kasutamisele ja teatud ühenditele, mida see sisaldab. Kuigi teaduslikud uuringud konkreetselt Cistanche mõju kohta kõhukinnisusele on piiratud, arvatakse, et sellel on mitu mehhanismi, mis võivad aidata kaasa selle potentsiaalile kõhukinnisust leevendada. Lahtistav toime:CistancheTraditsioonilises Hiina meditsiinis on seda juba pikka aega kasutatud kõhukinnisuse ravimina. Arvatakse, et sellel on kerge lahtistav toime, mis võib soodustada soolte liikumist ja põhjustada kõhukinnisust. See toime võib olla tingitud mitmesugustest Cistanche'is leiduvatest ühenditest, nagu fenüületanoidglükosiidid ja polüsahhariidid. Soolestiku niisutamine: traditsioonilise kasutuse põhjal arvatakse, et Cistanche on niisutavate omadustega, mis on suunatud just sooltele. Soolestiku niisutamise ja määrimise soodustamine võib aidata tööriistu pehmendada ja hõlbustada läbipääsu, leevendades seeläbi kõhukinnisust. Põletikuvastane toime: kõhukinnisust võib mõnikord seostada seedetrakti põletikuga. Cistanche sisaldab teatud ühendeid, sealhulgas fenüületanoidglükosiide ja lignaane, millel arvatakse olevat põletikuvastased omadused. Vähendades põletikku soolestikus, võib see aidata parandada väljaheite regulaarsust ja leevendada kõhukinnisust.