Konserveeritud pikk mittekodeeriv RNA, GAPLINC, moduleerib immuunvastust endotoksilise šoki ajal

Lisateabe saamiseks võtke palun ühendustdavid.wan@wecistanche.com

Tähtsus

Põletikku on suures osas uuritud valke kodeerivate geenide kontekstis. Hiljutised uuringud on avastanud IncRNA-d kui olulised immuunsuse regulaatorid. Nende geenide funktsionaalne iseloomustamine jääb aktiivseks uurimisvaldkonnaks. Selles uuringus tuvastame GAPLINC kui funktsionaalselt konserveeritudIncRNAinimeste ja hiirte vahel. GAPLINC-i ammendumine põhjustab otseste immuunvastuse geenide ekspressiooni paranemistNF-kBsihtmärgid. Hämmastavalt täheldame, et Gaplinci knockout hiired näitavad resistentsust LPS-i indutseeritud endotoksilise šoki suhtes ja leiame, et põletikuliste geenide põhiekspressioon takistab punktide moodustumist, et kaitsta mitme organi puudulikkuse ja surma eest. Need leiud mõjutavad sepsise ravi, kus uued IncRNA-dele suunatud ravimeetodid võivad anda väärtuslikku teavet põletiku mõistmiseks ja patsientide tulemuste parandamiseks.

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

FG 1. makrofaagispetsiifiliste identifitseerimine ja iseloomustamineIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) RNA-Seq analüüsGAPLNCekspressioon monotsüütidest makrofaagideks diferentseerumisel näidatud ajahetkedel. GAPLINC ekspressioon on esitatud koopiatena raku kohta (FPKM. (D) Soojuskaart esindab geeniekspressiooni kohandatud nanostringi paneelilt, mis näitab 10 parimat erinevalt ekspresseeritud InciNA-d, mis võrdlevad monotsüüte makrofaagidega inimese primaarsed rakud ja THP-1 rakud. Nanotringi andmed viidi läbi bioloogilistes duplikaatides. (E) Granulotsüütide-monotsüütide eellasrakkude skeem, mis tekitab kaks erinevat populatsiooni: 1) MDDC-d ja 2) MDM-id. UCSC genoomi brauseri rada kuvab RNA-Seq lugemisi monotsüütidest, makrofaagidest ja dendriitrakkudestGAPLINClookus. () Tuuma (valge) ja tsütoplasma (hall) fraktsioonidest puhastatud RNA-de qPCR analüüs MDM-ides (MDM-süsteemide erinevatest polüsoomifraktsioonidest eraldatud Russi G qPCR analüüs (10–50-protsendiline sahharoosigradient, SW41, 40 K p/min, ~ jaoks). 1,5 h).

Hiljutised uuringud on tuvastanud imetajate genoomides tuhandeid pikki mittekodeerivaid RNA-sid (ncRNA-sid), mis reguleerivad geeniekspressiooni erinevates bioloogilistes protsessides. Kuigi IncRNA-sid on tuvastatud mitmesugustes immuunrakkudes ja need on seotud immuunvastusega, jääb enamiku bioloogiline funktsioon ja mehhanism uurimata, eriti sepsise korral. Siin tuvastame hdRNA - mao adenokartsinoomi ennustava pika intergeenilise mittekodeeriva RNA (GAPLINC) - rolli, mida varem iseloomustati selle rolli tõttu vähis, nüüd kaasasündinud immuunsuse, makrofaagide ja LPS-i indutseeritud endotoksilise šoki kontekstis. Inimeste ja hiirte makrofaagide transkriptoomiline analüüs näitab, et GAPLINC on konserveerunud IndRNA, mis ekspresseerub kõrgelt pärast makrofaagide diferentseerumist. Põletikulise aktivatsiooni korral reguleeritakse GAPLINC kiiresti alla. GAPLINC-i ammendunud makrofaagid näitavad algtasemel põletikuliste geenide suurenenud ekspressiooni, samas kui GAPLINC-i üleekspressioon pärsib seda vastust. Kooskõlas GAPLINC-i ammendunud rakkudega näitavad Gaplinc knockout hiirtel põletikuliste geenide kõrgendatud baastasemeid ja nad näitavad vastupanuvõimetLPS-indutseeritudendotoksiline šokk. Mehhaaniliselt on ellujäämine seotud tuuma NF-xB suurenenud tasemega Gaplinci knockout hiirtel, kes juhivad sihtgeenide põhiekspressiooni, mis aktiveeritakse tavaliselt ainult pärast põletikulist stimulatsiooni. Näitame, et see immuunvastuse geenide aktiveerimine enne LPS-i esilekutsumist põhjustab verehüüvete moodustumist, mis kaitseb Gaplinci knockout hiiri mitme organi puudulikkuse ja surma eest. Üheskoos tuvastavad meie tulemused GAPLINCi kui põletiku negatiivse regulaatori varem tundmatu funktsiooni. ja paljastada selle lncRNA võtmeroll endotoksilise šoki moduleerimisel.

Joonis 2. GAPLINC on põletiku negatiivne regulaator ja sõltub Nf-sB signaalimisest. Inimese PBMC-dest eraldatud ja makrofaagideks diferentseeritud monotsüüdid transfekteeriti kontroll- või GAPLINC siRNA-ga. (A)RNA-järjestuse analüüsGAPLINC kd-l või kontroll-siRNA MDM-idel. RNA-Seq viidi läbi bioloogilistes duplikaatides. Tulemused on kujutatud vulkaani joonisel. Oluliselt ülesreguleeritud geenid, mille kordamine on suurem kui 2 või sellega võrdne, on punases kastis. (6) GO-Term analüüs oluliselt ülesreguleeritud geenide kohta. (C) Soojuskaart esindab GAPLINC kd-ga ülesreguleeritud parimate immuunsüsteemiga seotud geenide geeniekspressiooni. RNA-Seq andmed viidi läbi bioloogilistes duplikaatides. (D) GAPLINC isovormid MDM-ides määrati Nanopore-põhise R2C2 sekveneerimisega. Nanopore'i sekveneerimise andmed viidi läbi bioloogilistes duplikaatides (toored andmed on saadaval aadressil SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Tabel, mis näitab iga GAPLINC isovormi lugemiste arvu ja protsenti. (F) Kahesuunaline vektor, mis ekspresseerib GFP-Zetotsiini ühel küljel ja GAPLINC teisel küljel. (G ja H) GAPLINC ekspressiooni qPCR analüüs THP-1 rakkudes, mis ekspresseerivad ektoopilist GAPLINC või tühja vektori kontrolli. IL6 tasemed kvantifitseeriti pärast stimuleerimist LPS-ga (200 nal ml) 6 tundi; andmed koondati kolmest sõltumatust katsest.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), GAPLINCi U qPCR analüüs MDM-ides (n=3) DMSO või BAY-ga-7082 (10 μM) eeltöödeldud, millele järgnes LPS-i stimuleerimine (200 ngmL) 6 tunni jooksul. Andmed ühendati kolmest sõltumatust katsest. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepsis on eluohtlik haigus, mis on põhjustatud organismi liigsest reageerimisest infektsioonile, mis võib kiiresti viia mitme organi puudulikkuseni ja surmani. Immuunsüsteem on nakkuse eest kaitsmisel hädavajalik; kontrollimatul aktiveerimisel võivad aga olla peremehele tõsised tagajärjed. Haiguste tõrje ja ennetamise keskuste andmetel on igal kolmandal haiglas surnud patsiendil sepsis (1). ja ometi ei mõista me endiselt surmaga lõppevaid molekulaarseid mehhanisme. Sepsise ravi kliinilised võimalused piirduvad vedeliku, antibiootikumide ja toetava raviga ning on püsinud aastakümneid suures osas muutumatuna. Kuigi varajane diagnoosimine ja kiire ravi on sepsise tulemusi parandanud (2), on kriitilise tähtsusega uute ravimeetodite väljatöötamine. Kuigi sepsise potentsiaalsete terapeutiliste sihtmärkide uurimiseks on tehtud geeniekspressiooniuuringuid, jäävad need sihtmärgid suures osas iseloomustamata (3). Oleme tuvastanud pika mittekodeeriva RNA (lncRNA), millel on roll immuunvastuse ja endotoksilise šoki kontrollimisel, mis pakub võimalusi uute ravimite väljatöötamiseks sepsise sihtmärgiks.

Tulemus

Joonis 3. GAPLINC on hiirtel konserveerunud ja reguleerib reaktsiooni endotoksilisele šokile. (4) GAPLINC on sünteesis konserveeritud. GAPLINC asub inimestel Chr18-l ja hiirtel Chr17-l valku kodeerivate geenide Dlgap1 ja Gift vahel. Dlgapil ei väljendata keelesmakrofaagid. (B) MCA näitab Gaplinci tasemete jaotumist erinevates immuunrakkude tüüpides (BM). (C) Gaplinci ekspressiooni qPCR analüüs B-rakkudes ja BMDM-des; need andmed (keskmine ± SD) esindavad kolme sõltumatut katset, (D) Gapingu ekspressiooni qPCR analüüs LPS-iga (200 na/ml) stimuleeritud BMDME-s 6 tundi; need andmed (keskmine ± SD) esindavad kolme sõltumatut katset. (E) Gaplinci lookuse skeem enne ja pärast CRISPRCas9 vahendatud deletsiooni. Katkendjooned näitavad ligikaudset kustutamise piirkonda. Geel esindab genoomsete andmete PCR-i amplifikatsiooni. Amplikoni pikkusi võrreldakse WT ja Gaping KO hiirtel, (F) Gaplinci ekspressiooni qPCR analüüs WT ja Gaplinc-KO BMDM-ides, kasutades praimerite kombinatsiooni, et tuvastada Gaplinci transkripti ekson1, ekson2 ja eksoneid hõlmavaid piirkondi; need andmed (keskmine ± SD) esindavad kolme sõltumatut katset. (G)RNA-Seq analüüs WT ja Gaplinc KO hiirte BMDM-des (n =3). Tulemused on kujutatud vulkaani joonisel. Oluliselt ülesreguleeritud geenid, mille kordamine on suurem või võrdne 2, on näidatud punaselt. (H) GO-Term analüüs oluliselt ülesreguleeritud geenide kohta. (I ja J) WT ja Gaplinc KO hiirte ellujäämisandmed on näidatud vastusena E. coli LPS-le (5 mg/kg/hiirte kohta) (n =6 kuni 10). Erinevuste statistiline test loendati log-rank (Mantel-Cox) testi abil. "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Kuna lncRNA ekspressioon võib reguleerida immuunvastust, mõjutades immuunrakkude diferentseerumist ja nende vastavat funktsiooni (4-7), soovisime uurida ncRNA-de rolli makrofaagides. Makrofaagid on olulised kaasasündinud immuunrakud, mida saab tuletada monotsüütidest ja mis on kriitilise tähtsusega patogeenide äratundmisel Toll-like retseptorite (TLR) kasutamise kaudu. Aktiveerimisel. TLR-id käivitavad keerulisi signaaliülekandeteid, mis aktiveerivad peamised transkriptsioonifaktorid, nagu NF-kB, mis viib sadade immuunvastuse geenide transkriptsioonini (8).

Makrofaagide diferentseerumise ja funktsiooniga seotud IncRNA-de tuvastamiseks viisime läbi RNA sekveneerimise (RNA-Seq) nii inimese primaarsetes monotsüütidest pärinevates makrofaagides (MDM) kui ka monotsüütilises rakuliinis THP-1s (joonis lA ja SI lisa. joonis S1). Tuvastasime mao adenokartsinoomi ennustava pika geenidevahelise mittekodeeriva RNA (GAPLINC), mis on monotsüütide ja makrofaagide diferentseerumise ajal kõige rohkem reguleeritud IncRNA (joonis 1B). GAPLINC tasemed olid tuvastatavad 1. päeval ja tõusid ~ 300 koopiani raku kohta (joonis 1C). Kasutades RNA-profileerimise tehnoloogiat (nCounter, Nanostring), kinnitasime GAPLINC-i üheks 10 parimaks diferentseeritud primaarsetes MDM-ides ja THP{10}}-des ekspresseeritud mRNA-de seas (joonis 1D). Samuti kinnitasime, et GAPLINC ekspresseerub tugevalt MDM-ides, kuid ei ekspresseerita tihedalt seotud rakutüüpi monotsüütidest pärinevates dendriitrakkudes (MDDC) (joonis 1E), mis viitab sellele, et GAPLINCi ekspressioon on rakutüübi spetsiifiline. Tehes rakkude fraktsioneerimise katse ja mõõtes GAPLINC taset makrofaagide tsütoplasmaatilistes ja tuumasektsioonides qPCR abil, leidsime, et GAPLINC paikneb valdavalt tsütosoolis, võrreldes CD14, tsütoplasmaatilise mRNA ja NEAT1, tuuma IncRNA-ga (joonis 1). 1F). See on kooskõlas vähirakkude leidudega, kus GAPLINC paikneb peamiselt tsütoplasmas (9). Tagamaks, et GAPLINC ei kodeeriks, viisime läbi polüsoomide profileerimise, meetodi, mida kasutatakse analüüsimaks, kas geen transleeritakse aktiivselt valguks. Erinevalt CD14-st ei leitud kõrge polüsoomisisaldusega fraktsioonis ei NEATI-t ega GAPLINC-i, mis viitab sellele, et GAPLINC-i ei tõlgita (joonis 1G),

Joonis 4. Gaplnc KO reguleerib IRG-sid üles ja näitab algtasemel alasti suurenenud p65 taset. (A) Tsütokiinide tase WT ja Gaplinc KO hiirte seerumis basal.n=4 kuni 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Järgmisena uurisime GAPLINC-i vaigistamise mõju makrofaagide diferentseerumisele. Kuna GAPLINC tasemed diferentseerumise ajal tõusid, oletasime, et GAPLINC knock-down (KD) mõjutab diferentseerumisega seotud geene. Kasutades ühendatud väikest segavat RNA-d (siRNA), saavutasime primaarsetes MDM-ides GAPLINC-i 55–65 protsenti kd (SIlisa, joonis S2). Tegime RNA-Seq ja tuvastasime mitmed geenid, mis olid GAPLINC kd korral düsreguleeritud (joonis 24). Kinnitasime parimad tabamused nanostringi abil (SI lisa, joonis S3). Geeniontoloogia (GO) rikastamise analüüs näitas, et vastupidiselt meie esialgsele hüpoteesile olid immuunvastuse geenid märkimisväärselt üleesindatud GAPLINC kd-ga ülesreguleeritud geenides, mitte makrofaagide diferentseerumisega seotud geenides. (joonis 2B). Eelkõige hõlmavad GAPLINC-KD rakkudes erinevalt ekspresseeritud geenid põletikueelseid tsütokiine ja kemokiine (IL6, CXCL10 ja TNFSF10), IFN-stimuleeritud geene (ISG) (IFIT2 ja RSAD2) ning guanülaadi siduvaid valke (GBP) (GBP3 ja GBP5). (Joon. 2C ja SI lisa. Joon. S4). Kontrollimaks, et GAPLINC kd ei mõjutanud makrofaagide diferentseerumist. CD11B.CD16 ja CD14 tasemeid mõõdeti kontroll- ja signaaliga töödeldud makrofaagides ning need leiti olevat sarnased (SI lisa. Joonis S5). Järgmisena kasutasime täiendavat kd-meetoditCRISPRinhibeerimine (CRISPRi), et sihtida transkriptsiooni alguskohta GAPLINi abil, kasutades kolme erinevat juht-RNA-d (gRNA-d) THP{0}} rakkudes, mida on stimuleeritud forbool12-müristaat13-atsetaadiga (PMA). Me saavutasime GAPLINCi üle 80 protsendi kd ja jällegi täheldasime põletikueelse tsütokiini IL6 suurenenud ekspressiooni, kui GAPLINC on algtasemel maha kukkunud (SI lisa. Joon. S6 A ja B). Huvitav on see, et pärast lipopolüsahhariidi (LPS) aktiveerimist olid IL6 tasemed kontroll- ja GAPLINC kd THP-1 rakkudes sarnased (SIlisa, joonis S6C). Kuna algtasemed erinevad, väheneb GAPLINC eemaldamisel IL6 üldine kordade induktsioon. (S7 lisa, joon. S6D).

Kuna GAPLINC kd põhjustas immuunvastuse geenide ülesreguleerimise, genereerisime GAPLINC-i üleekspresseeriva THP-1 rakuliini, et teha kindlaks, kas see vahendab vastupidist efekti. Kaua loetud järjestusandmete kasutamine. tuvastasime MDM-ides ekspresseeritud GAPLINC domineerivad isovormid (joonis 2D). Kõige rikkalikum isovorm, mis vastab võrdlusjärjestuse (RefSeq) geeni annotatsioonile, lisati meie konstruktsiooni (joonis 2E). Me kasutasime kahesuunalist promootorit sisaldavat lentiviiruse vektorit, et juhtida roheline fluorestsentsvalk (GFP) / Zeocin ja GAPLINC paralleelselt (joonis 2F). Kinnitasime qPCR abil, et GAPLINC ekspresseeriti THP-1-des stabiilselt võrreldes kontrolliga (joonis 2G). GAPLINC üleekspressioon vähendas IL6 RNA tasemel võrreldes kontrolliga pärast stimuleerimist LPS-iga, mis on gramnegatiivsete bakterite komponent (joonis 2H). Need tähelepanekud viitavad sellele, et GAPLINC toimib põletikulise vastuse negatiivse regulaatorina.

Järgmisena uurisime vastusena põletikule GAPLINC taset primaarsetes MDM-ides. LPS-i stimuleerimisel avastasime, et GAPLINC oli kiiresti alla reguleeritud (joonis 2I). Lisaks näitame qPCR-i kasutades, et GAPLINC on ka pärast aktiveerimist erinevate funktsioonidega alla reguleeritud.TLRligandid (SI lisa, joonis S7A). Positiivse kontrolli põletikuliste geenide TNF-a, IL6 ja CCL5 esilekutsumine kinnitati (SI lisa, joonis S7B). Need andmed viitavad sellele, et GAPLINC ekspressiooni tuleb pärast stimuleerimist vähendada, et optimaalne põletikulise geeni indutseerimine toimuks. Et hinnata NF-kB rolli GAPLINC ekspressiooni kontrollimisel, töödeldi MDM-e dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) või NF-B inhibiitoriga BAY11-7082,

millele järgnes 6-tunnine stimuleerimine LPS-ga.BAY11-7082-ravitud MDM-ide korral oli GAPLINC-i allareguleerimine kontrolliga võrreldes halvenenud (joonis 2/). mis viitab sellele, et GAPLINC reguleerimine sõltub NF-KB signaalimisest. Positiivse kontrolli põletikuliste geenide TNF- ja IL6 indutseerimine LPS-i stimuleerimisel kinnitati (SIlisa, joonis, S7C). Et mõista, kuidas GAPLINC-i reguleeritakse, kasutasime transposaasile ligipääsetava kromatiini analüüsi, kasutades MDM-ides sekveneerimist (ATAC-seq). hinnata GAPLINC lookuse kromatiini kättesaadavust. Leidsime, et GAPLINC transkribeeritakse aktiivselt puhkeolekus makrofaagides, kuid suletakse pärast LPS-i stimuleerimist tihedalt (joonis 2K), mis viitab sellele, et GAPLINC on reguleeritud transkriptsiooni tasemel.

Uurida GAPLINCi säilimist inimeste ja hiirte vahel. püüdsime tuvastada sünteetilisi lookusi, milles geenid on positsiooniliselt konserveerunud samade kahe valku kodeeriva geeni vahel. millele järgneb funktsionaalse säilivuse hindamine. Siin näitame, et Gaplinc on positsiooniliselt konserveerunud, leides transkripti geenide Dlgap1 ja TgifI vahel (joonis 3A). Rakutüübi spetsiifilisuse kinnitamiseks kasutasime hiirerakkude atlast (MCA)

(10), et hinnata transkriptsioonitasemeid luuüdi immuunrakkudes (BM) ja leitud, et see ekspresseerub kõige rohkem makrofaagides, madalama ekspressioonitasemega neutrofiilide eellasrakkudes (joonis 3B). Järgmiseks, et teha kindlaks, kas ekspressioonimustrid säilisid makrofaagide diferentseerumise ajal nii inimestel kui ka hiirtel, teostasime RNA-Seq, milles võrreldi BM-rakke luuüdist pärinevate makrofaagidega (BMDM), lõpetasime de novo transkripti kokkupaneku ja leidsime, et hiire Gaplinci tase tõusis pärast diferentseerumist. (SI lisa, joon. S8A). Me kinnitasime selle qPCR abil, võrreldes Gaplinci taset BM-rakkudes BMDM-idega (joonis 3C). Võrreldav inimese GAPLINCiga. hiire Gaplinc on LPS-stimuleeritud BMDM-ides kiiresti alla reguleeritud (joonis 3D). Kontrollina kinnitasime põletikuliste geenide The-a ja I6 esilekutsumist (SI lisa. Joon. S8B). Hiire Gaplinc reguleeritakse kiiresti alla ka pärast aktiveerimist erinevate TLR ligandidega. Samuti kinnitati positiivse kontrolli geenide 116 ja Ccl5 esilekutsumine (SI lisa, joonis S8C).

Kasutades CRISPR-i, genereerisime Gaplinci knockout (KO) hiire, millest eemaldati ekson I ja suurem osa esimesest intronist (joonis 3E). Chaplin KO hiired arenesid normaalselt ja neil ei olnud ilmseid arengudefekte. Gapline'i deletsioon kinnitati genoomse DNA PCR-ga amplifikatsiooniga metsiktüüpi (WT) ja Gaplinc KO hiirtel, amplikoni suurus ~1300 aluspaari WT ja ~500 aluspaari Gaplinc KO hiirtel (joonis 3E). Täielik genotüpiseerimise strateegia WT ja Gaplinci KOde kinnitamiseks on esile tõstetud SI lisa, joonis S9. Samuti kinnitasime qPCR abil Gaplinci puudulikkust BMDM-ides (joonis 3F). Et hinnata, kas Gaplinci puudulikkus mõjutas diferentseerumist, värvisime WT ja Gaplinc-KO BMDM-id CD11B ja F4/80 jaoks; värvimismustrid olid sarnased, mis viitab normaalsele makrofaagide diferentseerumisele (SI lisa, joonis S104). Et hinnata, kas Gaplinc KO häiris makrofaagide funktsiooni, võrdlesime fagotsütoosi aktiivsust WT ja Gaplinc-KO BMDM-des ning erinevusi ei leidnud (SI lisa, joonis S10B).

Gaplinci puudulikkuse globaalse mõju hindamiseks makrofaagides teostasime RNA-Seq WT ja Gaplinc-KO BMDM-idel; mõlemad olid töötlemata ja LPS-i stimuleeritud 6 tundi. Gaplinc-KO BMDM-ides oli 23 geeni (näidatud punasega. Joonis 3G) ekspressioon algtasemel oluliselt ülesreguleeritud. Nende geenide hulka kuuluvad põletikueelsed tsütokiinid ja kemokiinid (Il6.l1-a. I1-8 ja Cxd10), ISG-d (Ifitlbl1), GBP-perekonna liikmed (Gbp5 ja Gbp0) ja rakupinna markerid, mis on spetsiifilised aktiveeritud makrofaagide jaoks (Cd69). GO analüüs kinnitas, et immuunvastusega seotud geenid on algtasemel Gaplinc-KO BMDM-ides üleesindatud (joonis 3H). Need geenid on tavaliselt LPS-i stimuleerimise järel üles reguleeritud (SI lisa. Joon. S11). Sarnaselt meie inimuuringutest saadud andmetega viitavad need andmed selleleGAPLINCon funktsionaalselt konserveeritud liikide lõikes, et põhiliselt kontrollida põletikulise reaktsiooni geenide (IRG) ekspressiooni. Pärast LPS-i stimuleerimist ülesreguleeritud geenides WT ja Gaplinc-KO BMDM-ide (andmestik S1) vahel suuri erinevusi ei olnud.

Arvukad uuringud on näidanud IncRNA-de võimet reguleerida naabergeenide transkriptsiooni (11). Sellisena uurisime Gaplinci võimalikke cis-reguleerivaid rolle, kuna selle naabergeen Tgif1 on varem olnud seotud makrofaagide aktiveerimise moduleerimisega (12). Kasutades meie RNA-Seq andmeid, kinnitasime, et GaplincKO BMDM-ides ei mõjutanud Tgifl-i ekspressioon T-rakkude suhtes (SIAppendir.Joon.S124). Lisaks kinnitasime qPCR-iga, et Tgifl oli Gaplinc-KO BMDM-ides (SI lisa, joonis S12B) muutumatu. Järgmisena uurisime võimalust, et Gaplinci lookuse katkestamine võib eemaldada olulise reguleeriva elemendi, näiteks võimendaja. Gaplinci lookuse transkriptsiooniliselt aktiivsete piirkondade hindamiseks kasutasime WT BMDM-ide ATAC-seq andmeid (13). Me ei tuvastanud signaale Gaplinci deletsioonipiirkonnas, vaid ainult neid, mis vastavad Gaplinci promootorile (SI lisa. Joonis S13). Need andmed viitavad ühiselt sellele, et IRG-de ülesreguleerimine Gaplinci puudulikkuse korral ei ole tingitud mõjust naabergeenidele ega regulatiivse elemendi eemaldamisest.

Kuna Gaplinc KO BMDM-ides reguleerib IRG-de ekspressiooni põhitingimustes üles, tahtsime järgmisena kutsuda Gaplinc KO loomi in vivo esile, et jälgida peremeesorganismi vastuse erinevusi. Kasutasime "endotoksilise šoki" mudelit. milles Escherichia coli LPS süstiti intraperitoneaalselt (ip) WT ja Gaplinc KO hiirtele, et mõõta erinevusi ellujäämises. Annuses 5 mg/kg/hiir. WT hiirtel oli 2 päeva pärast elulemus 0 protsenti (joonis 30. Siiski jäi 100 protsenti Gaplinc KO hiirtest ellu, mis tähendab, et Gaplinc KO hiirtel on resistentsus LPS-i indutseeritud endotoksilise šoki suhtes (joonis 31). , täheldatakse olulisi temperatuurierinevusi WT ja Gaplinci puudulikkusega hiirte vahel (joonis 3). Isegi kui kasutatakse palju suuremat LPS-i annust 20 mg/kg, on Gqplinci puudulikkusega hiirtel oluline ellujäämise eelis (joonis 3K). , näitavad need andmed, et Gaplinc mängib olulist rolli immuunvastuse reguleerimisel in vivo.

Meie inimuuringutest teame, et GAPLINC suudab immuungeene algtasemel reguleerida. Kuigi pärast põletikulist aktiveerimist tsütokiinide ekspressioonis erinevusi ei ole, on vastuse ulatus erinev, kuna algtaseme tasemed erinevad. Seetõttu hindasime nende ellujäämise erinevuste paremaks mõistmiseks in vivo tsütokiini ekspressiooni muutusi algtasemel. Kasutasime multipleksitud tsütokiini massiivi, et mõõta samaaegselt immuunreaktsiooni, sepsise ja vähiga seotud biomarkereid. Algtasemel peamised immuungeenid, sealhulgas MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. ja M-CSF oli oluliselt suurenenud Gqplinc KO hiirte seerumis võrreldes WT-ga (joonis 44). Need tsütokiinid on seotud rakkude värbamisega: voolutsütomeetriat kasutades kinnitasime aga, et neutrofiilide, T-rakkude, B-rakkude, eosinofiilide, monotsüütide ja makrofaagide protsent oli algtasemel võrreldav WT ja Gaplinc KOmice'i vahel (SI lisa, joonis S14). . Huvitaval kombel olid need protsendid võrreldavad ka LPS-i järgsete väljakutsetega 6 h ja 18 h ajapunktides (SI lisa, joonised S15 ja S16). Lisaks ei näidanud WT ja Gaplinc KO hiirte seerum, mida testiti sepsise kliiniliste tunnuste, sealhulgas laktaadi ja C-reaktiivse valgu (CRP) suhtes (S7 lisa, joonis S17), erinevusi.

Kuna MDC või IL{0}} (joonis 44) kõrgenenud tasemed on varem iseloomustatud põletikku soodustavate tsütokiinide moduleerimise kaudu endotoksilise šoki eest kaitsva rolliga (14, 15), uurisime järgmiseks põletikueelsete tsütokiinide tasemete erinevusi. , sealhulgas l6, Il1-, l1- ja Cxcl10, pärast põletikulist aktivatsiooni. Kuigi WT ja Gaplinc KO tasemed on samad nii transkripti (joonis 4B) kui ka valgu tasemel (SI lisa, joonis S18A-C), on muutuse ulatus palju väiksem (joonis 4C), mis viitab sellele, et see vähenenud volt. muutus võib mängida rolli Gaplinc KO hiirte vastuvõtlikkuse ennetamisel LPS-i suhtes. indutseeritud endotoksiline šokk.

Koos ohjeldamatu tsütokiinide tootmisega. endotoksilise šoki teine ​​kliiniline aspekt, mis võib põhjustada suremust, on verehüüvete teke väiksemates veresoontes, mis põhjustab mitme organi puudulikkust (16.17). Selle lahendamiseks analüüsisime LPS-i ip.-ga töödeldud hiirte seerumit, et hinnata hüübimiserinevusi. Kasutades aktiveeritud osalise tromboplastiini aja (a) testi, mis mõõdab hüübimise moodustumise aega, avastasime, et WT hiirtel on LPS-i nakatamise korral Gaplinc KO hiirtega võrreldes oluliselt pikem aeg (joonis 4D). Pikenenud aPTT ajad viitavad sellele, et WT hiired on juba läbinud koagulatsiooni ja ammendunud peamised hüübimisfaktorid, nii et testimise, hüübimise algatamise ja mõõtmise ajal on trombide moodustumise aeg pikenenud. Andmed viitavad sellele, et erinevused ellujäämises LPS-ga nakatumise korral on tingitud WT-hiirte suurenenud hüübimisest, mis põhjustab võimaliku elundipuudulikkuse ja surma.

Järgmisena püüdsime mehhaaniliselt mõista, kuidas Gaplinc seda efekti vahendab. Esiteks kinnitasime selle lokaliseerimist ja analüüsisime qPCR abil Gaplinci taset nii BMDM-ide tsütoplasmaatilistes kui ka tuumasektsioonides. Sarnane inimese GAPLINCiga. hiire Gaplinc oli valdavalt tsütoplasmaatiline (ST lisa, joonis S19). Järgmisena viisime läbi RNA-d siduvate valkude modifitseeritud tervikliku identifitseerimise (ChIRP), mis oli ühendatud massispektromeetria ja väikese RNA sekveneerimisega, kuna varem on näidatud, et GAPLINC interakteerub mikro-RNA-dega (18). Me ei täheldanud koostoimeid varem tuvastatud sihtmärkidega (SIlisa, joon. S20).

Kuna me ei suutnud tuvastada otsest sidumispartnerit, keskendusime inimeste ja hiirte vahelisele konserveerunud funktsioonile, täpsemalt konserveerunud geenidele, mida mõjutasid meie inimese GAPLINC kd ja hiire Gaplinc KO uuringud, millest enamik on NF-kB regulaatorid (joonis 4E). ). LPS-i poolt aktiveeritud NF-KB kõige levinum vorm on p65:p50 heterodimeer ja üheksast konserveerunud geenist seitse on otsesed p65 sihtmärgid (19). Kasutasime natiivset RNA immuunsadet (RIP) ja näitasime, et Gaplinci ja p65 vahel puudub otsene interaktsioon (S7 lisa, joonis S21). Klassikalise NF-KB signaaliraja korral paiknevad p6:p50 subühikud tsütosoolis ja on seotud. inhibeerivaks I-kB- puhkerakkudes. Aktiveerimisel I-KB- laguneb, võimaldades p65:p50 ümber paigutada tuuma ja aktiveerida sihtgeenid (20). WT ja Gaplinc-KO BMDM-ides mõõtsime I-kB-de lagunemist Western blot abil ja erinevusi ei leidnud (joonis 4F). Järgmisena võrdlesime p65 kogutaset BMDM-ides. Meie RNA-Segi andmetes on p65 (RelA) transkriptsioonitasemed nii WT kui ka Gaplinc-KO BMDM-i põhi- ja LPS-stimuleeritud tingimustes võrreldavad (SI lisa, joonis S22). Kui aga võrdlesime p65 valgu kogutaset Western blot meetodil, leidsime, et Gaplinc-KO rakkudes on WT-ga võrreldes oluliselt suurenenud p65 tase (joonis 4G). See viitab sellele, et Gaplinc reguleerib p65 kogutaset translatsiooni tasemel. Lisaks hindasime p65 taset tsütoplasmaatilises ja tuumasektsioonis ning leidsime, et tuuma p65 on Gaplinci puudulikkusega rakkudes WT-ga võrreldes rohkem (joonis 4H). Need andmed kokku viitavad GAPLINC-i mehaanilisele rollile kriitiliste IRG-de aktiveerimisel.

Arutelu

Siin oleme tuvastanud GAPLINC kui konserveerunud tsütosoolselt ekspresseeritud IncRNA inimestel ja hiirtel, mis kontrollivad põletikulist geeniekspressiooni NF-xB reguleerimise kaudu. Võrreldes teatatud tsütosoolsete IncRNA-dega, mis mõjutavad translatsiooni efektiivsust valgu ekspressiooni või ribosoomikoostu moduleerimise kaudu (21-23), leiame, et Gapline aitab tsütosoolselt kaasa p65 translatsioonivõimele; otsese või kaudse vastasmõju mehhanism tuleb aga veel kindlaks teha. Meie leiud annavad ülevaate sellest, kuidas funktsionaalselt konserveerunud IncRNA reguleerib immuunvastust ja pakuvad uurimisvõimalusi endotoksilise šoki raviks kasutatavate ravimite väljatöötamiseks.