Sitoglusiidi kui potentsiaalse naha pigmentatsiooni vähendava ainena tuvastamine võrgufarmakoloogia kaudu

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1 Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 ja Qinghai Zeng 1

Paljud traditsioonilised Hiina ravimid (TCM) koosnaha valgendamineomadused on registreeritud Ben-Cao-Gang-Mu ja infolk retseptides ning mõned kirjandused kinnitavad, et nende ekstraktidel on potentsiaali pärssida.pigmentatsioon. Siiski ei ole süstemaatilised uuringud tuvastanud potentsiaalsete toimeainete spetsiifilisi regulatiivseid mehhanisme. Selle uuringu eesmärk oli sõeluda nahka pärssivate TCM-ide koostisosipigmentatsioonvõrgustiku farmakoloogiasüsteemi kaudu ja uurida selle aluseks olevaid mehhanisme. Tuvastasime 14 TCM-ist 148 potentsiaalset toimeainet ja topoloogiliste parameetrite keskmise "kraadi" põhjal leidsime viis parimat TCM-i (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ja Paeoniae Radix). kõige tõenäolisemalt põhjustasidnaha valgendaminepõletikuvastaste protsesside kaudu valiti. Sitoglusiid, kõige levinum koostisosa viie peamise TCM-i hulgas, inhibeerib melanogeneesi inimese melanoomirakke (MNT1) ja hiire melanoomirakke (B16F0) ning vähendab naha taset.pigmentatsioonsebrakala puhul. Peale selle näitasid mehhaanilised uuringud, et sitoglusiid on võimeline allareguleerimatürosinaas(TYR) ekspressiooni, inhibeerides ERK ja p38 radu ning inhibeerides TYR aktiivsust. Need tulemused näitavad, et võrgufarmakoloogia on tõhus vahend nahka valgendavate omadustega looduslike ühendite avastamiseks ja nende võimalike mehhanismide kindlaksmääramiseks. Sitoglusiid on uudne nahka valgendav toimeaine, millel on kaks reguleerivat toimet, mis pärsibTYRväljendus ja tegevus.

Klõpsake selleksCistanche DHT ekstrakt naha valgendamiseks

Sissejuhatus

Melaniin mitte ainult ei määra inimese naha, silmade ja juuste värvi, vaid mängib võtmerolli ka kamuflaažis, miimikas, sotsiaalses suhtlemises ja kaitses ultraviolettkiirte eest. Kui aga melaniini toodetakse üle ja jaotub epidermises ebanormaalselt, põhjustab see varieeruvust. seisundid, nagu tedretähnid ja melasma, mis võivad negatiivselt mõjutada inimese tajutavat ilu ja sotsiaalset enesekindlust [1]. Melaniin on L-türosiini lõppprodukt pärast ensümaatiliste reaktsioonide mitut etappi ja sünteesitakse melanotsüütide melanosoomides [2]. Nahas paiknevad melanotsüüdid epidermise basaalkihis ning võivad toota ja kanda küpseid melanosoome keratinotsüütidesse, põhjustades seeläbi nahapigmentatsioon [3]. TYRon melaniini tootmise peamine kiirust piirav ensüüm [4] ja mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor (MITF) on peamine transkriptsioonifaktor, mis reguleerib TYR-i transkriptsiooni ekspressiooni [5].

Hiljuti on uuringud leidnud, et põletikulised reaktsioonid mängivad olulist rolli melanogeneesi reguleerimisel [6]. Näiteks Langerhansi rakkude, dendriitrakkude ja epidermise keratinotsüütide poolt toodetud IL-18 võib TRP{{2 ekspressiooni ülesreguleerida. }} (türosinaasiga seotud valk 1) ja TRP-2 (türosinaasiga seotud valk 2), aktiveerides p38/MAPK (mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaas) ja PKA (valgukinaas A) rada, soodustades seega melanogeneesi[7, 8 ]. TNF-reguleerib B16 melaniini tootmist peamiselt NF-κB aktiveerimise kaudu [9]. On näidatud, et fibroblastide ja keratinotsüütide poolt sekreteeritav PGe2 (prostaglandiin e2) stimuleerib dendriitrakkude diferentseerumist ja käivitab melanotsüütides TYR aktiivsuse cAMP (tsükliline adenosiinmonofosfaat) ja Plc (fosfolipaas c) signaaliradade kaudu [10]. PIH (põletikujärgne hüperpigmentatsioon) on teatud tüüpi reaktiivne naha melanisatsioon [11]. Sageli põhjustavad mitmesugused nahahaigused, traumad või iluoperatsioonidpigmentatsioonkahjustatud piirkonda, eriti värvilistel inimestel [12]. PIH-ga patsiendid kannatavad tavaliselt tohutu psühholoogilise stressi all, mis rasketel juhtudel mõjutab negatiivselt nende elukvaliteeti. Seetõttu kasutatakse PIH ja teiste hüperpigmentatsiooni põhjustavate haiguste raviks teatud põletikku reguleerivaid ravimeid. Näiteks leiti, et resveratrool, mis vähendas HaCaT rakkudes põletikulisi kahjustusi [13], pärsib melaniini sünteesi kinaasi1/2 rakuvälise signaali reguleerimise ja signaaliülekande kaudu. fosfoinositiidi 3-kinaasi/Akt [14].

ValgendaminePigmentatsiooni raviks kasutatakse traditsiooniliselt selliseid aineid nagu hüdrokinoon (HQ) ja C-vitamiin [15]. HQ on hüdroksüfenool, millel on võimas melanogeneesi pärssiv toime. Erinevate kõrvaltoimete tõttu, nagu ärritav või allergiline kontaktdermatiit, küünte värvimuutus ja haavade paranemise halvenemine, on HQ kasutamine piiratud[16, 17]. C-vitamiin pärsibTYRinterakteerudes vasedega TYR-i aktiivsetes kohtades, vähendades seeläbi melanogeneesi. Kuid C-vitamiin on valmistoodetes ebastabiilne. Lisaks, kui C-vitamiini kontsentratsioon on suurem kui 20 protsenti, võib see põhjustada nahaärritust [18]. Seetõttu on paljudest allikatest pärit looduslikud koostisosad, mis on ohutud, tõhusad, väga stabiilsed ja kergesti ladustatavad, väga nõutud.

Hiljuti on leitud, et rohkem TCM-i koostisosi on naha pärssimisel tõhusadpigmentatsioon, nagu apigeniin ja paeonifloriin [19–21]. Ben-Cao-Gang-Mu-s kirjeldatud valgendava toimega TCM-e kasutatakse Hiinas laialdaselt sekretoorsete retseptidena ja tänapäeval on kinnitatud, et neil on pigmentatsiooni pärssiv toime. Näiteks Hedysarum multijugum Maximi (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge risoom) ekstrakt põhjustab naha valgenemist, pärssides ERK rada [22]. Typhonii Rhizoma kuivekstrakt (Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano ja Hett. risoom) võib tõhusalt pärssidatürosinaasaktiivsus in vitro [23]. Tõenduspõhine meditsiin on samuti kinnitanud, et türosinaasi aktiivsust pärssivat SapindiMukorossi Semen (Sapindus mukorossi Gaertn. vili) ekstrakti võib kasutada ravimite ja kosmeetilise lisandina [24]. Laialdaselt kasutatakse ka mõningaid traditsioonilisi rahvapäraseid retsepte, kuigi neid ei ole kokku pandud. San-Bai-Tang (SBT) on tüüpiline näide. Ye et al. näitasid, et SBT võib vähendada melaniini tootmist, inhibeerides p38/MAPK signaalirada ja TYR aktiivsust [25]. Samuti on näidatud, et neil on mõnedes retseptides kirjeldatud TCM-idnaha valgendaminemõjusid. Coicis Semen (Coix AquaticaRoxb. seeme) ekstrakt pärsib melaniini tootmist, vähendades MITF, TYR, TRP-1 ja TRP-2 [26]. Veelgi enam, rakuanalüüsTYRnäitas, et Ampelopsis japonica (Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino risoom) pärssis seente TYR aktiivsust rohkem kui 50 protsenti [27]. Nendes iidsetes retseptides registreeritud valgendavad TCM-id on osutunud tõhusaks tänapäevaste eksperimentaalsete meetodite abil, kuid enamik neist on kontrollitud ekstraktide kujul ja toimivad toimeained pole selged. See äratas meie huvi registreeritud valgendava toimega TCM-ide toimeainete vastu. iidsetes ettekirjutustes.

Lisaks on TCM-idel või retseptidel keerulised koostisosad, mitmekesised toimemehhanismid ja tundmatud toimeained. Lisaks mõjutavad TCM-ide efektiivsust suuremat mõju selliste tegurite nagu tooraine kvaliteet, töötlemismeetodid, valmistamismeetodid, koostises kasutatavate koostisosade ja annustamisvormide ühilduvus [19, 28]. Seetõttu on teatud TCM-ide kasutamine koosnaha valgendaminemõju on piiratud. Seetõttu on kiireloomuline süstemaatilise sõeluuringu abil tuvastada toimeained, millel on võimalik nahka valgendav toime, et tagada nende koostisainete ohutus, tõhusus ja stabiilsus.

Viimastel aastatel on süsteemibioloogia rakendamine TCM-i valdkonnas teinud suuri edusamme. TCM-i võrgufarmakoloogia on uus ristdistsipliin, mis ühendab TCM-ide farmakoloogia võrguteaduse, süsteemibioloogia, arvutusteaduse ja bioinformaatikaga [29]. See mõistab täielikult ravimite, haiguste ja bioloogiliste süsteemide keerukust "kompleks-valgu/geenihaiguse" võrgustiku vaatenurgast [30]. Võrgufarmakoloogia on tõhus ja süstemaatiline tööriist taimsete ravimite, eriti TCM-ide farmakoloogilise toime, mehhanismi, ohutuse ja muude aspektide uurimiseks ning annab väärtuslikku teavet praeguste ravimite avastamiseks [31, 32].

nahka valgendavad koostisosad

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Võrgu farmakoloogiline protsess

2.1.1. Keemiliste koostisosade andmebaasi loomine

Uuritud katseprogrammi vooskeemi on kujutatud joonisel 1. Pigmentatsioonivastase toimega TCM-e, mida on kirjeldatud Ben-Cao-Gang-Mu-s ja rahvapärastes retseptides, kasutati võrgufarmakoloogiliseks analüüsiks. Ben-Cao-Gang-Mu's kirjeldatud Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ja Sapindi MukorossiSemenvalgendamineja kollaseid alandavaid omadusi ning võib eemaldada näolaike ja mutte. Poria cocos (Schw.) Wolf (Smilax china L. sklerootium), Paeoniae Radix Alba ja Atractylodes macrocephala Koidz (Atractylodes macrocephalaKoidz. risoom), mis on SBT koostisosad, parandavad teadaolevalt naha tekstuuri ja vähendavad chloasma.pigmentatsioon. Muud traditsiooniliselt registreeritud maitsetaimed, nagu Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F. risoom, Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. ja Hook.f. ex Franch. ja Sav. risoom), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (Sellesse uuringusse kaasati ka Atractylodes lancea (Thunb.)DC, Fructus Ligustri Lucidi ja Coicis Semen risoom. Selles uuringus sisalduvate TCM-ide suure arvu tõttu põhjustavad mitmed Hiina meditsiini andmebaaside kontrollid andmetöötluse segadust. Järelkontrolliks kasutame ainult traditsioonilise hiina meditsiini süsteemifarmakoloogia (TCMSP) andmebaasi, sagedamini kasutatavat andmebaasi. Nende TCM-ide keemilisi koostisosi otsiti TCMSP-st (värskendatud 24. aprillil 2{5}}20) [33]. Tavaliselt kasutatavad skriinimisparameetrid on ravimisarnasus (DL) ja suukaudne biosaadavus (OB). Lokaalsed või süsteemsed ravimid on levinud naha pigmentatsioonihaiguste ravi; seetõttu kasutasime sõelumiskriteeriumina ainult DL-i. Suurepärased kompleksid DL > 0:18 valiti selleks, et suurendada ravimikandidaatide tabamust.

2.1.2. TCM-i sihtgeenide ja pigmentatsiooniga seotud geenide vaheline ristmik.

Geenikomplekt, mis on seotudpigmentatsioonvaliti GeneCardsi andmebaasi (uuendatud 24. aprillil 2020) põhjal, millest valiti sihtmärgid, mille agene-haiguse skoor oli > 1. Lõpuks tuvastati 6180 pigmentatsiooniga seotud sihtmärki. TCM-ide sihtgeenide ja pigmentatsiooniga seotud geenide ristumist illustreeriti Venni diagrammi abil [34].

2.1.3. Active Compound-Target-PathwayNetworki loomine.

Toimeaineid ja reguleeritud sihtgeene skriiniti vastavalt Venni diagrammi tulemustele. Seejärel võrgustik konstrueeriti tarkvara Cytoscape [35] abil ja seda kasutati TCM-ide aktiivsete ühendite ja sihtmärkgeenide vahelise seose näitamiseks.pigmentatsioon.Iga aTCM-i aktiivse koostisosaga reguleeritud sihtgeeni peeti üheks "kraadiks". Valitud TCM-ide tähtsuse hindamiseks kasutati iga TCM-i keskmisi "kraadi"topoloogilisi parameetreid. Ühendid järjestati ja peamiste analüüside jaoks valiti viis parimat TCM-i. Lisaks analüüsiti üksikasjalikku teavet võimalike aktiivsete koostisosade kohta, mis reguleerivad pigmentatsiooni.

2.1.4. Kyoto geenide ja genoomi entsüklopeedia (KEGG) Potentsiaalselt tõhusate TCM-idega reguleeritud sihtgeenide rikastamise analüüs.

KEGG sihtradade määramiseks ja nende TCM-ide potentsiaalselt tõhusate koostisosade võimalike mehhanismide uurimiseks valiti viie parima TCM-iga reguleeritud sihtgeenid.pigmentatsioonKEGG sihtteede rikastamise analüüsimiseks kasutati .DAVID bioinformaatika ressursse 6.8. Laaditi üles tõhusate toimeainete potentsiaalsete sihtmärkide geenisümbolid. Seejärel laaditi saadud geeniidentifikaatorid alla ja sisestati KOBAS3. Valiti geen, mis reguleeris p väärtused alla 0,05.

2.1.5. Molekulaarse dokkimise simulatsioon.

Sitoglusiidi, arbutiini, nikotiinamiidi, HQ, kojiinhappe ja askorbiinhappe 2D-struktuurid saadi PubChemi andmebaasist. Väikeste molekulide mehaanilised struktuurid optimeeriti ChemBio3D Ultra 14 abil.0. Seene 3D kristallstruktuurTYR(EPB ID: 2Y9X, dokkimiskoordinaadid: X =−8:87, Y=−30:74 ja Z=−41:52) saadi valgu andmepangast ( Esialgne eelarveprojekt) andmebaas [36]. Kuue membraaniretseptori 3D-kristallstruktuurid (opioid u retseptor, PDB ID: 4DKI; melanokortiin 1 retseptor, PDB ID: 2L1J; endoteliin B retseptor, PDB ID: 5GLI; adrenergiline retseptor, PDB ID: 4GBR; prostaglandiini retseptor, PDB ID: 6D26 tüvirakkude faktori retseptor, PDB ID: 2EC8) saadi PDB andmebaasist. Valgustruktuurid valmistati AutoDock Toolsi abil, eemaldades veemolekulid, lisades vesinikke ja luues nulljärku sidemed metallide ja disulfiidsidemetega. Lõpuks viidi läbi molekulaarse dokkimise simulatsioonid AutoDock Vina 1.1.2 [37] abil ja tulemusi analüüsiti PyMoL 1.7.2.1 abil.

2.2. Eksperimentaalne valideerimine

2.2.1. Kemikaalid ja antikehad.

Sitoglusiid (puhtus 98 protsenti või suurem) osteti ettevõttest ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimetüülsulfoksiid (DMSO) osteti firmalt Sigma-Aldrich. Neutraalne paraformaldehüüd (4 protsenti) osteti ettevõttest Biosharp (Hefei, Hiina). Kojichape, Fontana-Massoni plekikomplekt, naatriumdesoksükolaat ja L DOPA osteti ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) osteti firmalt Gibco (#C11995500BT, Gibco). Veise looteseerum (FBS) ja rakkude loenduskomplekt-8 (CCK8) osteti ettevõttest BI (Kibbutz Beit-Haemek, Iisrael). PMA (12-O-tetradekanoüülforbool-13-atsetaat, ERK/MAPK aktivaator) osteti ettevõttelt APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomütsiin (p38/MAPK aktivaator) osteti ettevõttest MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Ras-seotud valgu Rab-27A (RAB27A) (#69295, CST), ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) (#4695, CST), p-ERK (#4370, CST), c-vastased primaarsed antikehad Jun N-terminaalne kinaas JNK (#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP vastuseelemente siduv valkCREB ( #9107, CST) ja p-CREB (#9198, CST) osteti ettevõttest Cell Signaling Technology. Primaarsed antikehad TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory) vastuTYR(BS1484, Bioworld) ja GAPDH (#AP0066, Bioworld) osteti vastavalt firmadest Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory ja Bioworld.

2.2.2. Rakukultuur ja ravi.

MNT1 ja B16F0, mis on rikkad melanosoomide poolest, kasutatakse laialdaselt melanogeneesi uurimiseks [38]. Järelikult valiti need kaks rakuliini järgmisteks katseteks. MNT1 ja B16F0 rakke kasvatati DMEM-is 20% või 10% veiseloote seerumis (BiologicalIndustries, Iisrael) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini (Gibco). Kõiki rakke kultiveeriti märjas inkubaatoris 37 kraadi ja 5% CO2 juures. Sitoglusiid lahustati DMSO-s ja DMSO lõppkontsentratsioon oli<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Sebrakala kasvatamine ja ravi.

Sebrakala embrüo ja sööde osteti ettevõttelt EzeRinka Biotech (Nanjing, Hiina). Katseprotokolli kiitis heaks Kesk-Lõuna ülikooli kolmanda Xiangya haigla eetikakomitee (nr 2021-S137). Esimesel päeval pärast koorumist kasvatati sebrakala 12-süvendiga plaadil (10 süvendit), kaitsti valguse eest ja kasvatati 37 kraadi juures. Sebrakala töödeldi erineva kontsentratsiooniga sitoglusiidiga ja fotod tehti pöördmikroskoobiga 24-tunniste intervallidega, et registreerida melaniini muutused sebrakala sabas. Pärast piltide tegemist loeti erineva kontsentratsiooniga sitoglusiidi lahused ja salvestati neid pidevalt ühe nädala jooksul.

2.2.4. Rakkude elujõulisus.

Rakkude elujõulisust hinnati kasutades CCK8.MNT1 ja B16F0 rakud plaaditi 96-süvendi plaatidele tihedusega 2000 rakku süvendi kohta või 500 rakku süvendi kohta. Rakke töödeldi sitoglusiidi erinevate kontsentratsioonidega (25, 50, 100, 200, 400, 600 ja 800 µM). 24 või 48 tunni pärast lisati igasse süvendisse 10 μLof CCK8 reaktiivi ja rakke inkubeeriti 37 kraadi juures 1 tund. Kui söötme värvus muutus oranžiks, kultuur lõpetati ja neeldumise mõõtmiseks 490 nm juures kasutati mikroplaadilugejat (PerkinElmer EnVision Xcite, UK).

2.2.5. Fontana-Massoni melaniini värvimine.

Rakke kultiveeriti 6-süvendiga plaadil ja töödeldi 2 päeva jooksul erineva kontsentratsiooniga sitoglusiidiga ning positiivseks kontrolliks lisati kojhapet 200 μM juures. Seejärel asetati rakud 15 minutiks 4% paraformaldehüüdi. Pärast veega loputamist inkubeeriti rakke 24 tundi pimedas kambris Fontana ammoniaagi-hõbeda lahusega, loputati veega ja asetati seejärel veel 5 minutiks hüposulfiti. Melaniini jälgimiseks kasutati tagurpidi mikroskoopi.

2.2.6. Funktsiooni taastamise katse.

PMA-d kui tunnustatud ERK/MAPK [39, 40] aktivaatorit testiti tsütotoksilisuse suhtes CCK8 katsega erinevatel kontsentratsioonidel (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ja Ja pärast seda, kui MNT1 ja B16F0 rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga (25, 50 ja 100 ng/mL) PMA-ga 2 tundi, tuvastati ERK fosforüülimistase Westernblot katsega. Valitud kontsentratsioonil töödeldi rakke 0, 1, 2, 4, 6 ja 8 tunniga, et tuvastada efektiivne aktiveerimisaeg. Pärast rakkude töötlemist sitoglusiidi (200 μM) ja PMA-ga (25 ng/mL) 48 tundi (töödeldi iga 8 tunni järel), oli valgu taseTYRjap-ERK tuvastati. Fontana-Massoni melaniini värvimine tuvastas melaniini sisalduse. Anisomütsiin [41] on p38/MAPK aktivaator, mille uurimiskontsentratsioon on 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ja 512 nM ning teised katsemeetodid on samad, mis PMA.

2.2.7. TYR aktiivsuse mõõtmised.

Rakke töödeldi erineva kontsentratsiooniga sitoglusiidiga 2 päeva. Pärast seedimist ja tsentrifuugimist rakud loendati ja resuspendeeriti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Järgmisena lisati igale proovile 500 μL 0,5% naatriumdesoksükolaadi lahust. Proove inkubeeriti 4 kraadi juures 10 minutit ja seejärel 37 kraadi juures 15 minutit. Lisati 1 ml 1% L-DOPA lahust, mille järel pipeteeriti 200 µl kohe 96-süvendiga plaadile. Seejärel kasutati neeldumisväärtuste (A0) mõõtmiseks lainepikkusel 475 nm mitmerežiimilist plaadilugejat ja mõõtmist korrati 30 minuti pärast (A30).TYRaktiivsus arvutati kui (A{{0}}A0) rakuarvu kohta.

2.2.8. TYR aktiivsussond.

Lähis-infrapuna fluorestsentssondTYRresorufiinil põhinevat aktiivsust kasutati elusrakkude aktiivsuse visualiseerimiseks, nagu eelnevalt kirjeldatud [42]. Lühidalt, MNT1 ja B16F0 rakke kultiveeriti 6-süvendiplaadil ja töödeldi 2 päeva jooksul erinevate kontsentratsioonidega sitoglusiidiga. . Lisati 10 μM fluorestsentssond ja 4 tunni pärast asendati rakud PBS-ga. Pärast seda, kui punane tuli oli põnev, kasutati pildistamiseks kohe fluorestseeruvat pöördmikroskoopi.

2.2.9. Valkude ekstraheerimine ja Western Blotting.

Pärast seda, kui rakke töödeldi 2 päeva erineva kontsentratsiooniga sitoglusiidiga, ekstraheeriti kogu raku valk, kasutades RIPA lüüsipuhvrit (Thermo Fisher) ning proteaasi inhibiitori ja fosfataasi inhibiitori kokteile (Roche). Valgu kontsentratsioon määrati BCA valgu analüüsikomplekti (KeyGEN Biotec) abil. Pärast blokeerimist 1 protsendi BSA-ga on esmased antikehad vastuTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 ja p-p38 inkubeeriti membraanidega üleöö temperatuuril 4 kraadi 1:1000 ja GAPDH juures 1:3000 Membraanid pesti TBS-T-ga ja inkubeeriti kitse küülikuvastase sekundaarse antikehaga 1:3000 1 tund. Seonduv antikeha tuvastati elektrokemiluminestsentsi (ECL) abil.

2.2.10. Statistiline analüüs.

Statistiliseks analüüsiks kasutati tarkvara SPSS22.{1}} ja mitme rühma võrdlemiseks kasutati Studenti t-testi või ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). Mitteparameetriliste andmete jaoks kasutati Mann-Whitney U testi. p < 0:05="" loeti="" kõigil="" juhtudel="" statistiliselt="" oluliseks.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" ja="" ∗p=""><>

3. Tulemused

3.1. TCM-ide liitkoostisained.

Uuriti 14 TCM-i, mis on registreeritud Ben-Cao-Gang-Mu-s ja rahvapärastes retseptides, millel on pigmentatsioonivastane toime. TCMSP andmebaasist saadi kokku 372 Hiina meditsiini koostisosa 14 TCM-ist (täiendav tabel S1).

3.2. Sihtgeenid, mida reguleerivad TCM-id ja seotud pigmentatsioonigeenid.

Vastavalt TCMSP andmebaasi sihtmärgi ennustussüsteemile saadi 14 TCM-ist kokku 834 sihtgeeni. Kokku 9431 geeniga seotudpigmentatsioonsaadi GeneCards-andmebaasist, millest valiti välja 6180 ja mille asjakohasusskoor oli > 1.

3.3. 14 TCMi ja haiguse-ühendi sihtvõrgustiku järjestus.

Kasutades Cytoscape tarkvara, võtsime iga TCM-i ja pigmentatsiooniga seotud geenide regulatoorsete geenide ristumiskoha ning saime potentsiaalsed toimeained ja ühised sihtgeenid. Järgmiseks haiguse ühendi sihtvõrk TCM-i japigmentatsioonehitati. Selle põhjal saime iga toimeaine keskmise "kraadi" ja järjestasime TCM-id nende skooride järgi. Auastmeskooride järgi olid 5 parimat maitsetaime Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ja Paeoniae Radix Alba (joonis 2(a)). 5 parima TCM-i 220 sihtgeeni KEGG-analüüsi põhjal oli 19,3 protsenti geenidest rikkad PI3K-Akt signaaliraja poolest, 13,6 protsenti geenidest olid seotud TNF-i signaalirajaga ja umbes 12,3 protsenti geenidest olid seotud IL-ga. 12}}. Lisaks osales MAPK rajas 37 geeni ja HIF{15}} rajas 28 geeni. Need rajad on tihedalt seotud melaniini metabolismi reguleerimise ja nahafotode vananemisega. 20 parima rikastatud signaaliraja hulgas moodustasid põletikuga seotud teed veerandi neist (joonis 2 (c)). Joonistel 2(d)–2(h) on kujutatud haiguse ühendi sihtmärgi võrgustik Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba ja pigmentatsiooni vahel. Viie parima TCM-i koostisosade Venni diagrammi kohaselt leidsime, et neli TCM-i sisaldasid sitoglusiidi ja beeta-sitosterooli (joonis 2 (b), täiendav tabel S2).

3.4. Potentsiaalsed aktiivsed koostisosad pigmentatsiooni pärssimisel.

Haiguse-ühendi sihtmärgi võrgustiku kohaselt on 148 koostisosaga seotudpigmentatsioonsaadi 14TCM-ist. Kirjanduse otsingu põhjal teatati, et 148 koostisosast 25 inhibeerivad melanogeneesi. Neli toimeainet teatati kui taimeekstraktid, mis pärsivad melanogeneesi. Uuriti 14 toimeainet ja teatati, et nende derivaadid reguleerivad pigmentatsiooni. Huvitaval kombel on näidatud, et neli koostisosa soodustavad melanogeneesi, samas kui kuue koostisosa mehhanism melanogeneesi reguleerimisel on endiselt ebaselge. Ülejäänud 95 potentsiaalset Hiina meditsiinilist koostisainet ei ole pigmentatsiooni reguleerimiseks veel uuritud. Üksikasjalik teave nende koostisosade kohta on esitatud täiendavas tabelis S3.

3.5. Sitoglusiidi in vitro ja in vivo mõju melanogeneesile.

Pärast ülaltoodud sõelumisprotsessi avastasime, et neli TCM-i ülemises TCM-is sisaldasid sitoglusiidi ja -sitosterooli. - Sitosterool inhibeerib alfa-melanotsüüte stimuleerivat hormooni (-MSH), stimuleerides melanogeneesi p38 signaaliraja kaudu B16F10 melanoomirakkudes [43]. Sitoglusiidi pigmentatsioonivastasest toimest ja selle spetsiifilisest mehhanismist ei ole aga teatatud. Seetõttu valisime nende uuringute jaoks ravimikandidaadiks sitoglusiidi. CCK8 test viidi läbi sitoglusiidi potentsiaalsete toksiliste kontsentratsioonide uurimiseks MNT1 ja B16F0 rakkudes. Tulemused näitasid, et sitoglusiidil ei olnud ilmset mõju rakkude proliferatsioonile (joonised 3(a) ja 3(b)) kontsentratsioonidel alla 400 µM. 25, 50, 100 ja 200 µM sitoglusiidiga läbi viidud melaniiniga värvimine näitas, et sitoglusiid võib vähendada melaniini sisaldus MNT1 ja B16F0 rakkudes annusest sõltuval viisil (joonis 3(c)). Lisaks pärssis ravi sitoglusiidiga oluliselt nahkapigmentatsioonsebrakala puhul ajast ja annusest sõltuval viisil (joonis 3(d)). Need tulemused näitasid, et sitoglusiid inhibeeris melanogeneesi in vitro ja in vivo.

3.6. Sitoglusiidi mõju TYR-i ekspressioonile.

Varasemate tulemuste põhjal võib sitoglusiid tõhusalt vähendada melaniini sisaldust, kuid see, kuidas see seda protsessi reguleerib, on endiselt teadmata ja seetõttu pakub huvi. Western blotting viidi läbi melanogeneesiga seotud geenide (TYR, MITF, TRP1, TRP2 ja RAB27A) ekspressiooni tuvastamiseks valgu tasemel. Analüüside tulemused näitasid, et TYR ekspressioon oli pärast sitoglusiidiga töötlemist oluliselt alareguleeritud ning MITF ja TRP1 ekspressioon mõõdukalt alareguleeritud. (Joonis 4(a)). Kuna MAPK ja PKA on peamised ülesvoolu signaalirajad, mis reguleerivad TYR-i, uurisime täiendavalt nende kahe raja võtmevalkude muutusi. Pärast seda, kui MNT1 ja B16F0 rakke töödeldi sitoglusiidiga 2 päeva, langesid ERK ja P38 fosforüülimise tasemed oluliselt alla. , samas kui CREB, ERK, JNK ja p38 valkude üldtasemes ega JNK ja CREB fosforüülimise tasemetes olulisi muutusi ei toimunud (joonis 4 (b), joonis S1A). Vastavalt CCK8 eksperimendi tulemustele avastasime, et PMA alla 100 ng/ml ei ole mõlemale rakule toksiline (joonis S1B) ja 25 ng/mL PMA võib ilmselt tõsta ERK fosforüülimise taset. ERK fosforüülimise tase langes järk-järgult 4 tunni pärast (joonis S1C-D). Fontana-Massoni melaniinivärvimise abil leidsime, et PMA võib oluliselt suurendada MNT1 ja B16F0 rakkude themelaniini sisaldust. Westernblot analüüsi tulemused viitavad ka sellele, et PMA võib ülesreguleerida ERK fosforüülimise taset ja sitoglusiid võib vähendada PMA poolt ülesreguleeritud ERK fosforüülimise taset. Inhibeerides ERK fosforüülimise taset ja vähendades valgu tasetTYRSitoglusiid vähendab PMA-ga suurendatud melaniinisisaldust (joonised 4(c) ja 4(e), joonis S2A). Samal ajal leidsime, et anisomütsiinil on sarnased tulemused. Anisomütsiin alla 8 nM ei ole toksiline mõlemale rakule ja 2 nM anisomütsiin võib märkimisväärselt tõsta p38 fosforüülimise taset. 8 tunni pärast on p38 fosforüülimise tase endiselt kõrge (joonis S1B, joonis S1E-F). Fontana-Massoni melaniinivärvimise ja Western blot analüüsi tulemused viitavad ka sellele, et sitoglusidekaan inhibeerib anisomütsiini poolt ülesreguleeritud p38 fosforüülimise taset, vähendades TYR valgu sisaldust ja inhibeerides.pigmentatsioon(Joonised 4(d) ja 4(f), joonis S2B). Seetõttu võib sitoglusiid vähendada TYR ekspressiooni, inhibeerides ERK/MAPK ja p38/MAPK radu. Siiski jääb ebaselgeks mehhanism, mille abil sitoglusiid neid signaaliülekandeteid inhibeerib. Jälgime nende signaaliradade ülesvoolu membraani retseptoreid ja kasutasime molekulaarset dokkimist, et uurida allavoolu radade reguleerimise mehhanismi. Sitoglusiidi ja kuue membraaniretseptori, nimelt opioidi u, melanokortiini 1, tüvirakufaktori, endoteliinB, adrenergiliste ja prostaglandiiniretseptorite vahelised sidumisenergiad olid -7.8,-5.8, {{9 }},5, -5,4, -3,4 ja 0 kal/mol vastavalt. Molekulaarse dokkimise kaudu leidsime, et kuue membraani retseptori hulgas oli sitoglusiidil väga kõrge afiinsus opioidi u, melanokortiini 1 ja tüvirakkude kasvufaktori retseptoritega (joonis 4 (g)). Me oletame, et sitogluside võib pärssida ERK / MAPK ja p38 / MAPK radu, seondudes eelnevalt mainitud membraaniretseptoritega, vähendades seeläbi TYR ekspressiooni.

3.7. Sitoglusiidi mõju TYR-i aktiivsusele.

AlatesTYRon melaniini sünteesi võtmeensüüm, see on melanogeneesi pärssimise kõige olulisem sihtmärk. Enamik kaubanduslikult saadaolevaid kosmeetikatooteid või nahka pleegitavaid aineid, nagu HQ, arbutiin ja kojichape, on TYR-i inhibiitorid. Kasutasime sitoglusiidi ja mõnda kliiniliselt kasutatavatnaha valgendamineained (arbutiin, nikotiinamiid, kojiinhape, HQ ja askorbiinhape), et viia läbi molekulaarne dokkimine TYR-iga. Üksikasjalikud koostoimed sitoglusiidi ja ülalnimetatud ainete vahelTYRon näidatud joonisel 5(a). Nende kuue ühendi sidumisenergiad olid -6,2, -6,4, -5,6, -5,7, -5,4 ja{{ 11}},4 kcal/mol vastavalt. Üldiselt arvatakse, et kui afiinsusenergia on -4, näitab see sidumisjõudu ja kui see on suurem või võrdne -7.0, näitab see tugevat sidumisjõudu. Sitoglu pool oli afiinsuse poolest teisel kohal, veidi nõrgem kui arbutiin, omades suhteliselt silmapaistvat kombineerimisvõimet.

Samal ajal kasutati TYR-i aktiivsuse tuvastamiseks L-DOPA konversioonikatset, kasutades positiivse kontrollina kojhapet. Tulemused näitasid, et sitoglüsiid inhibeeris MNT1 ja B16F0 rakkudes kontsentratsioonist sõltuval viisil TYR aktiivsust ning kõrge kontsentratsiooniga rühm (200 μM) näitas samaväärset inhibeerivat toimet kui 200 µM kojic. hape (joonised 5(b) ja 5(c)). Lisaks näitasid TYR-i sondi katse tulemused, et sitoglusiidi kontsentratsiooni suurenedes vähenes fluorestsentsi intensiivsus rakkudes järk-järgult ja kõrge kontsentratsiooniga rühma fluorestsentsi intensiivsus oli MNT1 ja B16F0 rakkudes lähedane 200 μM kojichappe omale (joonis 5(d). Joonis S2C). Need tulemused näitavad, et sitoglusiid võib tõhusalt inhibeeridaTYRaktiivsus MNT1 ja B16F0 rakkudes. Veelgi enam, me oletame, et sitoglusiid, loodusliku sterooliühendina, võib tungida otse rakumembraani ja seonduda TYR-iga ning pärssida selle aktiivsust, pärssides seeläbi melanogeneesi.

4. Arutelu

Selles uuringus kasutasime potentsiaalsete mehhanismide uurimiseks võrgufarmakoloogiatnaha valgendamine14 TCM-is leiduvad koostisained, mis on dokumenteeritud Ben-Cao-Gang-Mu ja infolk retseptides, inhibeerivadpigmentatsioon. Uuringus pakuti välja ka uuenduslik meetod, mis kasutab iga toimeaine keskmist "kraadi" topoloogilist parameetrit, et hinnata ravimtaimede võimalikku efektiivsust. Vastavalt keskmisele "kraadile" valiti välja Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones ja Paeoniae Radix Alba ning KEGG-i rikastamise geenide ootamatu rikastusanalüüsi abil,5 reguleeriti neid viiest rikastatud TCM-ist2. signaalirajad olid seotud põletikuga, sealhulgas IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt ja MAPK signaalirajad.

Hiljuti on näidatud, et mitmesugused põletikulised vahendajad aktiveerivad või inhibeerivad melanogeneesiga seotud signaaliradasid, mis soodustavad või pärsivad nahka.pigmentatsioon[6]. Kasvatatud B16F10 melanoomirakud, TNF- vähendas nende ekspressiooniTYRning TRP1 ja TYR aktiivsus annusest sõltuval viisil [44]. IL-17 ja TNF- võivad vähendada melanogeneesiga seotud geenide ekspressiooni melanotsüütides ning IL-17 võivad oluliselt tugevdada TNF-i pärssivat toimet melanogeneesile. Pärast ravi etanertseptiga (anti-TNF) olid melanogeneesiga seotud geenid psoriaasiga patsientide nahakahjustustes oluliselt ülesreguleeritud[45]. On teatatud, et HIF-1, võimas transkriptsioonifaktor, mis reguleerib põletikulist vastust, osaleb selliste tegurite reguleerimises nagu IL-17 ja TNF- [46–48]. Seetõttu osaleb HIF-1 tõenäoliselt melanogeneesi reguleerimises, mõjutades põletikku. Teised tsütokiinid, nagu IL-18, IL-33, GM-CSF ja IL-1 võivad soodustada melanogeneesi, aktiveerides PKA, MAPK või muid signaaliülekandeteid, samas kui IFN-, IL-1, IL-4 ja IL-6 vähendavad melanogeneesi, inhibeerides STAT1, NF-κB, ja JAK2-STAT6 signaalirajad [6]. Meie tulemused näitavad, et viis peamist TCM-i (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ja Paeoniae Radix Alba) võivad avaldada pigmentatsioonivastast toimet peamiselt põletikuvastaste radade kaudu. Varasemas kirjanduses mainiti ka, et neil viiel parimal TCM-il on võimas põletikuvastane ja vananemisvastane toime [49, 50]. See toetab ka meie oletust, et TCM-idel võib olla põletikujärgses pigmentatsioonis märkimisväärne roll.

Uurides kirjandust 14 TCM-is leitud 148 koostisosa kohta, leidsime ka, et 35 teatatud koostisosa hulgast kinnitati, et peaaegu 70 protsenti neist kas vähendavad melaniini sisaldust või inhibeerivad TYR-i aktiivsust. See mitte ainult ei kinnita, et iidsetes raamatutes sisalduvad nahavalgendamise retseptid on suures osas usaldusväärsed, vaid näitab ka seda, et viide iidsele kirjandusele on usaldusväärne meetod TCM-ide kohta teadmiste saamiseks. Siiani on veel uurimata 95 ühendit, millel on potentsiaali vastu seistapigmentatsioon. Viie populaarseima TCM-i Venni diagrammide analüüsimisel saadi 13 tavalist koostisainet. Nende hulgas kinnitasid in vitro katsed, et daidzeiin, rutiin ja (pluss)-katehiin võivad vähendada melaniini sisaldust [51–53]. Sahharoos häirib melanosoomi nõuetekohast küpsemist. indutseerides osmootset stressi ja inhibeerides PI3 kinaasi rada, häirides sellega melanogeneesi [54]. Kvertsetiin vähendab oksüdatiivsest stressist põhjustatud melanogeneesi [55]. Lisaks kinnitasid keemilised ja füüsikalised meetodid, nagu spektroskoopilised ja struktuuri-aktiivsuse analüüsid, et lupeoland kaempferool võib pärssidaTYRja vähendada melanogeneesi[56, 57]. See näitab, et võrgufarmakoloogia võib olla teostatav meetod välja kaevamiseksvalgendaminekoostisained. Viie parima TCM-i neli TCM-i sisaldasid sitoglusiidi ja puuduvad aruanded selle kohta, kas sitoglusiid reguleerib pigmentatsiooni või sellega seotud mehhanismi. Seetõttu valisime nendeks uuringuteks sitoglusiidi.

Sitoglusiid, steroolglükosiid, mida leidub laialdaselt taimedes, avaldab kasvajavastast, antioksüdatiivset ja neuroprotektiivset toimet [58–60]. Selles uuringus avastasime, et sitoglusiid vähendas tõhusalt melaniini sisaldust in vitro ja in vivo. Hilisemad katsed tõestasid, et see võib TYR-i ekspressiooni oluliselt vähendada. Kojichapet kasutati positiivse kontrollina ja see võib inhibeerida ka melanogeneesiga seotud geenide, nagu TYR, MITF ja TYRP1, valgu taset -MSH stimulatsiooni all, millest on teatanud Jeon et al. [61]. Arvestades eksogeense stimulatsiooni puudumist, oli 200 μM kojichappel meie uuringus geeniekspressioonile ainult mõõdukas inhibeeriv toime, kuid kuna kojikhappel on suur türosinaasi inhibeeriv toime, kasutame seda selles uuringus siiski positiivse kontrollina. Teatati, et TYR ekspressiooni reguleerivad otseselt või kaudselt vastavalt MAPK või PKA radad. On kinnitatud, et üha rohkematel koostisosadel on nahka valgendav toime, pärssides MAPK signaalirada. Näiteks vähendab fargesiin naha ekspressiooni.TYRinhibeerides P38/MAPK rada [62]. Ganoderma lucidum polüsahhariidid suudavad seista vastu UVB-indutseeritud melanogeneesile, vähendades MAPK rada [63]. Meie uuring näitas, et sitoglusiidil kontsentratsioonis 200 μM oli potentsiaal vähendada TYR ekspressiooni, pärssides ERK / -MAPK ja P38 / MAPK signaaliülekande radu. Sellest on teatatud molekulaarse dokkimise kaudu MAPK radade [64] ülesvoolu membraaniretseptorite ja sitoglusiidi vahel. Leidsime, et sitoglusiid seondub tugevalt opioidi u, melanokortiini 1 ja tüvirakkude kasvufaktori retseptoritega. Seetõttu oletame, et sitoglusiid võib interakteeruda nende membraaniretseptoritega, pärssida ERK / MAPK ja P38 / MAPK signaaliülekande radu ning vähendada TYR ekspressiooni.

Kuna TYR on võtmeensüüm melaniiniosakeste sünteesil melanotsüütides, on TYR-i katalüütilise saidi aktiivsuse pärssimine naha vähendamiseks hädavajalik.pigmentatsioon[65]. Paljud turul olevad nahka valgendavad ained on TYRaktiivsuse inhibiitorid, nagu HQ, arbutiin ja kojichape. Selles uuringus kasutasime molekulaarset dokkimist, et uurida sitoglusiidi ja viie levinud sidumismõjunaha valgendamineaktiivsed koostisosad (arbutiin, nikotiinamiid, kojiinhape, HQ, andaskorbiinhape) [66] koosTYR. Tulemused näitasid, et sitoglusiidil oli tugev seondumisafiinsus TYR-iga, nõrgem kui arbutiiniga, kuid tugevam kui kojiinhape, nikotiinamiid, HQ ja askorbiinhape. Arbutiin on HQ eelravim ja looduslik toode, mis võib vähendada või pärssida melaniini sünteesi, inhibeerides TYR-i. Arbutiini looduslik vorm on aga isheemiliselt ebastabiilne ja võib muutuda HQ-ks, mis katalüüsitakse ja metaboliseeritakse benseeni metaboliitideks, millel on potentsiaalne toksilisus luuüdile [67]. Kojiinhappe kosmeetikatoodete kasutamine on piiratud selle kantserogeensuse ja säilitamise ajal ebastabiilsuse tõttu [68]. Seetõttu eeldatakse, et sitoglusiid, looduslik sterooliühend, mis on saadud erinevatest taimedest, toimib tugeva nahka kergendava ainena. Sitoglusiidi lahustuvus DMSO-s on aga madal, mis on ka selle loodusliku koostisosa puudus. Hilisem eksperimentaalne kontrollimine näitas, et sitoglusiid on MNT1 ja B16F0 rakuliinides ohutu ning madala kontsentratsiooniga rühmal oli TYR aktiivsust hästi inhibeeriv toime, samas kui kõrge kontsentratsiooniga rühmal oli sama toime kui sama kontsentratsiooniga kojichappel. Seetõttu võib sitoglusiidi kasutada terapeutiliselt naha valgendamise regulaatorina, mis mitte ainult ei vähenda TYR-i ekspressiooni, vaid pärsib ka selle aktiivsust (joonis 6).

5. Kokkuvõtted

Võrgufarmakoloogia võib olla tõhus vahend looduslike naha pigmentatsiooni vähendavate toimeainete ja nende võimalike mehhanismide avastamiseks. Potentsiaalsed on Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ja PaeoniaeRadix Albanaha valgendamineomadused ja võivad pärssidapigmentatsioonpõletikku reguleerides. Sitogluside on romaannaha valgendaminekahekordse reguleeriva toimega toimeaine, st. pärssivTYRväljendus ja aktiivsus.

cistanche tabletid