eeKeel
Kodu / Teadmised / Sisu

Teadmised

Angiotensiin II mõju erütropoetiini tootmisele neerudes ja maksas

May 09, 2022

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com
Abstraktne:neerudon peamine erütropoetiini tootmise koht organismis. Töötasime välja uue meetodi EPO valgu tuvastamiseks deglükosüülimisega seotud Western blot analüüsiga. Deglükosüülitud Epo tuvastamine võimaldab uurida väikseid muutusi Epo tootmises. Seda meetodit kasutades uurisime angiotensiin II (ATII) mõju Epo tootmisele neerudes. ATII stimuleeris plasma Epo kontsentratsiooni; Epo, HF2a ja PHD2 mRNA ekspressioon nefroni segmentides neerukoores ja välimises medullas; ja Epo valgu ekspressioon neerukoores. In situ hübridisatsioon ja immunohistokeemia näitasid, et ATII stimuleerib Epo mRNA ja valgu ekspressiooni mitte ainult proksimaalsetes tuubulites, vaid ka kogumiskanalites, eriti interkaleeritud rakkudes. Need andmed toetavad EPO tootmise reguleerimist neerudes reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteemi (RAS) poolt.

Märksõnad: erütropoetiin; angiotensiin I; reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteem; deglükosüülimine; Western blotting; HIF2 ; proksimaalsed tuubulid; kogumiskanalid

life extension standardized cistanche: protection liver

Klõpsake, et näha, milleks cistanche'i kasutatakse

1. Sissejuhatus

Erütropoetiin (EPO) stimuleerib erütrotsüütide tootmist luuüdis[1]. Hüpoksia ja aneemia stimuleerivad Epo tootmist neerude kaudu [1-4]. Raske hüpoksia ja raske aneemia põhjustavad seerumi Epo kontsentratsiooni enam kui 500-kordse tõusu [5]. Sellised seisundid on aga haruldased ja enamik inimesi neid oma elu jooksul ei koge. Seerumi EPO kontsentratsioon normaalsetel inimestel on madal ja Epo valgu ekspressioon kontrollneerudes on [5-8] tuvastamiseks liiga madal. Töötasime välja uue Western blot meetodi ja leidsime, et deglükosüülitud Epo on Epo ekspressiooni täpne marker [5, 9]. EPO valk neerus tuvastatakse 34-43 kDa juures ja deglükosüülimine PNGaasi abil nihutab riba 22 kDa peale. Lai Eoo riba on koondunud kitsaks 22 kDa ribaks, mille tulemuseks on tuvastamise tundlikkuse suurenemine 10-100-korda [5,9]. Seega on saanud võimalikuks väikeste muutuste tuvastamine Epo tootmises.

Reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteem (RAS) reguleerib vee ja elektrolüütide eritumist neerude kaudu, et säilitada kehavedelike homöostaas [10,11]. RAS-i inhibiitorid põhjustavad aneemiat, vähendades Epo tootmist. Kim et al. teatas, et angiotensiin II (ATI) suurendab Epo tootmist angiotensiin 1 retseptori (AT1R) vahendatud varajase kasvuvastuse -1(Egr-1) ​​aktivatsiooni kaudu inimese neerude 786-O rakkudes [12,13 ] Kato jt. teatasid, et reniini ja angiotensinogeeni geenidega transgeensetel hiirtel on erütrotsütoos ning reniini ja angiotensinogeeni puudumisel väljatoodud hiirtel on aneemia [14, 15]. Angiotensinogeeni knockout hiirte aneemia päästeti ATII infusiooniga, mis viitab sellele, et geneetiline rada angiotensinogeenist AT-ni mängib ATII-indutseeritud Epo tootmises võtmerolli. Need aruanded viitavad sellele, et Epo tootmist ei reguleeri mitte ainult hüpoksia või aneemia, vaid ka RAS [4,12,14-18]. Oma eelmistes aruannetes näitasime, et aldosteroon stimuleerib Epo tootmist kogumiskanalite interkaleerunud rakkudes[7]. Selles aruandes uurisime ATII mõju Epo tootmiseleneerudjamaks.

Laiendatud teave:Cistancheon oma olemuselt magus, soolane ja soe. See kuulub neerude ja jämesoole meridiaanide hulka. Cistanche suudab kaitstaisheemiline müokard, alandavad vere lipiidide taset, on vastupidavad ateroskleroosile ja tromboosivastasele toimele, vähendavad perifeerset veresoonte resistentsust, alandavad vererõhku ning on vastupidavad maksa rasvumisele ja muudele farmakoloogilistele toimetele. KokkuglükosiididTeisisõnu, Cistanche koguglükosiidid võivad vähendada apoptoosi, suurendades inhibeerivate geenide ekspressiooni ja vähendades pro-apoptootiliste geenide ekspressiooni apoptoosi kaudu. apoptoosi ja nekroosi, suurendab rakkude ellujäämise määra ja saavutab primaarsetele hepatotsüütidele kaitsva toime. Hiirkatses võib Cistanche'i 15-protsendiline veekeetmine parandada maksarakkude kudede struktuuri ja suurendada maksa glükogeeni sisaldust hiirtel, kes on läbinud stressi, et saavutada maksa kaitsvat toimet.

cistanche herb benefits：improve kidney function

2. Tulemused

2.1.Plasma Epo kontsentratsioon

ATI manustamine suurendas plasma Epo kontsentratsiooni 1,4 ± 0,2-lt 2,9 ± 0,3 mIU/ml-ni (joonis la).

2.2.Epo mRNA ekspressioon neerukoores ja mikrodissekteeritud proksimaalsetes keerdtuubulites (PCT) ja medullaarsetes paksudes tõusvates jäsemetes (MAL)

ATII stimuleeris Epo ja HIF2& mRNA ekspressiooni neerukoores vastavalt 13,2±4,7 ja 11,4±0,6 korda A1 ja A10 võrra (n=3-4) ning 9,6±3,7 ja 8 korda 0,6±2,6 korda vastavalt A1 ja A10 võrra (n=3-4) (joonis lbc). Mikrodissekteeritud PCT korral suurendas ATI Epo mRNA sisaldust 3,4±0,7 ja 2,4± 0,2 korda vastavalt 10-9 M ja 10-6M ATII (n=3) ja HIF2& mRNA 2.0±{{5{{ 54}}}},2 ja 2,3±0,8 korda vastavalt 10-9M ja 10-6 M ATII (n=3) võrra (joonis 1ld,e). ATII suurendas ka Epo mRNA ekspressiooni MAL-is vastavalt 4,3±1,0 ja 6,5±2,0 korda 10-M ja 10-6MATI võrra (n=3) (joonis 1f

image

Figure 1.Epo mRNA expression.(a)Plasma Epo concentration in control and ATI-injected rats. ATll significantly increased the plasma Epo concentration from 1.4 ± 0,2 to 29±0.3 mIU/mL (*p<0.05).(b,c) ATll significantly increased Epo mRNAexpression in the renal cortex(13.2±4.7 and 11.4±0.6 times increase by A1 and A10, respectively) (b), and HIF2a mRNA expression was also stimulated by ATll(9.6± 3.7 and 8.6 ± 2.6 times increase by AI and A10, respectively)(c)(d-f) In microdissected nephron segments, ATII increased Epo mRNA expression in PCT(d) and MAL(f).HIFla mRNA was also increased by ATI in PCT(e). C,control;A1ATI 1mg/keg; A10. ATII 10 mg/kg; ATII9, AT2 10-9M; ATI6,ATII 10-6 M.*p<0.05,*p<001 by the t-test or a non-parametric analysis using the Kruskal-Wallis test and multiple comparisons by the Dunnettor Shirley-Williams'test.

2.3. Epo in situ hübridiseerimine ja ATII mõju

EPO mRNA ekspressiooni täheldati kortikaalsetes nefronites põhitingimustes, nagu eelnevalt kirjeldatud [19]. ATII stimuleeris Epo mRNA ekspressiooni PCT, MAL ning kortikaalsetes ja medullaarsetes kogumiskanalites (CCD ja OMCD) 2 tunni pärast (joonis 2: 2a, 2d). ). HIF2a mRNA ekspressioon suurenes enamikus nii ajukoore kui ka medulla nefronisegmentides ja peritubulaarsetes rakkudes (joonis 2: 2-4b,2-4e). PHD2 mRNA ekspressioon suurenes ka MAL-is, CCD-s ja OMCD-s (joonis 2:3-4c, 3-4f). ATII ei suutnud indutseerida Epo mRNA ekspressiooni neerukoore peritubulaarsetes rakkudes.

ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2⁓4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2– 6 h (2⁓4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4– 6 h (3⁓4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively. 2.4. Western Blotting Analysis of ATII-Induced Epo Production in the Kidney and Liver The effects of fludrocortisone, an aldosterone agonist, were examined using deglycosylation-coupled Western blotting. The band of deglycosylated Epo at 22 kDa was observed in control rats (C2, C4, and C6 in Figure 3a right side), showing that Epo is produced in control rats. Fludrocortisone significantly stimulated the expression of deglycosylated Epo at 2 and 4 h after injection. The expression became equal to that in control rats Figure 2. Effects of ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2~4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2–6 h (2~4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4–6 h (3~4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively

2.4. Neerude ja maksa ATI-indutseeritud Epo tootmise Western blot analüüs

Aldosterooni agonisti fludrokortisooni toimet uuriti deglükosüülimisega seotud Western blot analüüsi abil. Deglükosüülitud Epo riba 22 kDa juures täheldati kontrollrottidel (C2, C4 ja C6 joonisel 3a paremal), mis näitab, et Epo toodetakse kontrollrottidel. Fludrokortisoon stimuleeris märkimisväärselt deglükosüülitud Epo ekspressiooni 2 ja 4 tundi pärast süstimist. Ekspressioon muutus 6 tunni pärast võrdseks kontrollrottide ekspressiooniga. Järgmisena uuriti ATIIon Epo ekspressiooni mõju. ATI mõju Epo tootmisele oli neerukoores suurem kui neeru välimises medullas (joonis 3b). ATI mõju Epo tootmisele neeru sisemises medullas ei täheldatud (andmeid pole näidatud). ATI suurendas annusest sõltuvalt Epo valgu ekspressiooni (joonis 3c). AT suurendas deglükosüülitud Epo tootmist neerukoores vastavalt 1,6±0,2 ja 3,4±0,3 korda 1 ja 10 mg/kg võrra. (n=6-8). Seevastu EPO tootmist maksas ei täheldatud isegi pärast ATII manustamist (joonis 3d).

ffects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test. Figure 3. Effects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test.

2.5. Neerude poolt toodetud Epo immunohistokeemia

IHCof hiirtel leiti põhitingimustes Epo värvumine proksimaalsetest tuubulitest kogumiskanaliteni (proksimaalsed tuubulid

Figure 4. Immunohistochemical study of the effects of ATl on Epo production by the kidney.Under basal conditions, Epo staining was found from the proximal tubules to the collecting ducts (proximal tubules< thick ascending limbs<collecting ducts)(1-a-c).ATIl increased Epoproduction in MAL, CCD, and OMCD(3~4-a-c), particularly in the type A intercalated cells, after 4-6h (brown cells in 3~4-a-c). The renal outer medulla is shown at a different magnification. The numbers 1,2,3,and 4 show 0, 2,4, and 6 h after the injection of ATIl, respectively.

cistanche propiedades blood lipid lowering

3. Arutelu

Epo tuvastamine Western blot analüüsiga oli keeruline, kuni leidsime deglükosüülimisega seotud analüüsi [5, 7, 9, 20-26]. Raske hüpoksia ja aneemia korral stimuleeritakse EPO tootmist kõrgel tasemel ja Epo tuvastamine on lihtne [2-5]. Sellised seisundid on aga in vivo haruldased. Leidsime, et Epo-d toodavad neerud isegi kontrollitingimustes. Epo tuvastamine kontrollneerudes on isegi meie Western blot analüüsiga keeruline. Epo deglükosüülimine PNGaasi poolt suurendab Epo riba intensiivsust 22 kDa juures, võimaldades tuvastada madalamaid EPO tasemeid. Seda meetodit kasutades uurisime fludrokortisooni ja ATII mõju Epo tootmisele.

ATll suurendas Epo mRNA ekspressiooni neerukoores. Järgmisena uurisime ATIIon Epo mRNA ekspressiooni mõju mikrodissekteeritud PCT-s ja MAL-is. ATll suurendas Epo mRNA ekspressiooni PCT-s ja MAL-is. Uurisime ka ATI mõjusid in situ hübridisatsiooni (ISH) abil. ISH näitas, et ATI suurendab Epo mRNA ekspressiooni mitte ainult

proksimaalsetes tuubulites, aga ka distaalsetes tuubulites. Lisaks uurisime Epo valgu ekspressiooni Western blot analüüsi abil. Selles uuringus kasutati deglükosüülimisega seotud Western blottingut. Tulemused näitavad, et ATIl suurendab annusest sõltuvalt Epo valgu ekspressiooni neerudes, kuid mitte maksas. Plasma Epo kontsentratsioon suurenes 2-3- korda, mis on kooskõlas varasemate aruannetega 4, 68, 12. Sellist EPO tootmise taset veres ei saa Western blot analüüsiga mõõta. Kuid deglükosüülimisega seotud Western blotting tegi tuvastamise võimalikuks ja ATII suurendas oluliselt Epo valgu ekspressiooni neerudes. Immunohistokeemia näitas ka, et ATlI suurendab Epo valgu ekspressiooni nii proksimaalsetes kui ka distaalsetes tuubulites. ATII toime on identne fludrokortisooni toimega kogumiskanalite interkaleerunud rakkudes [7]. Meie uuring on esimene, mis näitab ATII-indutseeritud Epo tootmise intrarenaalset lokaliseerimist ISH ja IHC poolt.

AT Il suurendas ka HIF2 mRNA ekspressiooni neerukoores ja proksimaalsetes keerdunud tuubulites, näidates, et Epo produktsiooni suurenemine ATII poolt on põhjustatud HIP2 stimuleerimisest, sama mis aldosteroonist [7l. Meie uuring näitab, et EPO tootmist neerudes reguleerib reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteem. On oletatud ATIⅡ rolli Epo tootmisel neerudes [4,12,16-18]. Jelkmann pakkus välja angiotensiin Ⅱl kaudse mõju müeloidsete erütrotsüütide eelgeneraatorite kasvufaktorina |4|. Kim et al. teatas selgelt, et angiotensiin II stimuleerib Epo tootmist AT1R-vahendatud Egr-1 aktiveerimise kaudu p21Ras-mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi/rakuvälise signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) kinaasi ERK/2 poolt inimese neerude 786-O-rakkudes [12.13. ]. Angiotensinogeenist ATII-ni ulatuva geneetilise raja rolli uurisid Kato et al. [14,15]. Nad näitasid, et reniini ja angiotensinogeeni geenidega transgeensetel hiirtel ilmneb erütrotsütoos. Samuti teatasid nad, et reniini ja angiotensinogeeni puudumisel knockout hiirtel on aneemia, mis päästeti ATIl infusiooniga, mis viitab sellele, et angiotensinogeenist ATll-le pärinev geneetiline rada mängib ATI-indutseeritud Epo tootmises võtmerolli. Epo tootmise mehhanismid rasketes hüpoksilistes ja põhitingimustes võivad olla erinevad, kuid mõned etapid, näiteks HIF2 stimuleerimine, võivad olla samad. Võime toota Epo-d on neerude interstitsiaalsete rakkude ja nefronite puhul erinev. HIF2 tuvastamine Western blot analüüsiga ei olnud selles uuringus edukas; me ei suutnud tuvastada HIF2 riba umbes 115 kDa juures, isegi kasutades sc-46691, sc-13596, Ab8365 ja NB100-122.

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Materjalid ja loomad

Kasutati isaseid Sprague-Dawley rotte (Japan SLC, Hamamatsu, Jaapan) ja C57BL/6J hiiri (Charles River Jaapan, Yokohama, Jaapan). Rottidele manustati vastavalt 1 või 10 mg/kg ATI(A1 ja A10) ja hiirtele 5 mg/kg ATII-d intraperitoneaalse süstina. Kontrollrühmale süstiti soolalahust. 4 tunni pärast süstiti rottidele segaanesteetikumi (0,3 mg/kg medetomidiini, 40 mg/kg midasolaami ja 5,0 mg/kg butorfanooli) ja veri. võetud kõhuaordist. Neerud ja maks lõigati lahti pärast 20 ml PBS-i perfusiooni kõhuaordisse. Mõnes katses inkubeeriti neerulõike kollagenaasis (tüüp 1, C-0130; Sigma-Aldrich, Burlington, NJ, USA) ja ribonukleosiidi vanadüülkompleksides (R-3380; Sigma-Aldrich) 20 minutit , ning PCT ja MAL mikrodissekteeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud [7]. Mikrodissekteeritud PCT või MAL inkubeeriti ATI või kandjaga 2 tundi 37 kraadi juures. Hiired anesteseeriti 1,5% isofluraaniga 30% O2-s (100% O ja õhu segu) 2,4 ja 6 tunni pärast. Neerud eemaldati kiiresti ja lõigati pikisuunas. Peamised neerutükid fikseeriti sukeldamisega üleöö jääkülma 4% paraformaldehüüdi/0,1 M fosfaatpuhvrisse ja töödeldi histoloogiliseks analüüsiks parafiinis.

Meie protokolle kontrollisid ja kiitsid heaks Kitasato ülikooli meditsiinikeskuse (2018032, 2019029) ja Kitasato ülikooli meditsiinikooli (2019-141) institutsionaalse eetikakomitee.

4.2. Reaalajas PCR

RNA ekstraheeriti neerudest, maksast ja mikrodissekteeritud PCT-st või MAL-ist, kasutades Qiacube'i ja RNeasy Mini Kit'i (74106; Qiagen, Venlo, Holland), nagu eelnevalt kirjeldatud [5]. cDNA sünteesimiseks kasutati Takara PrimeScript II 1. ahela cDNA sünteesikomplekti (6210; Takara, Otsu, Jaapan). Reaalajas PCR viidi läbi firma Applied Biosystems sonde (GAPDH Rn01775763 g1, Epo Rn00667869 m1.HIF2 Rn00576515 m1. HIFla Rn01472831 m1, PHD2 Rn00710295 m1, TakarRNA ekspressioon (TakarRNA) ja USA Prexmi, Ex Wal9t Prexmi, M1; kontroll- ja ATII rottidel võrreldi AACT-ga.

4.3. In situ hübridiseerimine

ISH viidi läbi, nagu eelnevalt kirjeldatud [5, 27]. Lühidalt, kogu RNA hiire neerudest (636612; BDBioscieces Clontech) pöördtranskribeeriti RNA PCR komplektiga (AMV), ver. 3.0 (RR019; Takara) ja Epo cRNA sond (GenBanki liitumisnumber NM 007942).HIF2 (GenBank liitumine) nr NM 010137) või PHD2 (GenBank registreerimisnumber NM_053207) genereeriti T7 promootori piirkonna sabaga PCR praimeritega. Hübridiseeritud sektsioone töödeldi järjestikku 0,1% avidiini, 0,01% biotiinilahuse, 0,5% kaseiini/TBS-i, mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud lamba anti-DIG F (ab') fragmendi antikehaga (11207733910; Roche Diagnostics, Basel, Šveits). biotinüülitud türamiidi lahus ja HRP-ga konjugeeritud streptavidiin (P0397; DakoCytomation, Glostrup, Taani). Sektsioonid värviti DAB vedelikusüsteemiga (BSB 0016: Bio SB.Santa Barbara.CA, USA) ja Mayeri hematoksüliiniga (30002; Muto Pure Chemicals, Tokyo, Jaapan).

4.4. Immunohistokeemia

Neerulõigud värviti immunovärviga, nagu eelnevalt kirjeldatud [7, 28]. Lühidalt öeldes blokeeriti lõigud 5-protsendilise normaalse kitse seerumiga ja reageeriti küüliku polüklonaalse inimese Epo-vastase antikehaga (sc-7956, 1:50; Santa Cruzi biotehnoloogia, Santa Cruz, CA, USA), millele järgnes Histofine. Simple Stain MAX-PO (414341F; Nichirei Bioscience, Tokyo, Jaapan). Sektsioonid värviti DAB vedelikusüsteemiga ja värviti Mayeri hematoksüliiniga.

Pildid saadi optilise mikroskoobiga (Axioplan 2; Carl Zeiss, oberkochen, Saksamaa) digitaalkaameraga (AxioCam MRcb; Carl Zeiss). Jäädvustatud pilte analüüsiti pildianalüüsi süsteemiga (AxioVision Rel.4.6; Carl Zeiss).

4.5. Western blot analüüs deglükosüülimisega

Viidi läbi Western blot analüüs, nagu eelnevalt kirjeldatud [4, 6, 7]. Valk koguti neerukoorest ja maksast CelLytic MT(C-3228; Sigma-Aldrich) abil ja kasutati Western blot analüüsiks. Neeru- ja maksaproovid deglükosüüliti, kasutades N-glükosidaasi F（PNGase,4450; Takara, nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, 1 μl 10 protsenti SDS-i lisati 10 μl neeru- või maksaproovile ja keedeti 3 minutit. Seejärel lisati 11 uL 2x stabiliseerivat puhvrit ja proove segati keerisega. Pärast 1-2 μL PBS-i või PNGaasi lisamist inkubeeriti proove veevannis 20 tundi 37 kraadi juures. Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti proovid maha ja supernatant koguti ja kasutati SDS-PAGE jaoks (10-20% gradientgeel: Cosmo Bio No, 414893. Tokyo. Jaapan). 2x stabiliseeriv puhver sisaldas 125 mM Tris- HCl (pH 8,6), 48 mMEDTA, 4 protsenti Nonidet P-40 ja 8 protsenti 2-merkaptoetanooli. Positiivse kontrollina kasutati inimese rekombinantset Epo-d (rhEpo, 587102; BioLegend, San Diego, CA, USA). Pärast SDS-PAGE-d kanti valgud 120 mA 60-90 minutiks PVDF membraanile (Immobilon-P; IPVH00010: Merck Millipore, Burlington.NI.USA). Membraan blokeeriti 5-protsendilise kooritud piimaga (Morinaga, Jaapan) 60 minutit ja inkubeeriti Epo vastase antikehaga (sc-5290, 1:500; Santa Cruz Biotechnology) 60 minutit toatemperatuuril. Pärast pesemist inkubeeriti membraani sekundaarse antikehaga (kitse hiirevastane IgG(H pluss L);115-035-166, 1:5000; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) 60 minutit. Ribad visualiseeriti ECL Select Western Blotting Detection System (RPN2235; GE Healthcare Bio-Science AB, Chicago, IL, USA) ja LAS4000 (Fujifilm, Tokyo, Jaapan) abil.

4.6. Plasma Epo kontsentratsiooni mõõtmine

Plasma koguti kontroll- ja ATI-ga töödeldud rottidelt 4 tundi pärast peritoneaalset süstimist. Plasma EPO kontsentratsioone mõõdeti CLEIA (SRL, Tokyo, Jaapan) abil, kasutades Beckman Coulteri (Brea, CA, USA) Access Epo'd.

4.7. Plasma E

Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM. Statistiline olulisus viidi läbi Exceli statistika abil (BellCurve, Tokyo, Jaapan). Statistilist olulisust analüüsiti f-testi või mitteparameetrilise analüüsi abil, kasutades Kruskal-Wallise testi ja mitut võrdlust Shirley-Williamsi testiga. p-väärtused<0.05 were="" considered="" statistically="">

effects of cistanches：improve kidney function

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõttes näitab meie uuring, et ATII suurendab Epo mRNA ja valgu ekspressiooni proksimaalsetes ja distaalsetes neerutuubulites. Koos meie varasemate uuringutega reguleerib Epo tootmist neerude poolt põhitingimustes reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteem.




Ju gjithashtu mund të pëlqeni