Silico-põhises ekraanis sünergistlikud ravimkombinatsioonid ravimtaimedest: juhtum, kus kasutatakse Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Neuroprotektsiooni moodul

Neuroprotektsioon on mehhanismid ja strateegiad, mida kasutatakse kesknärvisüsteemi neuronaalse vigastuse või degeneratsiooni eest kaitsmiseks pärast ägedaid häireid (nt insult või närvisüsteemi vigastus/trauma) või krooniliste neurodegeneratiivsete haiguste (nt Parkinsoni tõbi, Alzheimeri tõbi, sclerosis multiplex) tagajärjel. Neuroprotektsiooni eesmärk on piirata neuronite düsfunktsiooni/surma pärast kesknärvisüsteemi vigastust ja püüda säilitada kõrgeim

rakuliste interaktsioonide võimalik terviklikkus ajus, mille tulemuseks on häirimatu närvifunktsioon. Nagu on näha jooniselt 4, on mõned serotonergilise sünapsi raja sihtmärgid seotud neuroprotektsiooni funktsiooniga. Näiteks prostaglandiinide tootmine PTGS1 ja PTGS2 kaudu (tuntud ka kui COX-1 ja COX-2) on oluline vahendaja põletikuvastaste ja uudsete lahustumist soodustavate mehhanismide esilekutsumisel56. Hiljutine uuring on näidanud, et cAMP57 ​​teket katalüüsiva ensüümi ADCY5 geeniekspressiooni vähendab promootori metüülimine COX{10}}indutseeritud inimese HCC rakuliinides58. Ülaltoodud analüüsi põhjal oletame, et COX-2 kogunemine võib mõjutada sAPP sekretsiooni, cAMP poolt moduleeritud sekretaasi poolt lõhustatud APP lõhustumist ja avaldab lisaks neuroprotektiivset toimet59,60. Meie tulemused näitavad, et neuroprotektsioon mängib neuropõletiku ravis olulist rolli.

LOODUSLIK TUBULOOS PARKINSONI HAIGUSE VÄLTIMISEKS FUNKTSIOON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentaalne valideerimine

Ühenditega töödeldud BV2 Microglia rakkude elujõulisus

BV2 mikrogliiarakke (8 × 104 rakku/ml) toidetakse 24 tunni jooksul kontsentratsiooniga 37,5 kuni 300 µM ühe milliliitri söötme kohta ilma nelja ühendi seerumita. Arvame, et kontrollrühma rakkude elujõulisus, mida kasvatati seerumi puudumisel alla 0,1% DMSO-ga, on 100% (joonis 5 (a–d)). Rühmadele ettenähtud annuste juures olulist rakulist tsütotoksilisust ei täheldatud.

Ravimite sünergia ja võimaliku põletikuvastase toime kinnitamine in vitro

Saadud tulemuste edasiseks hindamiseks in silico valitakse neli ühendit, mis hõlmavad kolme sünergistlikku paari, nimelt isoakteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid, ehhinakosiid ja verbaskosiid, et uurida nende ravimite sünergistlikku toimet ja potentsiaalset põletikuvastast toimet, kasutades LPS-iga töödeldud BV2 rakke. Eelkõige viime läbi Western blot analüüsi iNOS-i ja COX{4}} valgu ekspressiooni jaoks, et kinnitada ennustatud ravimikombinatsioonide sünergiat ja põletikuvastast toimet.

Nagu on näidatud joonisel 5(e–g), on teatatud iNOS-i ja COX-2 valkude tasemed testitud BV2 rakuliinide paneelis. Täheldame, et kas isoakteosiidi või 2'-atsetüüllakteosiidiga töötlemisel vähenesid iNOS-i ja COX{5}} valgu ekspressioonid BV2 rakkudes erinevatel annuste tasemetel. Kuid ravi isoakteosiidi ja 2'-atsetüüllakteosiidi kombinatsiooniga põhjustab põletikuliste tegurite iNOS ja COX-2 märkimisväärset suurenemist (joonis 5(e)). Joonis 5(f) illustreerib sedaehhinakosiidi või verbaskosiidiga ravi, kui ainuke agens, põhjustab iNOS-i ja COX{0}} ekspressiooni vähenemist. Veelgi enam, nagu oodatud, põhjustas ravi ehhinakosiidiga kombinatsioonis verbaskosiidiga kontsentratsioonis 150 μM rohkem väljendunud langust.

valgu ekspressioonitasemed (iNOS ja COX-2), mis näitab selle ravimikombinatsiooni sünergistlikku põletikuvastast toimet. Sarnaselt, nagu on näidatud joonisel 5(g), näitab ehhinakosiidi ja 2'-atsetüüllakteosiidi kombinatsioon märkimisväärset sünergistlikku toimet COX-2 inhibeerimisele kontsentratsioonil 75 µM või 300 µM. Kuid iNOS-i puhul, annuses 300 μM, tähistab kombinatsioon valgu märgatavat supressiooni. Seevastu leiame, et isoakteosiidi ja 2′-atsetüüllakteosiidi või ehhinakosiidi ja verbaskosiidi kombinatsioonil kontsentratsioonil 75 μM (täiendav joonis 2) ei ole ilmset inhibeerivat toimet nii iNOS-ile kui ka COX-2. teiste paaridega näitab palju nõrgemat toimet võrreldes üksikainetega annuses 150 või 300 µM, mida võib näha joonisel 5 (e–g).

Kokkuvõtteks võib öelda, et in vitro uuring annab lisateavet potentsiaalselt põletikuvastase toimega ravimite kombinatsioonide skriinimiseks ja näitab in silico sõelumisstrateegia usaldusväärsust.

LOODUSLIK TUBULOOS NEUROOPÕLETUSE RAVIKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Arutelu

Neuropõletik on seotud enamiku neuroloogiliste, psühhiaatriliste ja närvisüsteemi arenguga seotud haigustega, mis ei ole mitte ainult tagajärg, vaid võib olla ka patoloogia vallandaja. Kuid praegused neuropõletike ravimeetodid on enamasti monoteraapiad, mida piiravad hästi tuntud kõrvaltoimed, nagu me teame, COX-2 inhibiitorid võivad vastusena pikaajalisele ravile põhjustada kardiovaskulaarseid defekte ja TNF-i sihtravi võib põhjustada infektsiooni immunosupressioon. Kombinatoorsed terapeutilised lähenemisviisid võivad olla hädavajalikud keerukate haiguste ravi parandamiseks, millel on järgmised eelised: võrgu vastupidavus ja möödaviigu kompenseerimine, suurenenud kliiniline efektiivsus, säilitades samal ajal minimaalse toksilisuse inimesele, ja iga ühendi vähendatud annus63. Süsteemfarmakoloogial põhinevate ravimtaimedest saadud ühendite sünergistlike ravimite kombinatsioonide uurimist piirab aga ühendite suurte koguste võimalik peamine põhjus.

Töös saame kõigepealt 63 potentsiaalset bioaktiivset ühenditürt Cistanche tubulosa, mis vastab kriteeriumidele (DL suurem või võrdne 0.18) edasiseks analüüsiks, kasutades ennustust, mis on hädavajalik soovitavate omadustega paljulubavamate molekulide väljasõelumiseks. Pärast 63 potentsiaalse bioaktiivse ühendi 133 sihtmärgi kaardistamist andmebaasi saame 43 neuroinflammatsiooniga seotud sihtmärki ja seejärel võib prognoositud sihtmärkide GOBP klastrianalüüs tõenäoliselt kaasa aidata neuropõletiku ravile. CT-võrgu analüütiline tulemus näitas ühendite keskmist kraadi vastavalt 11,209 ja 7,651 sihtmärgi kohta ning 38 neist kohandasid rohkem kui 7 sihtmärki (keskmisest kraadist suuremad). Näiteks võib 7 sihtmärgiga ennustatud ehhinakosiid (mol41), 9 sihtmärgiga verbaskosiid (mol33) või 8 sihtmärgiga tabelikülg B (mol57) mängida võtmerolli neuroprotektsioonis vastavalt kasvavale kirjandusele.

Me saavutame otsesed terapeutilised sihtmärgid, nagu APP, MAPT (tuntud ka kui Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 ja HTR2A (tuntud ka kui 5-HT2A), GRIN2B (glutamaadi ionotroopse retseptori NMDA tüüpi subühik 2B) ja GRIA1 (glutamaadi ionotroopse retseptori AMPA tüüpi subühik 1) või allavoolu potentsiaalsed sihtmärgid, nagu PTGS274 või NOS275, mis on seotud närvipõletiku või erinevate närvisüsteemi haigustega.

Ühendi-sihtmärgi-raja võrgustiku analüüs näitab PEA algoritmi kaudu 12 ühendit 10 parimast ravimipaarist, mis on ühendatud 43 potentsiaalse sihtmärgiga ja neuropõletikuga seotud radadega, näiteks kaltsiumi signaaliülekande rada, neuroaktiivse ligandi ja retseptori interaktsioon või TNF signaalirada ja nii edasi. Süsteemis võivad need ennustatud ühendid toimida mitte ainult ülesvoolu, vaid ka neuropõletiku ja põletikuliste biomarkeritega seotud allavooluteede valkudele. Lisaks pakutakse täiendavat teavet potentsiaalselt põletikuvastase toimega ravimite kombinatsioonide skriinimiseks ja in silico sõelumisstrateegia usaldusväärsust kontrollitakse eksperimentaalse valideerimisega. Neuropõletiku rada koosneb Alzheimeri tõve rajast, kaltsiumi signaaliülekande rajast, GnRH signaaliülekande rajast, VEGF signaaliülekande rajast ja serotonergilisest sünapsist. Analüütilised tulemused selgitasid meile selgelt, et rakusurma, põletiku ja neuroprotektsiooni moodulid on näited, et dešifreerida rakusurma mehhanismi.Cistanche tubulosa neuroinflammatsiooni raviks.

Neuropõletik kaasneb erinevate neurodegeneratiivsete haigustega, mis võivad olla mitte ainult patoloogia tagajärjeks, vaid vallandajaks, mistõttu soovitatakse põletikuvastaseid ravimeetodeid olla paljutõotav ravimeetod. Meie pettumuseks, kuigi oleme mõistnud monoteraapiate piiranguid, on kombineeritud ravide hindamine ja aluseks olevad mehhanismid endiselt uudse alternatiivse strateegia väljatöötamise peamised väljakutsed. Seetõttu võib see töö pakkuda uusi ravivõimalusi neuropõletike jaoks ja avada uue võimaluse looduslike toodete ravimite kombinatsioonide avastamiseks.

Materjalid ja meetodid

Ühendite kogumine

Kokku 66 Cistanche tubulosa keemilist koostisainet kogutakse käsitsi TCMSP-st (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, sealhulgas 26 fenüületanoidglükosiidi, 22 iridoidi, 4 lignaani, 7 monoterpeenglükosiidi, 2 lämmastikku sisaldavat ainet, 3 benseen-akrüloüülsuhkrud, 1 sterool, 1 ketool. Arvestades sedaglükosiidid Cistanche tubulosa'sTavaliselt hüdrolüüsitakse aglükooni vabastamiseks, mis seejärel imendub soole limaskestas, seega võtame arvesse ilma glükoolisisalduseta molekule, mis on märgistatud kui _qt. See viis 103 ühendi tekkeni. Need molekulid on esitatud täiendavas tabelis S1.

Ravimisarnasuse hindamine

Cistanche tubulosa potentsiaalsete bioaktiivsete ühendite saamiseks hindame nende koostisosade ravimisarnasust, arvutades Tanimoto sarnasuse taimsete ühendite ja kõigi Drugbanki andmebaasis olevate kemikaalide keskmiste molekulaarsete omaduste vahel. Ja DL ennustusmudelit on paljudes uuringutes edukalt rakendatud bioaktiivsete ühendite valimiseks. Töös on kandidaatide DL-indeks Suurem või võrdne 0.18 määratletud läviväärtusena, et see sobiks paremini järgneva analüüsiga.

Narkootikumide sihtmärgi ennustamine

Juhtivate ühendite efektiivsuseesmärkide kindlakstegemine on endiselt oluline samm ühendite edasiarendamisel ravimite väljatöötamisel. Siin kasutatakse ravimifshingi molekulaarse sihtteabe tuletamiseks kahte ettevõttesisest tööriista: SysDT ja WES. SysDT on in-soolimudel, mida teostatakse keemilise, genoomse ja farmakoloogilise teabe kombinatsiooniga, mis põhineb kahel võimsal matemaatilisel tööriistal: Random Forest (RF) ja Support Vector Machine (SVM), et tõhusalt lahendada sihtmärgi tuvastamise probleem. Saadud mudel oli väärtuslik platvorm ravimi-sihtmärgi koostoimete prognoosimiseks üldise täpsusega 97, 3%, aktiveeritud ennustustäpsusega 87, 7% ja inhibeeritud ennustustäpsusega 99, 8%. Paljutõotavamate komponentide hõivamiseks on selles uuringus filtreerimiskriteeriumid määratletud kui RF väärtus, mis on suurem või võrdne 0,7 või SVM, suurem või võrdne kui 0,8.

Kaalutud ansamblisarnasus (WES) on uus võimas arvutusmudel, mis võimaldab täpselt määrata ravimi tegelike bioaktiivsete koostisosade otsesed sihtmärgid. Uudse tööriistana toimib saadud mudel hästi sidumise prognoosimisel keskmise tundlikkusega 85% (SEN) ja mittesiduvate mustrite ennustamisel 71% (SPE) vastuvõtja töökõverate all olevate keskmiste pindaladega (ROC, AUC) 85,2% ja keskmine vastavus 77,5%. Saadud sihtmärgid kaardistatakse täiendavalt Uniprotiga, et hiljem nende nimed ja organismid normaliseerida. Siin valime edasiseks analüüsiks ainult Homo sapiens'i sihtmärgid. Valitud ühendite sihtmärgid kaardistatakse CTD andmebaasi, et saada nendega seotud haigused ja lõpuks sõelume välja potentsiaalsed neuropõletikuga seotud sihtmärgid.

GO sihtmärkide rikastamine ja analüüs

Saadud sihtmärkidega seotud bioloogiliste protsesside uurimiseks vastendame sihtmärgid DAVID-iga ja selles jaotises valitakse terminid, mille P-väärtus on väiksem kui 0.05.

Ravimikombinatsiooni analüüs

Meie eelmises töös kasutati süsteemset farmakoloogilist raamistikku, et ennustada ravimikombinatsioone äsja loodud mudelil, mida nimetatakse tõenäosusrühma lähenemisviisiks (PEA), et analüüsida ravimite kombinatsioonide kliinilist efektiivsust ja kõrvaltoimeid. Üksikasjalikult töötati välja sarnasusalgoritmiga integreeritav Bayesi võrk, et modelleerida kombinatsioone ühendite molekulaarsetest ja farmakoloogilistest mõjudest. Seejärel esitati kombineeritud hinnang, mis hõlmas prognoositud paaride kliinilist efektiivsust ja kõrvaltoimeid. Lühidalt näitab see, et PEA suudab ennustada kõrge spetsiifilisuse ja tundlikkusega (AUC=0.90) paaride efektiivsust meie töös. Selles töös valime välja nende sünergia tõenäosuse põhjal kümme parimat ravimikombinatsiooni, mis kujutavad endast kahe ühendi sünergia esilekutsumise võimalust.

Võrgustiku/tee loomine ja analüüs

Aktiivsete koostisosade ja põletikuliste haiguste vaheliste seoste uurimiseks loob Cytoscape 2.8.1, populaarne bioinformaatika pakett bioloogilise võrgu visualiseerimiseks ja andmete integreerimiseks, ühendi sihtmärgi (CT) võrgu ja ühendi sihtmärgi raja võrgustiku (CTP). Võrgu kvantitatiivseid omadusi analüüsivad kaks järgmist pistikprogrammi Network Analyzer ja CentiScaPe 1.2. Graafilises võrgus tähistavad sõlmed kas ühendeid, sihtmärke või radu, samas kui servad kodeerivad ravimi ja sihtmärgi interaktsiooni. Et täiendavalt uurida rakuliste sihtmärkide toimimise bioloogilisi mõjusid mitmete metabolismiradade moduleerimise kaudu, koostatakse neuroinflammatsioonipatoloogiat käsitleva ajakohase teabe põhjal integreeritud "rada". Esiteks, kasutades nende kaardistamist KEGG andmebaasi, koondatakse saavutatud sihtprofiilid mitmeks rajaks. Pärast kaudsetest lõikudest loobumist integreeritakse patoloogiliste ja kliiniliste andmete põhjal käsitsi suhteliselt sünteesitud rada.

LOODUSLIK TUBULOOS PARKINSONI HAIGUSE RAVIKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentaalne valideerimine

Proovide ettevalmistamine

ehhinakosiid, verbaskosiid, isoakteosiid ja 2'-atsetüüllakteosiidostetakse ettevõttelt Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Hiina). Testitavad proovid lahustatakse dimetüülsulfoksiidis (DMSO) (Sigma, USA), et saada 100 mM põhilahusena, ja säilitatakse seejärel 4 kraadi juures. Kultuurisöötmele lisatud DMSO lõplikud lahjendused ei ületanud kunagi 0,1%, mis tagas, et see ei mõjutanud rakkude elujõulisust.

Rakukultuur

BV2 hiire mikrogliia rakud töötas algselt välja Hiina Teaduste Akadeemia Shanghai rakupank ja neid kultiveeriti 25 või 75 cm2 suurustes ülesannetes Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, USA), millele on lisatud 10% veiseloote seerumit (FBS). (Gibco BRL, USA), penitsilliin G (100 ühikut/ml) ja streptomütsiin (100 mg/ml) niisutatud inkubaatoris 5% CO2/95% O2 37 kraadi juures.

Rakkude elujõulisuse test

BV2 mikrogliia rakud külvatakse 96-süvendi plaadile tihedusega 1 × 105 rakku/ml, pärast 18-tunnist inkubeerimist töödeldakse rakke 100 ul värske söötmega koos või ilma erinevate näidustatud kontsentratsioonidega testitavate proovidega. lisaks 24 h. CCK-8 test (BestBio, Shanghai, Hiina) on mugav ja usaldusväärne meetod rakkude elujõulisuse määramiseks. Katseproovide tausta kõrvaldamiseks viskame kogu söötme ära, seejärel lisatakse 100 ul/süvend värsket söödet, mis sisaldab 10% CCK-8 lahust. OD väärtused 450 nm juures loetakse mikroplaadi lugejal (Molecular Devices, California, USA) pärast 3-tunnist inkubeerimist 37 kraadi ja 5% CO2 juures.

Western blot analüüs

Rakuvalk ekstraheeritakse rakuliinidest, kasutades Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Saksamaa) pärast tootja protokollis näidatud protseduure. Valkude kvantifitseerimiseks kasutatakse Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA). Ekvivalentne kogus valku (50ug) denatureeritakse, keetes 100 kraadi juures 10 minutit 2*lammli proovi laadimispuhvriga (Bio-Rad, USA) pluss 5% -merkaptoetanooli vahekorras 1:1 ja laaditi raja kohta 12% SDS-PAGE-le (naatriumdodetsüülsulfaatpolüakrüülamiidi minigeelid), elektriülekandega 0,45 μm polüvinülideenfuoriidmembraanidele (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) 150 minutiks 200 mA juures. Seejärel blokeeritakse membraanid toatemperatuuril 3% veise seerumi albumiiniga (BSA) ja inkubeeritakse primaarsete antikehadega iNOS ja COX-2 (Abcam) 4 kraadi juures üleöö. Pärast kolme põhjalikku pesemist Tris-puhverdatud soolalahuses-Tween (TBST) iga 5 minuti jooksul, sondeeritakse membraane mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (1:10000 lahjendused; Abcam) 1,5 tundi toatemperatuuril. Seejärel visualiseeritakse immunoreaktiivsed ribad, kasutades ECL kemoluminestsentsi tuvastamise komplekti (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) pärast pesemist kaks korda TBST-s ja üks kord TBS-s, iga kord 5 minutit. Densitomeetrilised väärtused normaliseeritakse, kasutades laadimise sisekontrollina -aktiini.

Statistiline analüüs

Andmed on esitatud keskmisena ± standardviga ja Western blot analüüsi korratakse kolmes sõltumatus katses sama tulemusega. Kolme või enama rühma keskmiste erinevuste võrdlemiseks kasutatakse ühesuunalist dispersioonanalüüsi, statistilist olulisust analüüsitakse Studenti t-testiga kahe rühma vahel.

LOODUSLIK TUBULOOS PARKINSONI HAIGUSE JA ALZHEIMERI HAIGUSE RAVIKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%