Kuidas Cistanche Deserticola polüsahhariid mõjutab luude imendumist?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Cistanche deserticola polüsahhariid nõrgendab osteoklastogeneesi ja luu resorptsiooni, pärssides RANKL-i signaalide andmist ja reaktiivsete hapnikuühendite tootmist

Dezhi Song jt

Osteoporoos on ainevahetushaigus, mida iseloomustab osteopeenia ja luude mikrostruktuuride halvenemine. Osteoklastid on peamised efektorrakud, mis lagundavad luumaatriksit ja nende ebanormaalne funktsioon põhjustab osteoporoosi arengut. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumuleerumine raku metabolismi ajal soodustab osteoklastide proliferatsiooni ja diferentseerumist, mängides seetõttu osteoporoosis olulist rolli.Cistanchedeserticolapolüsahhariid(CDP) on kasvajavastane,põletikuvastaneja antioksüdantne aktiivsus. CDPon osteoklastide mõju on aga ebaselge. Selles uuringus kasutati tartraadiresistentset happefosfataasi värvimist, immunofluorestsentsi, pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni ja Westernblot analüüsi, et näidata, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)inhibeeris osteoklastogeneesi ja hüdroksüapatiidi resorptsiooni. Lisaks CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)inhibeeris ka osteoklastide markergeenide, sealhulgas Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ekspressiooni ega mõjutanud tuumafaktori κB (RANK) ekspressiooni retseptori aktivaatorit. Mehhaanilised analüüsid näitasid, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)suurendab antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, et nõrgendada RANKL-i vahendatud ROS-i tootmist osteoklastides ja inhibeerida aktiveeritud T-rakkude tuumafaktorit ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi aktivatsiooni. Need tulemused viitavad sellele, et CDP võib olla kandidaatravim osteoporoosi raviks, mis on põhjustatud liigsest osteoklastide aktiivsusest.

MÄRKSÕNADluu resorptsioon,Cistanchedeserticolapolüsahhariid, MAPK, osteoklast, reaktiivsed hapniku liigid

1|SISSEJUHATUS

Tasakaal osteoblastide vahendatud luu moodustumise ja osteoklastide vahendatud luu resorptsiooni vahel mängib luu metaboolse homöostaasi säilitamisel üliolulist rolli (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Kui luu resorptsioon ületab luu moodustumist, tekib osteoporoos, mida iseloomustab luumassi vähenemine ja luude mikrostruktuuri kahjustused (Ikeda, 2008). Osteoporoos on eakate inimeste ja menopausijärgsete naiste tavaline haigus ning selle patogeneesi ei ole täielikult välja selgitatud (Cooper & Melton, 1992). Östrogeenipuudus on osteoporoosi peamine põhjus (Manolagas, O'Brien ja Almeida, 2013). Lisaks võib tuumafaktor κB ligandi (RANKL) retseptori aktivaator esile kutsuda reaktiivseid hapnikuliike (ROS) ja neid seostatakse osteoklastide moodustumisega (Yip et al., 2005) ja seega võivad need aidata kaasa osteoporoosi arengule (Manolagas, 2010). Mõned uuringud on leidnud, et nrf2-antioksüdantide puudus suurendab ROS-i taset ja soodustab RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide diferentseerumist (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013). Seetõttu tuleks ROS-i tootmise vähendamist osteoklastide diferentseerumise ajal hinnata osteoporoosi ravi terapeutilise strateegiana.

Osteoklastid pärinevad monotsüütide või makrofaagide hematopoeetilisest liinist ja on ainsad mitmetuumalised rakud, mis teostavad luu resorptsiooni (Teitelbaum, 2000). Seetõttu on osteoklastide moodustumist käsitlevatel uuringutel suur tähtsus luu ainevahetushaiguste tõhusate ravimeetodite väljatöötamisel (Lorenzo, 2017). Makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja RANKL, mida toodavad osteoblastid ja aktiveeritud T-rakud, on olulised tsütokiinid, mis reguleerivad osteoklastogeneesi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indutseerib aktiveeritud T-rakkude tuumafaktori (NFATc1) ekspressiooni, mis on osteoklastide moodustumise ajal aktiivne kriitiline transkriptsioonifaktor (Ishidaet al., 2002). Aktiveeritud NFATc1 soodustab osteoklastide markergeenide, nagu tartraadiresistentne happeline fosfataas (TRAcP) ja katepsiin K (CTSK), ekspressiooni, mis reguleerivad osteoklastogeneesi ja osteoklastide funktsiooni (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchedeserticolapolüsahhariid(CDP) on isoleeritud liha lihavatest vartestCistancheja sellel on immuunregulatsioon, kasvajavastane, vananemisvastane ja muud farmakoloogilised toimed (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo ja Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)avaldas pärssivat toimet lipopolüsahhariidide poolt indutseeritud lämmastikoksiidi (NO) tootmisele hiire mikrogliiarakkudes (BV-2 rakud; Nan et al., 2013). Lisaks afenüületanoidirikas ekstrakt (ECD).Cistanchesuurendas hiirte ujumisvõimet, vähendades lihaskahjustusi, aeglustades piimhappe kogunemist ja parandades energia salvestamist (Cai et al., 2010). CDP mõju osteoklastide funktsioonile ja aktiivsusele jääb siiski teadmata.

Selles uuringus näitasime, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärsib RANKL-i indutseeritud osteoklastide diferentseerumist ja luu resorptsiooni. Selle aluseks oli CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)suurendab antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, et nõrgendada ROS-i tootmist, ja seejärel pärsib RANKL-aktiveeritud NFAT-i ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaaliülekandekaskaade. Need tulemused viitavad sellele, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)võib kasutada liigsest osteoklastilisest luuresorptsioonist põhjustatud osteoporoosi raviks.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Materjalid

CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)(puhtus > 98 protsenti) osteti ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina) ja valmistati lähtekontsentratsiooniga 1 mM fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Antikehad on spetsiifilised c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforüülitud (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK ja ‐aktiini suhtes, saadi Santast Cruzi biotehnoloogia (San Jose, CA). V-ATPaasi d2 vastased antikehad toodeti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-5-(3-karboksümetoksüfenüül)-2-(4-sulfofenüül)-2H-tetrasooliumi (MTS) ja lutsiferaasi analüüsisüsteem saadi ettevõttest Promega (Sydney, Austraalia). Rekombinantne M-CSF osteti ettevõttelt R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantne GST-rRANKL valk ekspresseeriti ja puhastati, nagu eelnevalt kirjeldatud (Xu et al., 2000).

2.2|Rakukultuur

RAW264.7 rakud (hiire makrofaagirakud) saadi Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC, Manassas, VA) ja kultiveeriti modifitseeritud minimaalses olulises söötmes (Thermo FisherScientific, Scoresby, Austraalia), millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit, 2 mM L-glutamiini. , 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini (täielik sööde). Luuüdist pärinevad monotsüüdid (BMM-id) eraldati 6-nädalastest C57BL/6J hiirtest, kes surmati Lääne-Austraalia ülikooli loomaeetika komitee (RA/3/100/1244) poolt heaks kiidetud protseduuride kohaselt. lõigati lahti pehmetest kudedest ja luuüdi loputati reieluust ja sääreluust, mida seejärel kultiveeriti täielikus söötmes M-CSF (50 ng/ml) juuresolekul.

2,3|Osteoklastogeneesi test

BMM-id plaaditi 96-augulistele kultuuriplaatidele tihedusega 6 × 103 rakku süvendi kohta ja töödeldi täieliku söötmega, mis sisaldas M-CSF-i (50 ng/ml) ja GST-rRANKL-i (100 ng/ml), kas nende juuresolekul või puudumisel. CDP erineva kontsentratsiooniga(Cistanchedeserticolapolüsahhariid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>kolm tuuma) tuvastati osteoklastidena.

2.4|Tsütotoksilisuse analüüsid

BMM-id külvati 96-süvendilistesse plaatidesse tihedusega 6 × 103 rakku süvendi kohta ja jäeti üleöö kleepuma. Järgmisel päeval inkubeeriti rakke CDP erineva kontsentratsiooniga(Cistanchedeserticolapolüsahhariid). Veel 48 tunni pärast lisati MTS lahus (20 µl süvendi kohta) ja inkubeeriti rakkudega 2 tundi. Neelduvus lainepikkusel 490 nm määrati mikroplaadilugejaga (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunofluorestsentsvärvimine

BMM-id külvati M-CSF (50 ng/ml) juuresolekul öö läbi tihedusega 6 × 103 rakku süvendi kohta. Seejärel stimuleeriti rakke M-CSF ja GST-rRANKL-iga (100 ng/ml), kuni moodustusid küpsed osteoklastid. Seejärel töödeldi teosteoklaste CDP erineva kontsentratsiooniga(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)48 tundi enne fikseerimist 4% paraformaldehüüdiga, permeabiliseerimist 0,1% Triton X-100-PBS-ga ja blokeerimist 3% veise seerumi albumiiniga PBS-is. Valmistatud rakke inkubeeriti rodamiiniga konjugeeritud falloidiiniga 45 minutit tume, et määrduda F-aktiini suhtes. Seejärel pesti rakke PBS-ga, tuumad värviti 4',6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) ja paigaldati konfokaalseks mikroskoopiaks katteklaasidega.

2,6|Hüdroksüapatiidi resorptsiooni test

Osteoklastide aktiivsuse mõõtmiseks stimuleeriti kuue süvendiga kollageeniga kaetud plaatidel (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) kasvatatud BMM-e (1 × 105 rakku süvendi kohta) GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) ja M-CSF-iga (50 ng/ml). ) kuni küpsete osteoklastide tekkeni (Zhou et al., 2016). Seejärel eraldati rakud õrnalt plaate kasutavast rakkude dissotsiatsioonilahusest (Sigma-Aldrich) ja võrdne arv küpseid osteoklaste külvati üksikutele süvenditele inhüdroksüapatiidiga kaetud 96-süvendilistele plaatidele (Corning Osteoassay, Corning, NY). Küpsed osteoklaste inkubeeriti söötmes, mis sisaldas GST-rRANKL-i ja M-CSF-i koos CDP-ga või ilma(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)näidatud kontsentratsioonidel. 48 tunni pärast värviti pooled süvendid immunohistokeemiliselt TRAcP aktiivsuse suhtes, nagu ülalpool kirjeldatud, et hinnata mitmetuumaliste rakkude arvu süvendi kohta. Ülejäänud süvendeid pleegitati 10 minutit, et eemaldada rakud ja võimaldada resorbeerunud alade mõõtmist. Resorbeerunud alad pildistati standardse valgusmikroskoopia abil ja osteoklastide poolt resorbeeritud hüdroksüapatiidi pinna pindala protsendi määramiseks kasutati tarkvara Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

2,7|Lutsiferaasi reporteri testid

NFATc1 transkriptsioonilise aktivatsiooni uurimiseks transfekteeriti RAW264.7 rakud stabiilselt NFATc1-le reageeriva lutsiferasereporteri konstruktiga (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekteeritud rakke kultiveeriti 41-kordse süvendiga plaatidel. 0,5 × 105 rakku süvendi kohta ja eeltöödeldud erinevate CDP kontsentratsioonidega(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)1 tunniks. Pärast eeltöötlust stimuleeriti rakke GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) 24 tundi ja lutsiferaasi aktiivsust mõõdeti lutsiferaasi reporteranalüüsi süsteemiga vastavalt tootja protokollile (Promega).

2,8|Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) analüüs

Kogu RNA eraldati rakkudest, kasutades Trizoli reagenti vastavalt tootja protokollile (Thermo Fisher Scientific). Komplementaarne DNA sünteesiti, kasutades Moloney hiire leukeemiaviiruse pöördtranskriptaasi koos 1 ug RNA matriitsi ja oligo-dT praimeritega. Spetsiifiliste järjestuste polümerase ahelreaktsiooni amplifikatsioon viidi läbi järgmise programmi abil: 94 kraadi 5 minutit, millele järgnes 30 tsüklit 94 kraadi juures 40 sekundit, 60 kraadi 40 sekundit ja 72 kraadi 40 sekundit ning viimane pikendusetapp 5 minutit 72 kraadi. Üksikasjalik teave spetsiifiliste praimerite kohta on näidatud tabelis 1. Suhtelised messenger-RNA tasemed arvutati normaliseerimise teel majapidamisgeeni Hmbs ekspressioonile.

2,9|Western blot analüüs

BMM-e kultiveeriti täielikus söötmes M-CSF-iga kuue süvendiga plaatidel ja stimuleeriti GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) märgitud aegadel. Rakud lüüsiti radioimmunosadestamise lüüsipuhvris ja valgud lahustati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja kanti üle polü(vinülideenfluoriid)membraanidele (GE Healthcare, Silverwater, Austraalia). Membraanid blokeeriti 5% lõssis 1 tund ja seejärel sondeeriti erinevate spetsiifiliste primaarsete antikehadega, raputades õrnalt üleöö temperatuuril 4 kraadi. Membraane pesti ja seejärel inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega. Seejärel tuvastati antikehade reaktiivsus täiustatud kemoluminestsentsreagendiga (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ja visualiseeriti Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare) abil.

2.10|Intratsellulaarne ROS-i tuvastamine

Intratsellulaarsed ROS-i tasemed tuvastati 2', 7'-diklorofluorestseiindiatsetaadi rakulise ROS-i tuvastamise testikomplekti abil (Abcam, Melbourne, Austraalia). BMM-e (5 × 103 rakku süvendi kohta) kasvatati 96 süvendiga plaatidel ja töödeldi RANKL-iga (100 ng/ml), M-CSF-iga (50 ng/ml) ja CDP-ga 72 tundi. Intratsellulaarset ROS-i taset mõõdeti 2', 7'-diklorofluorestseiindiatsetaati abil, mis oksüdeerub ROS-i juuresolekul fluorestseeruvaks DCF-ks. Rakke pesti Hanki puhvris ja inkubeeriti pimedas 30 minutit 10 uM DCFH-DA-ga. Pildid saadi konfokaalse mikroskoopia abil.

2.11|Statistilised analüüsid

Kõik andmed esindavad vähemalt kolme katset, mis viidi läbi kolmes korduses, kui pole märgitud teisiti. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD. Tulemuste vaheliste erinevuste olulisuse määramiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Student-Newman-Keulspost hoc test, kusjuures p < 0,05="" peeti="">

3|TULEMUSED

3.1|CDP inhibeerib RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ja osteoklastide sulandumist

Et teha kindlaks, kas CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)võib pärssida RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide moodustumist, viisime esmalt läbi osteoklastogeneesi testi, kasutades hiire BMM-e (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM-e töödeldi RANKL-i ja M-CSF-iga 5 päeva, suurendades CDP kontsentratsiooni. CDP vähendas TRAcP-positiivsete mitmetuumaliste rakkude arvu, kui CDP kontsentratsioon(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)jõudis 5 uM või kõrgemale (joonis 1a, b). CDP hindamiseks(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)toksilisust ja kinnitada, et need tulemused ei peegeldanud rakusurma ega arvu, teostasime MTS-testi. BMM-e töödeldi RANKL-i ja M-CSF-iga 48 tundi CDP erinevate annustega(Cistanchedeserticolapolüsahhariid). CDP ei mõjutanud BMM-i proliferatsiooni kontsentratsioonil 15 µMor vähem (joonis 1c).

CDP mõju testimiseks(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)osteoklastide liitmisel indutseeriti osteoklaste RANKL-i ja M-CSF-raviga koos CDP erinevate annustega või ilma(Cistanchedeserticolapolüsahhariid). Osteoklastid värviti rodamiin-falloidiini ja DAPI-ga, et hinnata tuumade arvu osteoklasti kohta (joonis 2a). Nii osteoklastide arv kui ka tuumade osteoklastide keskmine arv vähenesid pärast CDP-d(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)töötlemine (5–10 µM; joonis 2b, c). Seetõttu CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)avaldas annusest sõltuval viisil pärssivat toimet RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesile ja osteoklastide fusioonile.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)nõrgendab RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastilise hüdroksüapatiidi resorptsiooni aktiivsust

CDP toime tuvastamiseks viidi läbi hüdroksüapatiidi resorptsiooni test(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)osteoklastide funktsiooni kohta (joonis 3a). Pärast 24-aastast inkubeerimist ei muutunud osteoklastide arv süvendi kohta, samas kui hüdroksüapatiidi resorptsiooniala vähenes 5 ja 10 µM CDP-ga töötlemisel kontrollrühmadega võrreldes oluliselt (joonis 3b, c). Need tulemused näitavad, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)omab tugevat inhibeerivat toimet nii osteoklastide moodustumisele kui ka osteoklastide resorptsiooni aktiivsusele ilma tsütotoksilise toimeta.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärsib osteoklastide markeri geeniekspressiooni

CDP inhibeeriva toime edasiseks uurimiseks(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)osteoklastogeneesi ja osteoklastilise luu resorptsiooni korral raviti BMM-e RANKL-i ja M-CSF-iga 5 päeva erineva CDP kontsentratsiooniga(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)Seejärel viidi läbi RT-PCR, et tuvastada osteoklastimarkerite geenide ekspressiooni. Nfatc1 ekspressiooni, mis on osteoklastogeneesi ajal oluline transkriptsioonifaktor, inhibeeris CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)annusest sõltuval viisil (joonis 4a). Lisaks CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)(5 ja 10 µM) vähendasid luu resorptsiooniga seotud geenide, sealhulgas Mmp9, Ctsk ja Acp5 ekspressiooni (joonis 4b–d).

3,4|CDP pärsib NFATc1 aktiivsust ja allavoolu valgu ekspressiooni

CDP mõju uurimiseks(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)RANKL-indutseeritud NFATc1 aktiivsuse kohta viidi läbi alutsiferaasi reporteranalüüs. Ravi CDP-ga(Cistanchedeserticolapolüsahhariid), kontsentratsioonid 5 µM ja kõrgemad inhibeerisid oluliselt RANKL-i poolt indutseeritud NFATc1 aktiivsust (joonis 5a). Lisaks näitas Western blot analüüs, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärssis oluliselt NFATc1 ja c-Fos valgu ekspressiooni RANKL-i ja M-CSF-iga töödeldud BMM-ides 3 ja 5 päeva jooksul (joonis 5b). Veelgi enam, osteoklastide funktsiooniga seotud valkude, nagu V-ATPaas-d2 ja CTSK, ekspressioon oli CDP juuresolekul allareguleeritud.(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)võrreldes kontrollrühmadega. Kuid CDP ei mõjutanud RANK-i ekspressiooni (joonis 5b).

3,5|CDP soodustab antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, et kõrvaldada ROS-i tootmine RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal

CDP-st sõltuva osteoklastogeneesi inhibeerimise mehhanismi uurimiseks töödeldi BMM-e RANKL-i (100 ng/ml) ja M-CSF-iga (50 ng/ml) koos PBS-i või CDP-ga.(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)72 tunniks. Uurisime CDP mõju RANKL-i poolt stimuleeritud rakusisesele ROS-i tootmisele. Intratsellulaarset ROS-i taset suurendas RANKL-ravi, mida nõrgendas CDP (5 ja 10 uM; joonis 6a). CDP-ravi vähendas annusest sõltuval viisil nii ROS-positiivsete rakkude arvu kui ka ROS-i värvimise intensiivsust (joonis 6b, c). Western blot analüüs näitas, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)soodustas tioredoksiini (TRX1) ja glutatioonreduktaasi (GSR) ekspressiooni, pärssides samal ajal indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (NOS2) ekspressiooni BMM-ides, mida töödeldi RANKL-i ja M-CSF-iga 3 päeva (joonis 6d).

Edasiseks uurimiseks, kas CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärssis osteoklastide diferentseerumist, vähendades ROS-i tootmist, seejärel töödeldi BMM-e peroksiidiga (10 uM), et jäljendada rakkude kõrget ROS-i staatust. BMM-e indutseeriti RANKL ja M-CSF abil 3 päeva ning Western blot analüüsi ja RT-PCR tulemused näitasid, et peroksiid soodustas NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni võrreldes kontrollrühmadega. Kooskõlas joonisel 5 toodud tulemustega pärssis CDP NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)samas kui peroksiid päästis CDP inhibeeriva toime (joonis 6e, f). Need andmed näitasid, et CDP surus alla NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni, vähendades ROS-i tootmist.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)represseerib MAPK radu RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi ajal

Järgmisena uurisime CDP mõju(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)ravi RANKL-i vahendatud TRAF6 ekspressiooni ja MAPK raja aktiveerimisega. Pärast 2-tunnist inkubeerimist seerumivabas söötmes stimuleeriti BMM-e RANKL-iga koos CDP-ga või ilma selleta 60 minutit. Stimuleerimine CDP-ga (10 uM) ei mõjutanud TRAF6 ekspressiooni ning nõrgendas JNK2 ja ERK1/2 fosforüülimist 10. ja 20. minutil (joonis 7). Lisaks inhibeeris CDP märkimisväärselt p38 fosforüülimist(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)ravi 60 minutit võrreldes kontrollrühmadega (joonis 7). Need andmed näitavad, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärsib RANKL-i indutseeritud MAPK signaaliradasid, mis on kooskõlas selle inhibeeriva toimega osteoklastide moodustumist ja aktiivsust.

4|ARUTELU

Cistanche, tuntud kui "kõrbe ženšen", on viimasel ajal pälvinud suurt tähelepanu selle võime tõttu moduleerida immuunsust ja toimida kaitsvalt vananemise ja oksüdatiivse stressi ajal (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). On näidatud, et fenüülpropanoid-asendatud glükosiidid, Cistanche peamised aktiivsed komponendid, pärsivad makrofaagides NO aktiivsust (Ahn, Chae, Chin ja Kim, 2017). Lisaks aCistancheekstrakt vähendas oksüdatiivset stressi reperfuseeritud müokardis pärast isheemiat ja mängis olulist rolli apoptootiliste radade pärssimisel, mis viivad kardioprotektsioonini (Yu, Li ja Cao, 2016). Cistanche, CDP olulise komponendina(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)omab mitmesuguseid farmakoloogilisi funktsioone. Meie praeguses uuringus leiti, et CDP represseeris RANKL-i aktiveeritud osteoklastide diferentseerumist ja aktivatsiooni, nõrgendades ROS-i tootmist, samuti NFAT-i ja MAPK-i aktivatsiooni.

Happelise fosfataasina eksisteerib TRAcP paljudes rakkudes ja seda leidub rohkesti osteoklastides ja alveolaarsetes makrofaagides (Snipes, Lam, Dodd, Gray ja Cohen, 1986). TRAcP on osteoklastidele iseloomulik ensüüm ja selle ekspressioon on tihedalt seotud osteoklastide funktsiooniga, mida peetakse osteoklastide aktiivsuse ja luu resorptsiooni indikaatoriks (Minkin, 1982). Meie uuringus, CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)inhibeeris TRAcP-positiivsete rakkude arvu, mis näitab, et CDP blokeeris RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi(Cistanchedeserticolapolüsahhariid). Luumaatriksi lagunemine osteoklastide poolt sõltub katepsiin K-st (CTSK) ja MMP-dest (Gruber, 2015). Siin vähendas CDP oluliselt osteoklastide funktsionaalsete geenide, nagu Mmp9, Ctsk ja Acp5, ekspressiooni.

Osteoklastide diferentseerumist ja funktsiooni reguleerivad mitmed signaalirajad (Boyle, Simonet ja Lacey, 2003). Pärast RANK-iga seondumist värbab RANKL adaptervalgu TRAF6, et aktiveerida NFATc1 ekspressiooni, mis on osteoklastide moodustumise oluline transkriptsioonifaktor, mis mõjutab osteoklastide spetsiifilist geeniekspressiooni, sealhulgas TRAcP ja CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Selles uuringus leidsime, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)ei avaldanud mõju RANK ja TRAF6 ekspressioonile osteoklastides.Kuid CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)inhibeeris RANKL-i poolt indutseeritud NFATc1 aktivatsiooni BMM-ide osteoklastogeneesi ajal. Lisaks näidati, et ROS, mida toodavad mitokondrid elektronide kohaletoimetamise protsessis, soodustas osteoklastide proliferatsiooni ja diferentseerumist ning reguleeris luumaatriksi lagunemist (Ha et al., 2004). Hiljutine uuring näitas, et RANKL indutseeris Bach1 tuumaimporti ja nõrgendas Nrf2-vahendatud antioksüdantsete ensüümide tootmist, suurendades seeläbi rakusisest ROS-i ekspressiooni ja osteoklastogeneesi hiirtel (Kanzaki et al., 2017). Lisaks suurendas homotsüsteiini poolt rakusisene ROS-i teke doosteoklastide moodustumist ja aktiivsust (Koh et al., 2006). Meie uuring näitas, et CDP vähendas ROS-i akumuleerumist osteoklastides, inhibeerides NOS2 ekspressiooni ja soodustades antioksüdantsete ensüümide, nagu TRX1 ja glutatioonreduktaasi ekspressiooni. Kui ravisime BMM-e rakusisese ROS-i akumulatsiooni suurendamiseks peroksiidiga, selgus, et ROS-i suurendamine võib parandada NFATc1 ekspressiooni ülesvoolu. NFATc1. Samuti leidsime, et peroksiid päästis CDPon NFATc1 ekspressiooni inhibeeriva toime. Niisiis näitavad meie andmed, et CDP pärsib ROS-i akumulatsiooni, et inhibeerida NFATc1 ekspressiooni, seejärel repressosteoklastide moodustumist ja funktsiooni.

ERK, JNK ja p38 kuuluvad MAPK perekonda, mis on samuti seotud osteoklastide diferentseerumise reguleerimisega (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiveerib MAPK raja, suurendades ERK, JNK ja p38 fosforüülimist (Mizukami et al., 2002). Näitasime, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)represseeris MAPK raja võtmevalkude RANKL-vahendatud fosforüülimist, aidates sellega kaasa CDPon inhibeerivale toimele osteoklastide markergeenide ekspressioonile. Meile teadaolevalt on see esimene uuring, mis näitab CDP inhibeerivat toimet(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)ROS-i tootmisel, NFAT-i ja MAPK aktiveerimisel, mis esindavad CDP uudseid toimemehhanisme in vitro.

Kokkuvõttes näitasime, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)nõrgendab osteoklastogeneesi ja hüdroksüapatiidi resorptsiooni ning osteoklastide markergeenide, sealhulgas Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ekspressiooni. CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)suutis alla suruda RANKL-i vahendatud ROS-i tootmist, samuti NFAT-i ja MAPK aktiveerimist (joonis 8). Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)võib olla kandidaatravim osteoklastidega seotud seisundite raviks, millega kaasneb ROS-i ületootmine.

JOONIS 8 CDP skemaatiline diagramm(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)funktsioon osteoklastide diferentseerumisel. CDP(Cistanchedeserticolapolüsahhariid)pärsib RANKL-i poolt indutseeritud ROS-i tootmist, samuti NFATc1 ja MAPK aktivatsiooni, inhibeerides seega osteoklastogeneesi. CDP,Cistanchedeserticolapolüsahhariid; MAPK, mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas; NFATc1, aktiveeritud T-raku tuumafaktor; RANKL, tuumafaktori κBligand retseptori aktivaator; ROS, reaktiivsed hapniku liigid [Värvilist joonist saab vaadata aadressiltwileyonlinelibrary.com]

TUNNUSTUS

Seda uuringut toetasid Hiina loodusteaduste sihtasutus (81572164), Hiina riiklik võtmetehnoloogia uurimis- ja arendusprogramm (2017YFC1103300), Guangxi provintsi loodusteaduste sihtasutus (2016GXNSFAA380295) ja Guangxi provintsi ülikooli teaduse ja tehnoloogia uurimisprojekt (BKY25415). ). Seda toetavad osaliselt ka Guangxi teadusuuringute ja tehnoloogia arengukava projekt (GKG13349003, 1598013-15), Lääne-Austraalia meditsiini- ja terviseuuringute infrastruktuurifond, Arthritis Australia Foundation, Lääne-Austraalia ülikooli (UWA) teaduskoostöö auhinnad ning Austraalia tervishoiu ja meditsiini auhind. Teadusnõukogu (NHMRC, nr 1107828 ja 1027932).

HUVIDE KONFLIKTID

Autorid kinnitavad, et huvide konflikti ei esine

Saatja: 'Cistanchedeserticolapolüsahhariidnõrgendab osteoklastogeneesi ja luu resorptsiooni, pärssides RANKL-i signaaliülekannet ja reaktiivsete hapnikuühendite tootmist (Dezhi Song jt

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684