Kuidas ekspresseerida inimese neerudes ja kuseteedes inimese defensiiniga 5

Lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstraktne

Taust:Kuseteede steriilsust säilitavad mehhanismid pole täielikult mõistetavad. Hiljutised uuringud on näidanud antimikroobsete peptiidide (AMP) tähtsust kuseteede kaitsmisel infektsioonide eest. Siin kirjeldame AMP inimese alfa-defensiin 5 (HD5) ekspressiooni ja olulisust inimeses.neerudja kuseteedes normaalsetel ja nakatunud isikutel.

Metoodika/peamised järeldused:Kasutades inimeselt eraldatud RNA-dneerud, kusejuha ja põie koe, teostasime kvantitatiivse reaalajas PCR-i, et näidata, et HD5 kodeeriv geen DEFA5 ekspresseerub konstitutiivselt kogu kuseteedes. Püelonefriidi korral suurenes DEFA5 ekspressioon oluliseltneerud. Immunoblotanalüüsi kasutades suurenes HD5 tootmine ka püelonefriidi korral. Immunovärvimine HD5 lokaliseeris põie ja kusejuha uroteeli. Neerudes toodeti HD5 peamiselt distaalses nefronis ja kogumistorukestes. Immunobloti ja ELISA analüüse kasutades ei tuvastatud HD5-d rutiinselt nakatumata inimese uriiniproovides, samas kui HD5 tootmine uriinis suurenes E.coli kuseteede infektsiooniga.

Järeldused/olulisus:DEFA5 ekspresseerub nakatumata isikutel kogu kuseteedes. Täpsemalt, HD5 ekspresseerub kogu alumiste kuseteede uroteelis ja kuseteede kogumistorukestes.neerud. Nakkuse korral suureneb HD5 ekspressioonneerudja tasemed muutuvad uriinis tuvastatavaks. Meie teadmiste kohaselt on meie leiud esimene, kes kvantifitseeris HD5 ekspressiooni ja tootmist inimese neerudes. Lisaks on see esimene aruanne HD5 esinemise tuvastamiseks nakatunud uriiniproovides. Meie tulemused näitavad, et HD5-l võib olla oluline roll kuseteede steriilsuse säilitamisel.

Cistanche UK neeruhaiguse jaoks, proovi saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Kuseteed, välja arvatud kusiti luu, on tavaliselt steriilsed, hoolimata sellest, et see on fekaalifloora läheduses. Täpsed mehhanismid, mille abil kuseteede steriilsust säilitavad, ei ole hästi teada. Kuseteede kaitset toetavateks kavandatavateks mehhanismideks on uriinivool, uriini pH ja osmolaarsuse muutused, regulaarne põie tühjenemine, uroepiteeli keemilised kaitsekomponendid ja efektorimmuunrakkude epiteeli eraldumine/sissevool koos bakteriaalse stimulatsiooniga [1]. Lisaks on hiljuti näidatud, et antimikroobsetel peptiididel (AMP) on oluline roll kuseteede steriilsuse säilitamisel [2]. AMP-d, mis toimivad looduslike antibiootikumidena, mida toodavad peaaegu kõik organismid, on kaasasündinud immuunsüsteemi üldlevinud komponent. AMP-d on katioonsed molekulid, mida ekspresseerivad fagotsüütilised valged rakud ja epiteelirakud. Inimestel ja teistel imetajatel on defensiinid AMP-de peamine perekond. Defensiinidel on tavaliselt laia spektriga antimikroobne toime grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite, viiruste, seente ja algloomade vastu [2,3]. Defensiinid sünteesitakse algselt preproproteiinidena ja neid töödeldakse küpseteks bioloogiliselt aktiivseteks peptiidideks [4]. Inimestel liigitatakse defensiinid ühte kahest perekonnast sõltuvalt nende disulfiidsilla mustrist – alfa-defensiinid või beeta-defensiinid [5].

Kuseteedes ekspresseeruvad beeta-defensiinid laialdaselt kogu uroepiteelis. Epiteelirakud vooderdavadneerudHenle silmus, distaalne tuubul ja kogumiskanal ekspresseerivad konstitutiivselt inimese beeta-defensiini 1 (hBD1). Kuigi hBD1 tase uriinis ei ole sissetungivate bakterite hävitamiseks piisav, tagab hBD1 torukujulistele luumenitele kiiresti toimiva antimikroobse katte ja hoiab ära nakkuse, inhibeerides bakterite kinnitumist uroteeli külge [6]. Hiljutised uuringud näitavad, et hBD1 redoksseisund mõjutab oluliselt antimikroobset toimet, nii et redutseeritud peptiid on palju tugevam kui disulfiidiga seotud oksüdeeritud vorm [7]. Selle tähtsust uroteeli pinnal ei ole kindlaks tehtud. Teine defensiin, inimese beeta-defensiin 2 (hBD2) ei ekspresseeru konstitutiivselt terves neerukoes; hBD2 ekspressiooni indutseerib aga infektsioon [8].

Erinevalt beeta-defensiinidest ei ole epiteelist pärinevate alfa-defensiinide rolli kuseteedes hästi kirjeldatud. Alfa-defensiinide HD5 ja HD6 ekspressiooni ja funktsiooni on enamasti kirjeldatud peensooles, kus Panethcells eritavad neid soolestiku krüptidesse ja aitavad kaasa soolestiku mikrobiota tasakaalule [9]. HD5 on lokaliseeritud ka meeste ja naiste suguelundites ning tõendid viitavad sellele, et see on indutseeritav ja oluline nakkuse likvideerimisel [10, 11, 12]. Uriini HD5 on tuvastatud patsientidel, kellel on tehtud niudesoole neopõie rekonstrueerimine ja niudesoole kanalite uriini suunamine, kusjuures HD5 tootmise allikaks loeti peamiselt niudesoole Panethi rakud [13, 14]. HD5-l on antibakteriaalne toime tavaliste uropatogeensete grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite vastu [15]. HD5-l on ka antimikroobne toime uropatogeensete viiruste, nagu adenoviirus ja BK viirus, vastu [16, 17, 18]. Selles uuringus anname inimese HD5 ekspressiooni esialgse kirjelduse ja kvantifitseerimiseneerudja täpsemalt määratleda selle ekspressioon alumistes kuseteedes steriilsuse ja infektsiooni ajal.

Tulemused

DEFA5 mRNA ekspresseerub konstitutiivselt inimese põies, kusejuhas ja neerus

Kvantitatiivne reaalajas PCR näitab, et kõik testitud põie-, kusejuha- ja neeruproovid ilma infektsioonita ekspresseerisid konstitutiivselt DEFA5. DEFA5 ekspressioon oli alumistes kuseteedes oluliselt suurem kui ülemistes kuseteedes (p= 0,014). Põies (n=4) oli keskmine DEFA5 ekspressioon 4656637 transkripti 10 ng RNA kohta ja kusejuhas (n=4) oli DEFA5 keskmine ekspressioon 41126170 transkripti 10 ncRNA kohta (joonis 1A). . Neerudes (n=6) oli keskmine DEFA5 ekspressioon 2 9376274 transkripti 10 ng RNA kohta. DEFA5 ekspressiooni analüüsiti eraldi neerukoores, medullas ja vaagnas. DEFA5 ekspressioon ei erinenud oluliselt neerupiirkondade lõikes (p= 0,45).

DEFA5 ekspressioon ja HD5 peptiidi ekspressioon suurenevad püelonefriidi korral

Püelonefriidiga neerukudede kvantitatiivne reaalajas PCR analüüs näitas DEFA5 ekspressiooni olulist suurenemist võrreldes nakatumata neerukudedega. Püelonefriidi (n= 6) korral suurenes keskmine DEFA5 ekspressioon 7 82961 052 transkriptini 10 ng RNA kohta (p= 0,019) (joonis 2A).

Selle ekspressiooni suurenemise edasiseks hindamiseks püelonefriidi korral teostasime sama neerukoe immunoblotanalüüsi, mida kasutati reaalajas PCR analüüsiks, et hinnata samaaegset HD5 peptiidi tootmise suurenemist (joonis 2B, keskmine paneel). Immunoblotanalüüs, milles kasutati polüklonaalset HD5 antiseerumit, näitas oluliselt suuremat HD5 peptiidi tootmist püelonefriidiga neerukudedes (n=6) võrreldes nakatumata neerukudedega (n=6). Nakatumata neerukuded väljendasid 300625 ng HD5/grammi märja koe massi kohta, samas kui püelonefriidi neerukude ekspresseeris 600621 ng HD5/grammi märja koe massi kohta (p,0,0001). Blotte sondeeriti uuesti GAPDH-ga, et need toimiksid laadimiskontrollina (joonis 2B, keskmine paneel) ja valgu võrdse koormuse kinnitamiseks viidi läbi ka hõbedane plekk (joonis 2B, ülemine paneel).

HD5 peptiidi toodetakse kogu inimese neerudes ja kuseteedes

HD5 tootmise lokaliseerimiseks kuseteedes viidi läbi immunovärvimine. Immunohistokeemia (IHC) näitas, et HD5 immunoreaktiivsus esines kõigi uuritud proovide kusejuhi ja põie uroteelis (n=4, joonis 3). IHC näitas ka, et HD5 toodeti kõigi neerukoore ja medulla tuubulites. isendid (n= 6, joonis 4). Immunofluorestsents (IF) näitas, et HD5 ekspressioon oli suurim distaalses nefronis ja kogumistuubulites (joonis 5). Interstiitium ja glomeruli ei näidanud HD5 immunoreaktiivsust. Joonistel 3, 4 ja 5 näidatud immunovärvimine viidi läbi hiire monoklonaalse HD5-vastase antikehaga (8C8), mis tunneb ära HD5 propeptiidi (Abcam, Cambridge, MA). Tulemused olid sarnased, kui kasutati küüliku polüklonaalset HD5-vastast antikeha, mis tunneb ära HD5 propeptiidi ja küpse peptiidi (andmeid pole näidatud), mis viitab sellele, et HD5 säilitatakse propeptiidina.

Püelonefriidi korral suurenes HD5 immunoreaktiivsus märkimisväärselt. HD5 immunoreaktiivsus suurenes kogu proksimaalses nefronis, distaalses nefronis ja kogumistuubulites (joonis 4 ja joonis 5). Nagu nakatumata proovide puhul, ei ilmnenud glomerulites ja interstitsiumis infektsiooniga HD5 ekspressiooni. Negatiivsed kontrollid ei näidanud HD5 immunoreaktiivsust.

Nakatunud inimese uriin sisaldab mõõdetavat

HD5 peptiidi kontsentratsioonid

Immunoblotanalüüs, milles kasutati küüliku polüklonaalset antiseerumit, mis tuvastab proHD5 prekursori ja edasi töödeldud vorme, tuvastas HD5 mõõdetavad tasemed 15-st testitud uriiniproovist 13-s, mis olid nakatunud uropatogeense E.coli-ga (joonis 6A ja B). Kui see oli olemas, oli HD5 tase, normaliseeritud uriini kreatiniiniks, vahemikus 299,8–669,7630 ng HD5/mg uriini Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), mis vastab 11,10–27,67 nmol/l. Nakatunud uriiniproovid (n=15), HD5 oli avastamispiiril (,50 ng) või alla selle. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) samadel uriiniproovidel, kasutades hiire monoklonaalset antikeha (8C8), mis tuvastab ainult prekursori proHD5, tuvastas proHD5 mõõdetavad tasemed 13-s 15-st testitud nakatunud proovist. ProHD5 kontsentratsioon uriinis jäi vahemikku 122,78–490,060,03 ng HD5/mg uriini Cr (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL), kui see oli olemas (joonis 7).

Arutelu

Selles uuringus anname HD5 esialgse iseloomustuse inimese neerudes, kusejuhas ja põies. On näidatud, et HD5 on oluline AMP, mis hoiab ära invasiivse infektsiooni soolestikus ja on nakatumise ajal genitaaltraktis ülesreguleeritud[11,18,19,20,21]. Epiteelist pärinevad AMP-d, nagu HD5, on osutunud oluliseks kuseteede steriilsuse säilitamisel [8, 22, 23, 24]. Nende kaasasündinud limaskesta kaitsemehhanismide puudused võivad põhjustada ägedat ja/või kroonilist infektsiooni [25,26].

Meie kvantitatiivsed reaalajas PCR tulemused näitavad, et DEFA5 ekspresseerub konstitutiivselt inimese neerudes, kusejuhades ja põies. DEFA5 ekspressioon suureneb ülemistest kuseteedest alumiste kuseteede suunas – järgides uriinivoolu ja mikrobiota invasioonipunkti läheduse suurenemist. Meile teadaolevalt on see esimene uuring DEFA5 ekspressiooni kvantifitseerimiseks inimese neerudes ja põies. Hiljuti näitasid Townes jt, et normaalne distaalne kusejuha võib ekspresseerida DEFA5 [14]. Meie tulemused viitavad ka sellele, et DEFA5 ekspresseeritakse konstitutiivselt distaalses kusejuhas. Kuigi DEFA5 ekspressioon kuseteedes on peaaegu 100- korda madalam kui seedetrakti kudedes, on DEFA5 basaalne uroepiteliaalne ekspressioon võrreldav varem kirjeldatud kuseteede amprite ekspressiooniga nagu katelitsidiin, hBD{10}}, hBD -2 ja ribonukleaas 7[6,8,22,24,27]. Vastupidiselt küpsele seedetraktile, kus DEFA5 ekspresseerub kõrgel tasemel nii tervisliku seisundi kui ka infektsiooni/põletiku korral, on meie kvantitatiivne reaalajas PCR andmed näitavad, et DEFA5 ekspressioon neerudes on infektsiooniga oluliselt ülesreguleeritud [27, 28, 29]. See indutseeritav ekspressioonimuster on analoogne DEFA5 ekspressiooniga naiste reproduktiivtraktis, kus DEFA5 ekspressioon suureneb koos salpingiidiga [30]. Kuseteedes on Townes jt ​​näidanud suundumust DEFA5 suurema kuseteede ekspressiooni suunas UTI-ga patsientidel, kes on läbinud niudesoole kuseteede suunamise [14].

Meie immunoblotanalüüs täiendab reaalajas PCR andmeid, näidates, et HD5 peptiidide tootmine suureneb püelonefriidi korral. See HD5 produktsiooni indutseeritav muster on sarnane mõne beeta-defensiini perekonna liikmete omaga. hBD2-l on indutseeritav tootmismuster kuseteede infektsiooni ja/või kroonilise püelonefriidi korral [8,31,32]. On näidatud, et HD5 peptiidi tootmine suureneb naiste suguelundite ülemises osas ja meeste kusitis koos põletikuga [11, 30].

Immunovärvimise abil demonstreerime, et HD5 toodetakse ühtlaselt kogu kusejuha ja põie uroteelis. Kuna valdav osa UTI-dest tuleneb fekaalsest floorast, mis tõuseb põide, viitavad need tulemused sellele, et HD5 ekspressioon esineb kohtades, kus mikroobidega kokkupuude esineb kõige sagedamini [33]. Seetõttu on HD5 ideaalne asend, et vältida kasvavat mikroobset infektsiooni. Neerudes toodetakse HD5 peamiselt distaalses nefronis ja kogumistuubulis. Need leiud viitavad sellele, et HD5 toodetakse kohtades, kus sellel on optimaalne antimikroobne toime. Varasemad uuringud on näidanud, et defensiinide antimikroobsed omadused sõltuvad soola kontsentratsioonist – kõrgem soolakontsentratsioon vähendab antimikroobset toimet [23,34,35]. Spekuleerime, et distaalse nefroni ja kogumistuubulite madalad soolakontsentratsioonid pakuvad HD5 antimikroobse aktiivsuse jaoks soodsat miljööd.

Immunoblot ja ELISA analüüs näitavad ka, et HD5 eritub uriiniga madalal tasemel. Arvestades proHD5 ja täielikult töödeldud HD5 suurust (8,1 kDa ja 3,7 kDa) ja positiivset laengut, on võimalik, et osa uriini HD5 peptiid pärineb vähemalt osaliselt plasmafiltraadist. Siiski on vähe tõendeid selle kohta, et HD5 püsib plasmas [27]. Lisaks peaks HD5 uriinis ilmumiseks põgenema tõhusate peptiidide absorptsioonimehhanismide eest proksimaalses tuubulis [6, 36]. Lõpuks tsentrifuugiti kasutatud uriiniproovid enne analüüside läbiviimist, eemaldades HD5 rakulised allikad. Tuvastatud kontsentratsioonide juures ei ole uriini HD5 tõenäoliselt otseselt antimikroobne uropatogeensete mikroorganismide vastu, kuna täielikult töödeldud HD5 minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon (MIC) on 6–10 mg/ml tavaliste gramnegatiivsete uropatogeensete bakterite suhtes [15]. Limaskesta pinnakontsentratsioonid on aga tõenäoliselt suuremad. Lisaks näitab immunoblotanalüüs, et HD5 kontsentratsioonid on neerudes oluliselt suuremad. Need tulemused viitavad sellele, et HD5 osaleb kuseteede limaskesta kaitses. Analoogne muster on näha hBD1-ga, kus hBD1 kontsentratsioon uriinis ei ole antimikroobse toime avaldamiseks piisav, kuid neerutuubulite läheduses tuvastatakse kõrgemad peptiidide kontsentratsioonid [6, 31].

Kuna IHC näitab, et proHD5 on HD5 peamine vorm neerudes ja kuna uriinis tuvastatakse nii küpset kui ka proHD5-d, siis oletame, et HD5 eritub peamiselt prekursormolekulina ja seejärel läbib proteolüütilise töötlemise, et tekitada küpsed vormid – sarnaselt seedetraktiga. ja urogenitaaltraktid [11,30,37]. Peensooles toodavad Panethi rakud trüpsiini, mis lõhustab HD5 propeptiidi nii, et täielikult töödeldud peptiid on soolestiku luumenis domineeriv vorm [37]. Meeste ureetras on HD5 jaoks peamised töötlemis- ja aktiveerimisensüümid neutrofiilide proteaasid, mida soodustavad

nakkuskohta värvatud neutrofiilid [11]. Epiteeli trüpsinogeeni, uriini trüpsiini ja/või neutrofiilide proteaaside panus HD5 töötlemisesse kuseteedes infektsiooni ajal tuleb veel kindlaks määrata. Veelgi enam, urineerimiskeskkonna muutuste mõju HD5 funktsioonile (osmolaarsuse, pH ja katioonsete kontsentratsioonide muutused) tuleb samuti kindlaks teha.

Kokkuvõtteks võib öelda, et see on esimene uuring HD5 ekspressiooni ja produktsiooni tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kuseteedes. Meie tulemused näitavad, et HD5 on epiteelist tuletatud AMP, mis võib mängida olulist rolli inimese uroepiteeli kaasasündinud immuunsuses, takistades sissetungivate patogeenide ümberpaigutamist vereringesse. HD5 tootmist reguleerivate tegurite väljaselgitamine võib anda uudse ülevaate UTI-de patogeneesist patsientidel, kellel on UTI-de risk, ja krooniliste infektsioonidega patsientidel.

meetodid

Uuringu heakskiit

Kõigilt selles uuringus osalenud patsientidelt saadi teadlik kirjalik nõusolek. Alla 18-aastaste uuritavate puhul saadi vanema/eestkostja kirjalik nõusolek. Üleriigiline lastehaigla (NCH) institutsionaalne ülevaatusnõukogu kiitis selle uuringu heaks koos nõusolekuprotsessi ja dokumentidega (IRB07-00383).

Inimese kudede ja uriini proovid

Nakatumata distaalne kusejuha ja põie kude (n= 4) saadi lastelt, kellele tehti ureetra reimplantatsioon muudel põhjustel kui korduv infektsioon. Infitseerimata neeruproovid (n=6) saadi patsientidelt, kellele tehti neerukasvajate tõttu nefrektoomia. Koeproovid ei sisaldanud makroskoopilisi haiguse või põletiku tunnuseid. Kroonilise püelonefriidiga patsientide neerukude hankis Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Kaks sõltumatut patoloogi kinnitasid püelonefriidi histopatoloogilist diagnoosi. Koeproovid külmutati või säilitati neutraalsete formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud osadena. Enne säilitamist (n=4) lõigati nakatamata neerukoe lõigud ajukooresse, medullasse või neeruvaagnasse.

Nakatumata ja nakatunud uriiniproovid saadi lastelt, kes pöördusid NCH erakorralise meditsiini osakonda või nefroloogiakliinikusse. UTI diagnoos tehti Ameerika Pediaatriaakadeemia juhiste kohaselt positiivse uriinikultuuri tulemusel [39]. Kõikides nakatunud uriiniproovides oli 106 CFU/mL E.coli. Uriini pH väärtused jäid vahemikku 5,5–8,5 (keskmine uriin 6,9). Uriini ioonilist koostist ei mõõdetud. Uriiniproove tsentrifuugiti uriinisetete eemaldamiseks ja lisati proteaasi inhibiitori kokteil (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).