Immuunsust stimuleerivad antikehakonjugaadid kutsuvad esile tugeva müeloidse aktivatsiooni ja püsiva kasvajavastase immuunsuse (2. osa)

Lisateabe saamiseks võtke palun ühendustdavid.wan@wecistanche.com

Arutelu:

Siin esitatud tulemused pakuvad veenvaid tõendeid, mis toetavad ISAC-sid kui kasvaja immunoteraapia uudset tehnoloogiat. ISAC-de in vitro modelleerimine näitas nende võimet aktiveerida inimese primaarseid müeloidseid APC-sid Fc R-st ja TLR-st sõltuval viisil ning suurendada antigeeni ristesitlust, kasutades hiire OVA mudelisüsteemi. Aktiveerimist kostimuleeriva molekuli CD40 ülesreguleerimise kaudu ei täheldatud mitte ainult in vitro, vaid seda nähti ka tuumoris paiknevatel müeloidsetel APC-del nii ksenotransplantaadi kui ka süngeensete kasvajamudelite puhul. Üks selle uuringu silmatorkav leid oli, et TLR agonisti kovalentne kinnitumine kasvajale suunatud monoklonaalne antikeha ISAC-i kujul muutis immunostimuleerivat tulemust ja üldist efektiivsust, mida tavaliselt eeldatakse TLR-i agonistide puhul. Trastuzumabi lokaalse manustamise ja T785 kombineeritud manustamise võrdlus T785-ISAC süsteemse kohaletoimetamisega näitas, et ainult ISAC aitas kasvajakoormust vähendada. Segu lokaalne manustamine ei toonud kasu HCC1954 kasvaja ksenotransplantaadi mudelis, millel oli võrreldav toime ainult trastuzumabiga. See leid kinnitab, et mitte ainult lokaalne manustamine, vaid ka antikeha ja TLR agonisti samaaegne manustamine on ISAC-ga täheldatud terapeutilise efektiivsuse jaoks hädavajalik. HCC1954 kasvaja ksenotransplantaadi mudelis genereeritud mehaanilised andmed näitasid, et tõhususe tagamiseks on vaja in vivo Fc R-i ja TLR-i seotust, kuna nii TLRnull-ISAC kui ka Fc-inaktiivne ISAC ei suutnud kasvaja kasvu kontrollida. Lisaks andis ISAC-de süsteemne manustamine püsiva kasvajavastase efektiivsuse roti HER2 pluss süngeense kasvaja mudelites ja inimese HER2 pluss rinnavähi ksenograftides, mis olid resistentsed konjugeerimata antikehaga töötlemise suhtes. Prekliiniliste in vivo uuringute sihtantigeeniks valiti HER2, kuna lokaalselt kaugelearenenud või metastaatilise rinnavähiga patsientide neoadjuvant-, adjuvant- ja esmavaliku ravis domineerivad HER{16}}sihitud antikehad, mis ei ole loodud immuunsüsteemi stimuleerimiseks. süsteem ja heakskiidetud T-rakkude kontrollpunkti inhibiitorid blokeerivad antikehad on nendel patsientidel olnud minimaalselt tõhusad. Need patsiendid võivad kasu saada ISAC-dest, mis säilitavad lähteantikehade funktsionaalsuse ja lisavad märkimisväärset immunostimuleerivat potentsiaali. Nagu kõigi immunoterapeutiliste ravimite puhul, on võimalus tekitada või süvendada ravimivastaseid antikehi ja ISAC puhul võib see lõppkokkuvõttes sõltuda lähteantikeha immunogeensusest. Neid hinnanguid on kõige parem teha kliiniliselt ja trastuzumab võib uuringuks ideaalselt sobida, kuna teatatud Herceptin™-i immunogeensuse määr on patsientidel alla 1 protsendi. In vivo andmeid, mis näitavad antikeha ja adjuvandi samaaegse kohaletoimetamise nõuet, toetavad täiendavalt tööd, mis kirjeldab üksikasjalikult ISAC aktiivsust reguleerivat rakusisest signaalimist samaaegse Fc R ja TLR signaalimise kaudu. Kuigi täiendavad uuringud võivad veelgi selgitada rakusisest ISAC signaaliülekande dünaamikat, toovad siin kirjeldatud uuringud esile TLR agonisti antikehaga konjugeerimise võimalikud signaalieelised, mida tavaliselt täheldatakse siis, kui antikehad seovad kaitsva immuunsuse ajal patogeene. Rakusisese signaaliülekande CyTOF-põhine analüüs edasiseks kasutamiseks kasutati inimese PBMC-sidmõista ja eristada segu ja ISAC aktiivsust. Tulemused näitasid ISAC-stimulatsioonile järgnenud võimendatud signatuuri võrreldes üksikute komponentide seguga esile kutsutud signatuuriga, mis toetab veelgi potentsiaali võimendada aktiivsust antikeha ja TLR agonisti keemilise konjugeerimise kaudu. Kuigi ISAC-de TLR7 ja TLR{1}}spetsiifilist tugevust ei saa mõõta HEK293 reporterrakkudega, on demonstratsioonIRF-i ISAC mitte ainult ei kutsu esile TLR ja Fc R radadega seotud kanooniliste radade suurenenud signaalimist, vaid vähendab ka paarikaupa aktiveerimisläve, mis on vajalik allavoolu signaalivalkude, näiteks ribosomaalse valgu S6, valgu translatsiooni võtmeregulaatori, fosforüülimise vallandamiseks rakus. Kõrged DREMI-skoorid, eriti mõõdetunaMonotsüütides ja DC-des toetavad tugevat tingimuslikku sõltuvust, mis on põhjustatud ISAC-ga stimuleerimisest, mida segu puhul ei täheldata. See nähtus võibSeda soodustavad intratsellulaarsed muutused endosoomi retseptorite arvukuses, lokaliseerimises ja/või värbamises, kuid täpse mehhanismi kinnitamiseks on vaja täiendavat uurimist. Oluline on see, et DREMI analüüs tuvastas ISAC-i stimulatsiooni tulemusena teadaolevate signaalimispartneritega kooskõlas olevad suhted. Tuntud inhibeeriva toime tõtturolli kanoonilises NF-κB signaalimises 49, täheldasime sõltuvuse vähenemist (st DREMI skoori)pIRF7 ja kappa B (IKB) inhibiitori vahel, kui müeloidrakke stimuleeriti ISAC-ga. Kokkuvõttes toetavad need tulemused võimendatud ja püsivat rakusisest vastust asjakohaste signaaliülekanderaja molekulide kaudu ISAC-i stimulatsioonist allavoolu, lisaks sünergiale TLR ja Fc R-ga seotud signaaliradade vahel.

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

Meie tulemused näitasid, et funktsionaalsed Fc-Fc R interaktsioonid on müeloidsete APC-de ISAC-vahendatud aktiveerimiseks hädavajalikud. Looduslik IgG1 Fc, millel on kõrgeim afiinsus looduslikult olemasolevate IgG isotüüpide aktiveerivate Fc R-de suhtes, oli parem kui teised IgG isotüübid, millel on aktiveeriva Fc R-i suhtes madalam afiinsus. Fc-Fc R interaktsiooni edasine tugevdamine fukosüülimise kaudu suurendas potentsiaali, samas kui Fc-Fc R interaktsiooni vähendamine glükosüülimise kaudu vähendas potentsiaali. Ootuspäraselt oli ISAC-de jaoks maksimaalse stimulatsiooni esilekutsumiseks vajalik Syk signaalimine Fc R seotusest allavoolu lisaks sellele järgnevale TLR agonismile. Neid leide toetavad uuringud, mis näitavad müeloidse stimulatsiooni dramaatilist tugevnemist pärast koosstimuleerimist plaadiga seotud IgG ja TLR agonisti PAM3CSK 50-ga. Samuti viitavad need ulatuslikumale Fc ristsidumisele sihtraku pinnal või in vitro plaadi seadistuses. , võib ilmneda või diferentsiaalsignalisatsioonivõrgud on pärast ISAC-i stimulatsiooni, mitte komponentide segunemist, sisse lülitatud. ISAC platvormi translatsiooni in vivo hinnati esmalt inimese HER2 pluss kasvajarakuliinidega hiirtel, kellel puuduvad täielikult funktsionaalsed B-, T- ja NK-rakud. Märkimisväärselt oli trastuzumab ISAC oluliselt efektiivsem kui trastuzumab mitme erineva HER2 ekspressioonitasemega kasvaja korral. Lisaks näitasid andmed ISAC-i kasvajavastase toime sõltuvust kasvaja sihtimisest, kuna isotüüp-ISAC ei suutnud esile kutsuda kasvaja regressiooni ja kliirensit. Kuigi in vitro modelleerimine näitas, et ISAC-i tõhususe võimaldamiseks on vaja TLR ja Fc R aktiivsust, ei olnud sellised mudelid edukad ISAC-i antigeeni sihtimisest sõltuvuse mõõtmisel. Terve inimese müeloidsete APC-dega koos kultiveeritud plaadipõhistes testides ei mõõdetud erinevusi sihitud ja isotüübi T785-ISAC-de vahel.kasvajarakkudega (andmeid pole näidatud).In vitro mõõdetud sihtmärgisõltuvuse puudumine võib olla tingitud mitmest tegurist: on leitud, et müeloidsed APC-d reguleerivad pärast in vitro kultiveerimist rakupinnal Fc R-sid üles, mis võib suurendada lahustuva IgG võimet seonduda Fc R-ga, põhjustades võimendatud signaal isotüübist ISAC.Lisaks kultiveeritudsüsteemis puudub endogeenne IgG ja in vivo esinevad täiendavad seerumifaktorid, mis võivad in vivo konkureerida Fc R pärast ja summutada ISAC isotüübiga täheldatud toimeid.Sellegipoolest näitasid in vivo mudelid, et ISAC tugineb kasvajavastases efektiivsuses kasvaja sihtimisele.Tõhususe uuringutes ei avaldanud isotüüp ISAC-d mitte ainult vähest mõju kasvaja kasvule, vaid leiti, et need ei mõjutanud ka kasvajate geneetilist taset, nagu on näidatud ksenotransplantaadi ja süngeensete kasvajate mudelites.Lisaks sihtmärgist sõltuva efektiivsuse demonstreerimisele in vivo talusid loomad T785-ISAC-i ja põhjustasid minimaalse kaalukaotuse, mis näitas vähe märke sihtmärgist sõltuvatest mõjudest ja kõrvalnähtudest hiirtel.Need andmed toetavad veelgi süsteemselt manustatud kasvajale suunatud ISAC-i võimet liikuda kasvajani ja esile kutsuda lokaliseeritud põletikueelse kasvajavastase vastuse.

Müeloidrakkude poolt vahendatud efektorfunktsioonide tähtsust demonstreeriti rakkude kahanemise uuringutes, kus fagotsüütide klodronaadi vähenemine vähendas ISAC-i võimet indutseerida kasvaja kliirensit.Huvitav on see, et kuigi kasvajad algselt taandusid pärast Gr1-positiivsete rakkude ammendumist, kasvasid kasvajad hiljem välja.See nähtus võis tekkida fagotsüütide prekursorite, nagu monotsüütide, ammendumise tagajärjel, mis võisid hiljem diferentseeruda funktsionaalseteks ja küpseteks fagotsüütilisteks rakkudeks 51.MRNA tasemete ja ISAC-ravi järgsete muutuste kvantifitseerimisel saadi täiendavaid molekulaarseid ja rakulisi teadmisi.Neid andmeid kinnitas veelgi immunohistokeemia ja valgu kvantifitseerimine, mis näitab müeloidrakkude infiltreerumist kasvajasse.põletikueelse tsütokiini TNF ja müeloidsete kemoatraktantide CCL2 (MCP-1) ja CCL4 (Mip1b) tootmisega.

Joonis 2: ISACS kutsub esile müeloidsetes APC-des erinevad signaalimustrid. (ad) Värskelt isoleeritud inimese PBMC-d stimuleeriti 1 µM rituksimab-ISAC-ga või segu ekvimolaarse ekvivalendiga CD20 pluss Toledo kasvajarakkude juuresolekul vahekorras 1:1 vahekorras 15 minutit. (a) ISAC-i ja signaaliülekande keskmist arcsinh suhet mõõdeti pärast erinevate fosfoproteiinide segu stimuleerimist, nagu on kujutatud soojuskaardil, kusjuures kollane näitab suurenenud signaali ja sinine signaali vähenemist. ( b ) Tüüpilised voolutsütomeetria graafikud pIRF7 ja pRPS6 jaoks monotsüütides ja cDC-des. (c) Indutseeritud signaalimise korduv muutus arvutati arcsinh suhtena stimuleerimata kontrolli suhtes. IRF7 ja ERK1/2 fosforüülimist mõõdeti monotsüütides ja cDC-des pärast ISAC või segu stimuleerimist. Andmed pärinevad ühest katsest kuue doonoriga (keskmine ja SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

CCL2 ja CCL4, CCR2 ja CCR5 retseptorid ekspresseeritakse vastavalt monotsüütidel ja makrofaagidel, mis viitab sellele, et neid rakutüüpe võib värvata ISAC-ga ravitud kasvajatesse.Veelgi enam, Cxcl9 ja Cxcl11 mRNA, mis kodeerivad T-raku-spetsiifilisi kemokiine ja mida ekspresseerivad DC-d TME-s, reguleeriti ka trastuzumab ISAC-raviga (täiendav joonis 23) 52,53.Suurenenud tõhususega trastuzumab ISAC, mis kasutas agonisti CL264, näitas paremat efektiivsust kasvajamudelites, mis ekspresseerivad vähem HER2.See on oluline, arvestades, et patsientidel, kelle kasvajad ekspresseerivad madalat HER2-d, on piiratumad ravivõimalused ja nad ei sobi trastuzumabi või muude trastuzumabi sisaldavate ravimeetodite jaoks.Loomadel, keda raviti nii siht- kui ka isotüüpse CL264-ISAC-ga, täheldati mööduvat kehakaalu langust ligikaudu 5-10 protsenti ja TNF-i suurenenud süsteemset sekretsiooni, mis viitab võimalikele sihtmärgist kõrvalekalduvatele toimetele lisaks tugevale anti- täheldatud kasvaja aktiivsust.Ksenotransplantaadi mudelites esitatud kollektiivsed andmed viitavad sellele, et ISAC-vahendatud fagotsütoos on tõhus mehhanism kasvajate kõrvaldamiseks, kuid seda mehhanismi võib tõhustada pärast kasvaja neoantigeenide antigeeni esitlemist T-rakkudele immunokompetentsetes peremeesorganismides.Selle eesmärgi saavutamiseks uuriti ISAC-de võimet edendada kasvajavastast immuunsust metsiktüüpi hiirtel koos rHER2-vastase ISAC-ga kahes erinevas.rHER2-, mis väljendavad süngeenseid mudeleid (MMC ja CT26-rHER2). Nii T785 kui ka CL264 sisaldavaid ISAC-sid hinnati süngeense MMC mudelis, võttes arvesse rHER2 kõrget antigeeniekspressiooni, kuna nii madalama kui ka suurema tugevusega ISAC-d arvati olevat tõhusad, kui kasvajarakus on kõrge antigeenitihedusega. Mõlemad rHER2 ISAC-d viisid MMC mudelis suurte kasvajatega (350-950 mm3) loomadel täieliku kasvaja kliirensini, samas kui konjugeerimata antikeha ei suutnud kasvaja kasvu kontrollida. MRNA transkripti tasemete analüüs MMC mudelis näitas dramaatilist nihet reguleerimisespalju geene 24 tundi pärast ravi sihtmärgiks oleva rHER2 T785-ISAC-ga võrreldes rHER2 antikeha või isotüübiga ISAC, sealhulgas müeloidrakkude bioloogias, TLR-bioloogias ja adaptiivsetes immuunvastustes osalevates geenides. Immunohistokeemia abil täheldati CD11c- ja F4/80-ekspresseerivate rakkude suurenenud infiltraate, mis on sarnased HCC1954 ksenotransplantaadi kasvaja mudelis täheldatud tendentsiga. Lisaks täheldati CD8 T-rakkude infiltratsiooniimmunohistokeemia, mis toetab adaptiivse immuunvastuse teket pärast ISAC-ravi.

Lisaks fagotsüütide tõestatud tähtsusele ksenotransplantaadi mudelis näitasid MMC süngeense kasvaja mudeli ammendumisuuringud tugevat sõltuvust fagotsüütidest, kuna klodronaadiga laetud liposoomide ammendumine peatas ISAC-vahendatud kasvajavastase toime. Lisaks näitasid süngeensed uuringud T-rakkude kriitilist rolli ISAC-i efektiivsuses. ISAC-põhine kasvaja kliirens sõltus suuresti CD8 T-rakkude aktiivsusest, kuna CD8 T-rakkude ammendumine pärssis kasvajavastast efektiivsust. Andmed viitavad sellele, et T-rakkude aktiivsust juhib ISAC-stimuleeritud müeloidrakkude TLR-vahendatud aktiveerimine. Selline nõue T-rakkudele, mis on arvatavasti seotud kasvajaga seotud antigeenide esitlemisega ISAC-stimuleeritud müeloidrakkude poolt, toetab seda, et ISAC-d vahendavad tõenäoliselt oma kasvajavastast toimet vähemalt kahe mehhanismi kaudu: fagotsütoos ja antigeeni esitus. Kuigi fagotsüüdid annavad pärast ISAC-ravi varajase kasvajavastase vastuse, tagab T-rakkude antigeenide praimimine lõpuks tuumori kliirensi ja püsiva toime, mida mõõdetakse täielikult immunokompetentsetes mudelites. See kombinatsioon oleks vähihaigete jaoks väga soovitav, kuna ISAC-ravi võib viia tugeva ja püsiva kasvajavastase immuunsuse tekkeni. ISAC-vahendatud T-rakkude aktiveerimise olulisuse edasiseks uurimiseks raviti hiired rHER2 CL-i järgselt CT26- rHER2 kasvajatest välja. 264-ISAC-ravi taastati pärast 30-päevast kasvajavaba olemist mitte-rHER2 ekspresseeriva CT26 vanemrakuliiniga. rHER2-CT26-ga ravitud loomad olid CT26-ga nakatumise eest kaitstud, samas kui varem kasvajat mittesaanud loomad ei suutnud kasvaja kasvu tagasi lükata. Lisaks sellele, et näidata, et kaitse oli spetsiifiline CT26 kasvaja rakuliinile, implanteeriti 4T1 samaaegselt vanemate CT26-ga nakatunud hiirte kontralateraalsesse külge. Kuigi CT26 kasvajad ei suutnud her-CT26-ga ravitud hiirtel kasvada, oli 4T1 kasvaja kasv koormamata ja annab seega tõendeid, et immuunsus on antigeenispetsiifiline ja sõltub adaptiivsest immuunvastusest. Lisaks näitavad need uuringud, et kasvajale suunatud ISAC-id vahendavad immunoloogilist mälu mitte ainult algselt sihitud kasvajaantigeenile, vaid ka sihtmärgita antigeenidele. Need andmed viitavad ka sellele, et müeloidrakud võivad esitada kasvajaga seotud antigeene, mis juhivad täiendavaid CTL vastuseid. Nende leidude tagajärjed näitavad, et isegi kui sihitud kasvaja antigeen on hiljem alareguleeritud või ei suuda ISAC-iga seonduda, on immunoloogiline mälu juba käivitatud ja see on võimeline säilitama püsiva vastuse. See vastus ei olepiirdudes ISAC-i sihtmärgiks oleva antigeeniga, aga ka täiendavate identifitseerimata kasvajaga ekspresseeritud antigeenidega.Kokkuvõttes näitavad need andmed, et ISAC-d kutsuvad esile kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt erineva bioloogia, mis on seotud raku aktiveerimise ja antigeeni esitlemise, T-rakkude proliferatsiooni ja püsiva kasvajavastase immuunsusega.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 protsenti taastatud valgu põhjal. SEC analüüs tuvastas minimaalse agregaadi olemasolu ja DAR määrati LC/MS analüüsiga. Puhastatud ISAC-d filtriti läbi 0,2 μm steriilse filtri ja säilitati kuni kasutamiseni temperatuuril –20 kraadi. Inimese TLR7 või inimese TLR8 ekspresseerivad HEK293 reporterrakud osteti ettevõttest Invivogen (hub-htlr7 või hub-htlr8). ja müüja protokolle järgiti raku paljundamiseks ja katsetamiseks. Lühidalt öeldes kasvatati rakke DMEM-is, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i, tseotsiini ja blastitsidiini, kuni 80-85 protsendini konfluentsus 5-protsendilise CO2 juures. Seejärel külvati rakud 96-süvendiga lamedatele plaatidele tihedusega 4 x 104 rakku süvendi kohta koos substraadiga, mis sisaldas HEK tuvastamiskeskkonda ja immunostimuleerivaid molekule. Aktiivsust mõõdeti plaadilugeja abil lainepikkusel 620-655 nm. Biacore AnalysisHis-märgistatud Fc Gamma Receptor (FCGR) valgud saadi ettevõttest R&D Systems (FCGR1 (CD64, cat# 1257-FC{{23}). }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34) }}FC-050. Seondumisanalüüs viidi läbi Biacore T200 instrumendiga HBS-EP pluss puhvris (GE BR100669), kasutades CM5 kiipi (GE BR100530), mis sisaldas immobiliseeritud anti-HIS antikeha (HIS Capture kit, GE 28995056). ). Rituximab või Rituximab-ISAC on süstinud üle voolurakke, mis sisaldavad ainult kinnipüütud FCGR-e või võrdluspinna anti-His-antikeha. Andmed viidati topeltanti-His pinna ja ainult puhversüst. Kasutati kineetilise tiitrimise meetodit ja pinnad regenereeriti tsüklite vahel, süstides 10 mM glütsiini, pH 1,5. Andmed sobitati Biacore T200 hindamistarkvara (V3.1) abil, kasutades kineetilist sobivust (1:1) FCGR1 ja FCGR3A jaoks (keskmine 6 käitamist) ja püsiseisundi afiinsust (1:1) FCGR2A ja FCGR2B jaoks (3 käitamist keskmiselt). ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 protsenti, määratuna CD14, CD16, CD11c ja HLA-DR ekspressioonil põhineva voolutsütomeetria abil. Toledo kasvajarakkude ettevalmistamine Toledo rakke (ATCC) kultiveeriti müüja soovitatud söötmes ja hoiti tarnija soovitatud rakutihedusega (ATCC). Rakud eemaldati kultuurist, pesti ja resuspendeeriti PBS-is koos 2% FBS-i ja 2 mM EDTA-ga 1-10x106 rakku/ml. Mõnel juhul märgistati rakud seejärel 2 minuti jooksul 2 μM CFSE-ga ja seejärel pesti üks kord RPMI -1640 (Lonza), millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i (Atlanta Biologicals) ja 100 U/ml Pen/Strep (Lonza). Seejärel fikseeriti rakud 2-protsendilises paraformaldehüüdis ja pesti kolm korda PBS-ga enne edasist kasutamist. Rakuaktivatsiooni testid PBMC-d või isoleeritud monotsüüdid plaaditi vastavalt 3x105 või 2x105 rakku süvendi kohta lamedapõhjalistele 96-süvendiplaatidele IMDM-is. millele on lisatud 10 protsenti FBS-i (Atlanta Biologicals), 1 mM naatriumpüruvaati (Lonza), 100 µM asendamatuid aminohappeid (Lonza) ja 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). Monotsüütide ja kasvaja ühiskultuuri katsete jaoks kultiveeriti monotsüüte fikseeritud allogeensete kasvajarakkudega vahekorras 3:1. Seejärel inkubeeriti rakke immunostimuleerivate ainete või kontrollidega 18-36 tundi temperatuuril 37 kraadi 10% CO2-ga. Raku aktivatsiooni mõõdeti aktiveerimismarkerite rakupinna ekspressiooni ja tsütokiinide tootmise kaudu. Pinnamarkerite ekspressioonitasemeid mõõdeti voolutsütomeetria abil CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) ja CD16 (3G8, BD) vastaste antikehadega. CD14 (MΦP9, BD) ja CD123 (7G3, BD). PBMC-sid analüüsiti voolutsütomeetria abil eelnimetatud aktivatsioonimarkerite vastaste antikehadega, samuti liinimarkeritega CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) ja CD69 (FN50, BD). Kõigil juhtudel koguti rakukultuuri supernatant pärast 18- või 36-tunnist inkubeerimist ja tsütokiinide tootmist mõõdeti kas tsütokiini helmeste massiivi komplektide (Human Inflammatory Cytokine Kit, BD Biosciences) ja ELISA (TNF Human ELISA komplekt, eBiosciences) abil. .MassitsütomeetriaPBMC-d eraldati tervest doonoriverest ja stimuleeriti ISAC-ga, antikeha ja adjuvandi seguga või ilma stiimulita 5-15 minutit temperatuuril 37 kraadi. Pärast stimulatsiooni rakudfikseeriti, lisades 16 protsenti PFA-d (elektronmikroskoopia teadused) lõppkontsentratsioonini 1,6 protsenti ja inkubeeriti 1 0 minutit toatemperatuuril (RT). Fikseeritud rakke pesti rakuvärvimissöötmega (CSM; PBS 0,5% BSA-ga ja 0,02% naatriumasiidiga (kõik Sigma)) ning vöötkoodiga, kasutades pallaadiumipõhist lähenemist, nagu eelnevalt kirjeldatud 54. Vöötkoodiga proovid ühendati üheks. liitproov pinna värvimiseks.

Pinna värvimiseks lisati CSM-i antikehad (täiendav tabel 2) ja inkubeeriti 3{{10}} minutit toatemperatuuril. Inimesevastased antikehad osteti kas konjugeeritult (Fluidigm) või konjugeerituna raskmetallide isotoopidega, kasutades MaxPar X8 antikehade märgistuskomplekti (Fluidigm) vastavalt tootja soovitustele. Pinnavärviga rakke pesti üks kord CSM-is ja permeabiliseeriti MeOH-ga 10 minutit jääl. Permeabiliseeritud rakke pesti kaks korda CSM-iga ja rakusiseste antigeenide vastased antikehad lisati 30 minutiks toatemperatuuril. Rakke pesti CSM-iga ja lõpuks resuspendeeriti interkalatsioonilahuses (1,6 protsenti PFA-d PBS-is, 0,02 protsenti saponiini (Sigma) ja 0,5 µM iriidiumi interkalaatorit (Fluidigm)) üle öö 4 kraadi juures. Enne andmete kogumist pesti proove üks kord CSM-is ja kaks korda ddH2O-s. Kõik proovid filtriti läbi rakusõela (Falcon) ja resuspendeeriti 1x106 rakku/ml ddH2O-s, millele oli lisatud 1x EQ neljaelemendilised kalibreerimishelmed (Fluidigm) ja CyTOF2 massitsütomeetril (Fluidigm) kogutud andmed. Signaalivastuseid hinnati SPADE-rakenduse abil Citibank 29-s. Analüüsid viidi läbi kõigis rakkudes (ilma proovide võtmiseta), valides kindlaksmääratud klastrite arvu ja kasutades kõiki asjakohaseid pinnamarkereid, kuid mitte rakusiseseid markereid klastrite moodustamiseks. Immuunrakuliinidele tehti märkused nende suuremõõtmeliste pinnavalgu ekspressioonimustrite põhjal. Statistilised analüüsid viidi läbi avatud lähtekoodiga statistilise tarkvara keskkonnas R. Igas raku alamrühmas, ravirühmas ja doonoris arvutati järgmise kahekümne fosfovalgu markeri keskmine muutus: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (kokku), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 ja p-JNK/SAPK. Keskmist kordade muutust kaaluti rakkude koguarvuga igas klastris, nagu on määratletud pärast SPADE klastrit. Paaritud t-testid viidi läbi, et hinnata erinevust keskmises korrutises muutumises ja testida nullhüpoteesi, et iga markeri keskmises murdemuutuses ei olnud erinevusi ravi- ja kontrolltingimustes.

Ksenotransplantaadi kasvaja mudeli katseprotseduur Kasvaja rakuliinid osteti ettevõttest ATCC (NCI-N87, HCC1954 ja COLO205) või AddexBio (JIMT-1) ja neid kasvatati vastavalt tootja juhistele. Rakud koguti, kui nad saavutasid 80-90 protsendi konfluentsuse, eraldades need Accutase'iga (Stemcell), pesti PBS-ga, resuspendeeriti 40 x 106 rakku/ml PBS-is ja pandi jääle mitte kauemaks kui kaheks tunniks. Vahetult enne implanteerimist segati suspendeeritud rakud võrdses koguses Cultrex PathClear BME, tüüp 3 (R&D Systems) ja 100 μL segu (2 x 106 rakku) implanteeriti subkutaanselt 6-8-nädalaks paremasse külge. -vanad emased hiired järgmiselt: NCI-N87 ja COLO205 rakud implanteeriti NSG hiirtele (Jacksoni labor), HCC1954 ja JIMT{18}} rakud implanteeriti Rag2/IL2rg topeltknockouti (Taconic) ja HCC1954 (hindamiseks koos T785-ISAC) implanteeriti NSG-sse võiSCID/beežid hiired (Jackson Laboratory või Taconic ja Envigo). Kasvaja suurus registreeriti kaks korda nädalas ja seda hinnati järgmise valemi abil: (pikkus x laius2)/2. Kui kasvajad saavutasid 50-100 mm3, tavaliselt ühe nädala jooksul pärast kasvaja implanteerimist, alustati ravi. Hiired randomiseeriti kasvaja suuruse järgi ravirühmadesse enne esmast ravi. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC või isotüüp ISAC valmistati PBS-is 1 mg/ml ja manustati 5 mg/kg intraperitoneaalselt iga viie päeva järel (Q5D) kokku kuus annust. Hiired, kelle kasvajad ületasid 2000 mm3, tapeti.

HCC1954 ja MMC rakkude kahanemise katseprotseduurMakrofaagide ja muude fagotsüütiliste rakkude kahanemiseks raviti HCC1954 või MMC kasvajatega hiiri intraperitoneaalse süstiga kaks päeva enne esmast ISAC-ravi klodronaadi liposoomidega või kontrollliposoomidega, mis ei sisaldanud kontroll-Clodronate'i (negatiivset klodronaat #asulana). CLD-8901) ja seejärel raviti kaks korda nädalas kokku kolme nädala jooksul. Neutrofiilide arvu vähendamiseks töödeldi hiiri kahanevate antikehadega 1A8, et kahandaks ainult Ly6G pluss neutrofiilid (BioXCell kataloogi nr BE0075-1) või RB6-8C5, et kahandada Gr1 pluss rakke, mis hõlmavad Ly6G pluss neutrofiile ja Ly6C pluss rakke (BioXCell kataloogi nr BE0075) või isotüübi kontrolle 2A3 ja LTF-2 (vastavalt BioXCell kataloogi nr BE0089 ja BE0090) kaks päeva enne esmast ISAC-ravi, seejärel raviti kaks korda nädalas kolme nädala jooksul. Rakkude vähenemist veres kinnitas voolutsütomeetria (täiendav joonis 24). Kasvaja tsütokiini ja mRNA analüüsi protseduur Kasvajad implanteeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatule ja koguti analüüsimiseks näidatud ajahetkedel pärast ravi. Immunohistokeemia ja mRNA analüüsi jaoks eraldati kasvajad ja mRNA-d analüüsiti NanoString hiire pan-vähi immuunprofiili paneeliga. Andmete analüüs viidi läbi tarkvaraga nSolver Advanced Analysis Software vastavalt tootja soovitustele. Vulkaanidiagrammid joonistati ggplot2 pakendiga R-s. Tsütokiinianalüüsi jaoks kasvajalüsaatide saamiseks hoiti kasvaja fragmente eelnevalt valmistatud puhvris (1 Pierce Protease Inhibitor Tablets (Thermo Fisher, kataloogi nr A32965), mis oli lahustatud 20 ml T-s PER Tissue Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher, kataloogi nr 78510) GentleMACS M tuubides (Miltenyi, kataloogi nr 130-093-236) kohe pärast lahkamist. Seejärel eraldati kasvajaproovid GentleMACS Octo Disssociatori abil. Pärast seda tsentrifuugiti kõiki proove 5 minutit 300 g juures. Seejärel koguti supernatandid mikrofuugituubidesse ja tsentrifuugiti uuesti mikrotsentrifuugi abil. Tsütokiinide analüüs viidi supernatantidele läbi MSD abil. Immunohistokeemia viidi läbi, kasutades hematoksüliini ja eosiini, et tuvastada koe arhitektuur, samuti järgmiste markerite jaoks, kui uuringutes on näidatud: CD11c (CST kataloog nr 87585) ja CD8 (CST kataloog nr 98941).

Joonis 4: T785-ISAC-d kutsuvad esile tugeva kasvajavastase immuunsuse trastuzumabi suhtes resistentsete kasvaja ksenotransplantaadi mudelites. (ad) SCID/Beige või NSG hiirtele siirdati kasvaja rakuliin HCC1954 ja randomiseeriti, kui kasvaja maht jõudis 50-ni. – 75 mm3. (a) Hiiri raviti üks kord intraperitoneaalselt (IP) trastuzumab T785- ISAC või trastuzumabiga 5 mg/kg või trastuzumabi ja T785 segu molaarselt ekvivalentse doseerimisega ISAC-i intratumoraalse (IT) süstimise teel. Andmed pärinevad ühest katsest n=3-5 hiirega rühma kohta. (b) Hiiri raviti intraperitoneaalse süstiga 5 mg/kg trastuzumabi, trastuzumab-ISAC-ga,rituksimab või rituksimab-ISAC Q5DX6 (n= 5 hiirt rühma kohta). (c) Hiirtele manustati intraperitoneaalselt 5 mg/kg trastuzumabi, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab N297A-ISAC või trastuzumab TLRnull-ISAC (n=5 hiirt rühmas). (d) HCC1954 kasvajarakud implanteeriti SCID/Beige hiirtele ja huvipakkuvad rakud tühjenesid enne ja ravi ajal trastuzumab T785-ISAC-ga (5 mg/kg, Q5DX3), kasutades Ly6G-vastast antikeha (roti IgG2a kontroll) , klodronaadi liposoomid (kontrollliposoomid kontrollina) või anti-Gr1 antikeha (roti IgG2b kontroll). Andmed pärinevad ühest katsest n=4-6 hiirega rühma kohta. (e, f) NSG või Rag2/IL2rg topeltknockout hiirtele implanteeriti JIMT-1 kasvaja rakuliin ja randomiseeriti, kui kasvaja maht jõudis 50–75 mm3. Seejärel raviti hiiri intraperitoneaalselt näidatud raviga annuses 5 mg/kg sagedusega (e) Q5DX6või (f) Q5DX5 (n=3-6 hiirt rühma kohta). (bf) Näidatud andmed esindavad vähemalt kahte katset. (gj) HCC-1954 kasvajad koguti hiirte rühmadest näidatud ajahetkedel pärast töötlemist ühekordse annusega 5 mg/kg ISAC või kontrollantikehadega. Kasvajaid töödeldi voolutsütomeetria analüüsiks, NanoString mRNA kvantifitseerimiseks või formaliiniga fikseeritud ja parafiiniga manustatud immunohistokeemia jaoks. (g) Vulkaandiagrammid kujutavad geeniekspressiooni log2-kordset muutust töödeldud vs isotüübi kontrollkasvajates, mõõdetuna NanoStringiga 24 tunni pärast (n=5 hiirt rühma kohta). Muudatused korrigeeritud p-väärtusega < 0.05="" kuvatakse="" punaselt.="" (h)="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" abil="" kvantifitseeritud="" geenisignatuuri="" skoori="" kasvajate="" puhul,="" mida="" analüüsiti="" 24="" tundi="" pärast="" ravi="" (n{16}}="" hiirt="" rühma="" kohta).="" (i)="" kasvaja="" rakulise="" koostise="" voolutsütomeetria="" analüüs="" 24="" tundi="" ja="" 7="" päeva="" pärast="" ravi="" (n="2-4" hiirt="" rühma="" kohta).="" andmed="" esindavad="" vähemalt="" 2="" katset.="" (j)="" 9="" päeva="" pärast="" iga="" näidatud="" ravi="" kogutud="" kasvajate="" tüüpilised="" kujutised="" ning="" f4/80="" ja="" cd11c="" ihc="" kvantifitseerimine.="" skaalavardad="" on="" 50="" μm.="" (aj)="" andmed="" on="" näidatud="" keskmisena="" sem-iga="" ja="" statistikat=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Süngeense kasvaja mudeli katsemenetlusMMC rakud saadi Dr. Disiselt (Washingtoni Ülikool) ja neid kultiveeriti RPMI 1640-s, millele oli lisatud 20 protsenti FBS-i, 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini ja L-glutamiini temperatuuril 37 kraadi ja 5 protsenti CO2 kuni {{8 }} protsenti voolav. Roti HER2 valgu stabiilseks ekspressiooniks transfekteeritud CT26 rakke (ATCC) kasvatati RPMI 1640-s, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja 600 ug/ml G418 selektiivset antibiootikumi (Thermo), temperatuuril 37 kraadi ja 5 protsenti CO2 kuni 80-90 protsendini konfluentse. Kui rakud olid piisavalt konfluentsed, koguti rakud, eraldades need Accutase'iga (Stemcell) ja pestes PBS-iga. Kogutud rakud resuspendeeriti 20 x 106 rakku/ml (MMC)või 5 x 106 rakku/ml (CT26-rHER2) PBS-is ja hoiti kuni kasutamiseni 4 kraadi juures jääl. 100 μLsuspendeeritud rakkudest implanteeriti subkutaanselt 6-8-nädala vanustele FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2)NK1Mul/Jhiirtele (MMC mudel, The Jackson Laboratory) või emastele BALB/c hiirtele (CT26 mudel, The Jackson Laboratory) . Kasvaja suurust mõõdeti ja registreeriti kaks kordanädal uuringu kestuse jooksul. Kasvaja mahtu hinnati järgmise valemi abil: (pikkus x laius2)/2. Kui kasvajad saavutasid 200-500 mm3 (MMC) või 50-100 mm3 (CT26-rHER2), tavaliselt ühe nädala jooksul pärast kasvaja implanteerimist, alustati ravi. Hiired randomiseeriti kasvaja suuruse järgi ravirühmadesse enne alustamistravi. Anti-rHER2 mAb (BioXCell; 7.16.4) või anti-rHER2-ISAC manustati intraperitoneaalselt (sagedus nagu näidatud jooniste legendides) kogu uuringu vältel.Hiired, kelle kasvajad ületasid 2000 mm3, tapeti. Hinnati T-rakkude ammendumistloomadel, kes kasutavad CD4 (BioXCell; GK1.5) või CD8 (BioXCell; YTS 169.4) rakke kahandavaid antikehi. Ammendumist alustati enne kasvaja implanteerimist ja seda jätkati 200 ug antikeha kohta kaks korda nädalas manustamisega. Kasvaja taastamiseks implanteeriti CT26 ja 4T1 rakuliinid 5 x 106 rakku kasvajaliini kohta ja varem kasvajata hiiri nakatati mõlema rakuliiniga kontrollina.

Täiendav materjal Täiendavate materjalide saamiseks vaadake PubMed Centrali veebiversiooni. Tänuavaldused: Autorid soovivad tänada P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood ja B. Mallet nende kasuliku arutelu eest. Täname ka Stanfordi verekeskuse voolutsütomeetria südamikku, täpsemalt L. Tolentinot, O. Choid ja N. Wu. Samuti täname dr Mary L. (Nora) Disis ja Denise Cecil Washingtoni ülikoolist, kes pakkusid MMC kasvaja rakuliini.

Rahastamine: SE Ackermani toetas Stanford BioX Bowesi stipendium.

Viited:1. Davis TA et al. Rituksimabi anti-CD20 monoklonaalsete antikehade ravi mitte-Hodgkini lümfoomi korral: kordusravi ohutus ja efektiivsus. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi: 10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642]2. Grillo-Lopez AJ et al. Rituksimab: esimene monoklonaalne antikeha, mis on heaks kiidetud lümfoomi raviks. Curr Pharm Biotechnol 1, 1–9 (2000). [Avaldatud: 11467356]3. Lizotte PH et al. Mitteväikerakk-kopsuvähi mitmeparameetriline profiilide koostamine näitab erinevaid immunofenotüüpe. JCI Insight 1, e89014, doi:10.1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239]4. Spranger S et al. Immunogeensete antigeenide tihedus ei seleta melanoomi T-rakkude põletikulise kasvaja mikrokeskkonna olemasolu või puudumist. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759–E7768, doi: 10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020]5. Beatty GL & Gladney WL Immuunse põgenemise mehhanismid vähi immunoteraapia juhendina. Clin Cancer Res 21, 687–692, doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1860 (2015). [Avaldatud: 25501578]6. Fridman WH, Pages F, Salutes-Fridman C & Galon J Inimese kasvajate immuunkontekst: mõju kliinilisele tulemusele. Nat Rev Cancer 12, 298–306, doi: 10.1038/nrc3245 (2012). [Avaldatud: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Immuunsete kuumade, muutunud ja külmade kasvajate ravimeetodid kombineeritud immunoteraapiaga. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi: 10.1038/s 41573-018-0007-y (2019). [Avaldatud: 30610226]8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S & Bronte V Müeloidrakkude koordineeritud reguleerimine kasvajate poolt. Nat Rev Immunol, 12, 253–268, doi: 10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938]9. Joyce JA ja Fearon DT T-rakkude välistamine, immuunsüsteemi privileeg ja kasvaja mikrokeskkond. Science 348, 74–80, doi: 10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376] 10. Carmi Y et al. Akt ja SHP-1 on DC-sisemised kasvaja immuunsuse kontrollpunktid. JCI Insight 1, e89020, doi:10.1172/jci.insight.89020 (2016). [Avaldatud: 27812544]11. Carmi Y et al. Allogeenne IgG koos dendriitrakkude stiimulitega kutsub esile kasvajavastase T-raku immuunsuse. Nature 521, 99–104, doi: 10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063]12. Allen BM et al. Immuunse mikrokeskkonna süsteemne düsfunktsioon ja plastilisus vähimudelites. Nat Med 26, 1125–1134, doi: 10,1038/s 41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499]13. Sagiv-Barfi I et al. Spontaanse pahaloomulise kasvaja likvideerimine kohaliku immunoteraapia abil. Sci Transl Med 10, doi: 10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. Spitzer MH et al. Tõhusaks vähiimmunoteraapiaks on vajalik süsteemne immuunsus. Cell 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [Avaldatud: 28111070]15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT{ {77}}Intratumoraalse teemaksutaolise retseptori (TLR9) agonist CMP-001 võib kombinatsioonis pembrolizumabiga 1b faasi uuringus tagasi pöörata resistentsuse PD-1 inhibeerimisele kaugelearenenud melanoomiga isikutel (AACR Annual Meeting) 2018, 2018).16. Vanker AH TLR-i agonistide ilu CTCL-i jaoks. Blood 119, 321–322, doi:10.1182/ veri-2011-11-391243 (2012). [Avaldatud: 22247516]17. Singh M et al. Tõhus kaasasündinud ja adaptiivne melanoomivastane immuunsus lokaliseeritud TLR7/8 aktiveerimise kaudu. J Immunol. 193, 4722–4731, doi: 10.4049/J Immunol. 1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D ja Klinman DM Kombineeritud ravi, mis on suunatud tasulistele retseptoritele 7, 8 ja 9, kõrvaldab suured väljakujunenud kasvajad. J Immunother Cancer 2, 12, doi:10.1186/2051-1426-2-12 (2014). [PubMed: 24982761]19. Jurk M et al. Inimese TLR7 või TLR8 annavad sõltumatult tundlikkuse viirusevastasele ühendile R-848. Nat Immunol, 3, 499, doi: 10.1038/ni{126}} (2002). [PubMed: 12032557]20. Chattergoon MA et al. HIV ja HCV aktiveerivad põletikku monotsüütides ja makrofaagides endosomaalsete Toll-sarnaste retseptorite kaudu ilma I tüüpi interferooni indutseerimiseta. PLoS Pathog 10, e1004082, doi: 10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [Avaldatud: 24788318]21. Eigenbrod T, Pelka K, Latz E, Kreikemeyer B & Dalpke AH TLR8 tunneb inimese monotsüütides bakteriaalset RNA-d ja mängib Streptococcus pyogenes'e äratundmisel üleliigset rolli. J Immunol. 195, 1092–1099, doi: 10.4049/J Immunol. 1403173 (2015). [Avaldatud: 26101323]22. Mattson G et al. Praktiline lähenemine ristsidumisele. Mol Biol. Rep. 17, 167-183 (1993). [PubMed: 8326953]23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Somaatilised mutatsioonid ja intraklonaalsed variatsioonid B-non-Hodgkini lümfoomi rakuliinide ümberkorraldatud Vkappa geenides. Eur J Haematol 63, 180–191, doi:10.1111/j.{164}}.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273]24. Alonso MN et al. T(H)1, T(H)2 ja T(H)17 rakud juhendavad monotsüütidel diferentseeruma spetsiaalseteks dendriitrakkude alamhulkadeks. Blood 118, 3311–3320, doi: 10,1182/veri-2011-03-341065 (2011). [Avaldatud: 21813450]25. Clarke SR et al. Oalbumiini-spetsiifilise TCR transgeense liini OT-I iseloomustus: positiivse ja negatiivse selektsiooni MHC elemendid. Immunol Cell Biol 78, 110–117, doi: 10.1046/j.{189}}.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410]26. Zehn D, Lee SY & Bevan MJ Täielik, kuid piiratud T-rakkude vastus väga madala afiinsusega antigeenile. Nature 458, 211–214, doi: 10.1038/nature07657 (2009). [Avaldatud: 19182777]27. Kondratova M et al. Vähktõve kaasasündinud immuunvastuse mitmemõõtmeline signaalimisvõrgu kaart näitab rakkude heterogeensuse allkirju. Nat Commun 10, 4808, doi: 10,1038/s 41467-019-12270-x (2019). [Avaldatud: 31641119]

28. Bendall SC et al. Inimese hematopoeetilise kontiinumi diferentsiaalsete immuun- ja ravimivastuste üherakuline massitsütomeetria. Science 332, 687–696, doi:10.1126/science.1198704 (2011).[PubMed: 21551058]29. Qiu P et al. Suuremõõtmelistest tsütomeetriaandmetest rakuhierarhia ekstraheerimine SPADE abil. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi: 10.1038/nbt.1991 (2011). [Avaldatud: 21964415]30.Kawai T & Akira S TLR signaalimine. Cell Death Differ 13, 816–825, doi: 10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796] 31. Sanchez-Mejorada G & Rosales C Signaaliülekanne immunoglobuliini Fc retseptorite poolt. J Leukoc Biol. 63, 521-533 (1998). [PubMed: 9581795]32. Krishnaswamy S et al. Süsteemibioloogia. T-rakkude signaaliülekande tingimuslik tiheduspõhine analüüs üherakulistes andmetes. Science 346, 1250689, doi: 10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. Kiefer F et al. Syk valgu türosiinkinaas on oluline Fcgamma retseptori signaaliülekande jaoks makrofaagides ja neutrofiilides. Mol Cell Biol. 18, 4209-4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. Braselmann S et al. R406, suukaudselt saadaval olev põrna türosiinkinaasi inhibiitor blokeerib Fc retseptori signaaliülekande ja vähendab immuunkompleksi poolt vahendatud põletikku. J Pharmacol Exp Ther 319, 998–1008, doi: 10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104]35. Bruhns P et al. Inimese Fcgamma retseptorite ja nende polümorfsete variantide spetsiifilisus ja afiinsus inimese IgG alaklasside suhtes. Blood 113, 3716–3725, doi: 10,1182/veri-2008-09-179754 (2009). [Avaldatud: 19018092]36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Erinev immunoglobuliini alamklassi aktiivsus selektiivse Fc retseptori sidumise kaudu. Science 310, 1510–1512, doi: 10.1126/science.1118948 (2005). [Avaldatud: 16322460]37. Jefferis R Rekombinantsete antikehade ravi: glükosüülimise mõju toimemehhanismidele. Trends Pharmacol Sci 30, 356–362, doi: 10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968]38. Tanji H, Ohio U, Shibata T, Miyake K & Shimizu T Agonistlike ligandite poolt indutseeritud Toll-like retseptori 8 dimeeride struktuurne ümberkorraldamine. Science 339, 1426–1429, doi:10.1126/ science.1229159 (2013). [Avaldatud: 23520111]39. Shultz LD et al. Inimese lümfoidsete ja müeloidsete rakkude areng NOD / LtSz-i sõnul IL2R gamma null-hiirtel, kellele on siirdatud mobiliseeritud inimese hemopoeetilised tüvirakud. J Immunol. 174, 6477–6489, doi: 10.4049/J Immunol. 174.10.6477 (2005). [Avaldatud: 15879151]40. Xia Z et al. Kaasasündinud immuunvastus inimese luuüdi fibroblastiliste rakkude implantatsioonile CB17 SCID / beežides hiirtes. J Cell Biochem, 98, 966-980, doi: 10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. Tanner M et al. Herceptin-resistentse rinnavähiga patsiendilt loodud uudse rakuliini iseloomustus. Mol Cancer Ther 3, 1585–1592 (2004). [Avaldatud: 15634652]42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L ja Palacio-Vazquez I HER-i trastuzumabi resistentsuse taga olevad mehhanismid2-Ülevõimenenud rinnavähk ja rinnavähk See. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi: 10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. Li JY et al. Biparatoopiline HER2-Sihitud antikeha-ravimi konjugaat kutsub esile kasvaja taandarengu primaarsetes mudelites, mis ei allu HER{152}}sihtravile. Cancer Cell 29, 117–129, doi: 10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: aktiveerimine, reguleerimine, muutmine ja funktsioon. Genes Immun 12, 399–414, doi: 10.1038/gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. Cao Q et al. Neerude F4/80 pluss CD11c pluss mononukleaarsed fagotsüüdid näitavad makrofaagide fenotüüpseid ja funktsionaalseid omadusi tervise ja adriamütsiini nefropaatia korral. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi: 10.1681/ASN.2013121336 (2015). [Avaldatud: 25012165]46. Sheng J et al. Monotsüütidest pärinevate rakkude diskreetne alamhulk tüüpiliste tavapäraste 2. tüüpi dendriitrakkude hulgas võib tõhusalt ristesineda. Cell Rep 21, 1203–1214, doi:10.1016/ j.celrep.2017.10.024 (2017). [Avaldatud: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y & Disis ML Neu antigeennegatiivseid variante saab genereerida pärast neu-spetsiifiliste antikehade ravi neu transgeensetel hiirtel. Cancer Res. 64, 1146–1151 (2004). [Avaldatud: 14871850]48. Moynihan KD et al. Suurte väljakujunenud kasvajate likvideerimine hiirtel kombineeritud immunoteraapiaga, mis hõlmab kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid. Nat Med 22, 1402–1410, doi: 10,1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706]49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K NF-kappa B struktuur, regulatsioon ja funktsioon. Annu Rev Cell Biol 10, 405–455, doi: 10.1146/annurev.cb.10.1102941.1 (10.1102944) . [Avaldatud: 7888182]

Joonis 6: CL264-sisaldavad ISAC-d kutsuvad esile kasvaja kliirensi ksenotransplantaadid ekspresseerivas HER2 söötmes ja T-rakkude poolt vahendatud tuumori kliirensi, immunoloogilise mälu ja epitoobi leviku süngeense kasvaja mudelis. (a) ISAC genereerimiseks kasutatud T785 ja CL264 adjuvantide keemilised struktuurid. ( b ) HCC1954 kasvajarakuliiniga siirdatud NSG hiired randomiseeriti, kui kasvaja maht jõudis 50–75 mm3. Hiirtele manustati üks kord intraperitoneaalselt 5 mg/kg trastuzumabi, trastuzumab T785-ISAC-i või trastuzumab CL264-ISAC-i. Kasvajad koguti 20 tundi pärast manustamist, töödeldi ühe raku suspensiooniks ja analüüsiti voolutsütomeetriaga, et hinnata kasvajasse infiltreeruvate müeloidsete APC-de aktivatsiooni. (cd) NSG või Rag2/IL2rg topeltknockout hiirtele implanteeriti näidatud inimese kasvaja rakuliin ja randomiseeriti, kui kasvaja maht jõudis 50–75 mm3 (HCC1954) või 75–150 mm3 (JIMT{26}}). Hiirtele manustati intraperitoneaalselt 5 mg/kg rituksimabi, trastuzumabi, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab CL264-ISAC või vastavat isotüüpi.ISAC-d, iga 5 päeva järel, kokku 6 ravi. (e) rHER2 ekspressiooni mõõdeti CT26-rHER2 kasvajarakkudel kultuuris enne implanteerimist (vasakpoolse voolu graafik) ja kasvajates üheksa päeva pärast implanteerimist (parempoolne voolugraafik) voolutsütomeetria abil fluorestseeruvalt konjugeeritud rHER2-vastase antikehaga. (punane) või isotüübi kontroll (sinine). (f) Balb/c hiirtele implanteeriti CT26-rHER2 kasvaja rakuliin ja nad randomiseeriti, kui kasvaja maht jõudis 50mm3. Seejärel raviti hiiri intraperitoneaalse süstiga 10 mg/kg hiire anti-rotigaHER2 või hiire anti-roti HER2 CL264-ISAC iga 5 päeva järel, kokku 6 ravi. Näidatud andmed pärinevad ühest katsest 8 hiirega käe kohta ja esindavad 3 katset.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 päeva pärast viimast ravi nakatati neid vanemliku CT26 (vasak külg) ja 4T1 rakuliinidega (parempoolne külg) koos CD4 ja CD8 T-rakkude vähenemisega või ilma (mõlemad n =3). Kontrollidena kaasati varem kasvajata hiired (n=6), keda oli nakatatud vanemate CT26 ja 4T1 rakuliinidega. (ai) Andmed on esitatud individuaalsete katsete kohta, milles osales 3-6 hiirt õlavarre kohta ja need esindavad 1-4 katset, milles igas katses osales vähemalt 3 hiirt. Andmed on näidatud keskmisena SEM-iga ja statistikat *P-ga<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT et al. FcgammaRIIa ristvestlus TLR-idega, IL-1R ja IFNgammaR moduleerivad selektiivselt tsütokiinide tootmist inimese müeloidrakkudes. Immunobiology 220, 193–199, doi:10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS & Albina JE Ly6G-spetsiifilise monoklonaalse antikeha kasutamine neutrofiilide arvu vähendamiseks hiirtel. J Leukoc Biol 83, 64–70, doi:10.1189/jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993]52. Broz ML et al. Kasvaja müeloidse sektsiooni lahkamine paljastab haruldasi aktiveerivaid antigeeni esitlevaid rakke, mis on kriitilised T-rakulise immuunsuse jaoks. Cancer Cell 26, 938, doi:10.1016/ j.ccell.2014.11.010 (2014).53. Spranger S, Dai D, Horton B & Gajewski TF kasvajas elavad Batf3 dendriitrakud on vajalikud efektor-T-rakkudega kaubitsemiseks ja adoptiivseks T-rakkude teraapiaks. Cancer Cell 31, 711–723 e714, doi: 10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER et al. Pallaadiumipõhine massisildi rakkude vöötkood topeltfiltrimise skeemi ja üherakulise dekonvolutseerimisalgoritmiga. Nat Protoc 10, 316–333, doi:10.1038/nprot.2015.020 (2015). [Avaldatud: 25612231]