Kõrge eraldusvõimega tandem-massispektromeetria tuvastab 2. tüüpi suhkurtõvega patsientide varase diabeetilise neeruhaiguse spetsiifilise gangliosiidi mustri Ⅱ

2.2. HCD MS/MS poolt makroalbuminuuriaga seotud polüsialüülitud liikide üksikasjalik struktuurianalüüs

HR-MS sõeluuring näitas, et makroalbuminuuriaga patsientide gangliosiidi iseloomustab kõrgenenud üldine siaalhappe sisaldus. A3 proovis tuvastati suure massitäpsusega vähemalt neli GQ1 klassi pentasialogangliotetraoosi. Ioon m/z juures 812,7{{10}}68, mis tuvastati ainult A3 sõelumismassispektris, määrati massi arvutamise järgi kolmekordselt deprotoneeritud ja naatriumitud GQ1-le (d18:1/18). :0). Selle makroalbuminuuriaga seotud liigi üksikasjalikuks struktuuriliseks iseloomustamiseks eraldasime iooni m / z 812, 7068 juures ja esitasime selle HCD MS / MS-le HR-is negatiivse iooni režiimis. Selle tandem-MS eksperimendi eesmärgid olid: (i) oligosahhariidahela struktuuri uurimine; (ii) kinnitus keramiidi koostisele, mis eeldati kogu GQ1 molekulide massi arvestades; (iii) spetsiifiliste andmete kogumine Neu5Ac monosahhariidide lokaliseerimise kohta piki oligosahhariidi karkassi, mis viib isomeeride eristamiseni viiest kõige levinumast GQ1 (d18:1/18:0) struktuurist (joonis 3), mis võivad esineda uriinis. makroalbuminurilised patsiendid.

Kujutatud on [M-4H+Na]3− prekursoriooni fragmentatsioonispekter, mis tuvastati m/z 812,7068 juures ja mis genereeriti kahe minuti jooksul muutuva kokkupõrkeenergiaga vahemikus 30–80 eV saadud TIC kombineerimisel. joonisel 4.

Joonis 3. GQ1(d18:1/18:0) viis levinumat isomeeri: (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) isomeer; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) isomeer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)isomeer; (D) GQ1d(d18:1/18:0) isomeer; (E) GQ1e(d18:1/18:0) isomeer.

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIKU ORGAANILISTE KISTANŠEKSTRAKTIDE SAAMISEKS KLIKI SIIN

MS/MS andmed kinnitavad (d18:1/18:0) keramiidi koostist Y0 järgi m/z 564,8704 ja Y1 m/z juures 726,5845 mis vastab Glc-Cer järjestusele, samuti sisemine lõhustamisioon S, m/z 325,1828 juures, mis vastab C18:0 rasvhappele (joonis 5). Samuti on dokumenteeritud ka molekuli üldine sialüülimise staatus. Seega, B1 ioon, mis tuvastati m/z 290,0868 ja selle naatriumivastane vastand m/z 312,0686 juures, vastab ühe Neu5Ac jäägi eraldumisele lähteioonist koos distaalse elemendiga, mis tuvastati m/z 581,1807 ja m/z 6203 juures. , kinnitage Neu5Ac-Neu5Ac sideme esinemist.

Joonis 5. [M-4H++Na+ ] 3-prekursori poolt kogetud fragmentatsiooni skeem HCD MS/MS abil m/z 812,7068 juures ja GQ1d struktuurse isomeeri ioonide järjestuse diagnostika.

Arvestades Neu5Ac jääkide kõige levinumat aheldusasendit kas sisemise või välise Gal juures, on GQ1 (d18:1/18:0) jaoks viis võimalikku struktuurikandidaati, nagu on näidatud joonisel 3. Kuid ioon m/z 1032,3662, mis on moodustatud kaksiksidemest ja sisemisest risttsükli lõhustumisest ning on määratud Z4 /Y0/ 2,4A2-le koos iooniga, mis tuvastati m/z juures 936,7894 kui Y2 / 3,5A1, toetab kõigi nelja Neu5Ac jäägi kinnitamist sisemise Gal. Kuigi teiste struktuursete isomeeride esinemist ei saa täielikult välistada, näitavad need kaks fragmentiooni, et struktuurne motiiv on kooskõlas (D) kandidaadiga, mis vastab GQ1 d-isomeerile (d18:1/18:0). , on A3 proovis kindlasti olemas. Skeem joonisel fig 5 kujutab killustumise rada, mida kogeb GQ1d (d18:1/18:0) vastav prekursorioon.

Järgmine makroalbuminuuriaga seotud polüsiaalne kandidaat üksikasjaliku struktuurianalüüsi jaoks on [M-3H+ ] 3− ioon, mis tuvastatakse ainult A3 proovi sõelumismassispektris m/z 708,3379 juures ja määratakse täpse massiarvutuse alusel kuni GT1(d18:1/18:0). See ioon eraldati ja viidi läbi fragmentatsioonianalüüsi tandem-MS abil, kasutades HCD-d. 2-minutise muutuva kokkupõrkeenergiaga vahemikus 30 kuni 80 eV saadud skaneeringute summeerimisel genereeritud tooteioonide spekter on esitatud joonisel 6 koos selle liigi keemilise struktuuri ja peamiste signaalide määramisega. Fragmenteerimismehhanism kasutatud MS/MS tingimustes koos diagnostiliste fragmentioonidega on kujutatud joonisel 7. Kõigi määratud produktiioonide nähtavuse suurendamiseks täiendab tabel 3 joonisel 6 esitatud spektris tuvastatud signaalide loendit.

Joonis 6. Struktuurianalüüs (−) nanoESI HR HCD MS/MS [M-3H+ ] 3− prekursori ioonist, mis tuvastati A3 proovis m/z juures 708,3379, mis vastavalt massi arvutamiseks, vastab GT1(d18:1/18:0). Omandamise aeg: 2 min; muutuv kokkupõrkeenergia vahemikus 30–80 eV. Inset: MS/MS andmetest tuletatud isomeeri GT1b (d18:1/18:0) struktuur.

HCD killustumine põhjustas mitmete järjestuste ioonide moodustumist, mis tekkisid glükosiidsidemete ja risttsüklite lõhustumise tulemusena. Need ioonid on väga kasulikud kogu süsivesikute järjestuse määramiseks, GT1 asendiisomeeride tuvastamiseks ja keramiidi aglükooni koostise kinnitamiseks.

D18:1/18:0 keramiidi tüüpi näitab Y0 ioon m/z 564,5353 juures ja seda toetab Glc-Cer järjestus, mis on tuvastatud Y1 kaudu m/z juures 726,5879. Lisaks tõendab ioonide määramine GT1 isovormi olemasolu. NeuAc-GalNAc koostisega ioon m/z juures 493,1669 võib pärineda eranditult GT1-st, mida iseloomustab GalNAc jäägi sialüülimine. Ülejäänud fragmendi ioonid viitavad GT1b struktuurse isomeeri olemasolule A3 proovis. GT1b struktuuri toetavad kõik molekuli mitteredutseerivast otsast tulenevad ioonid, mis on dokumenteeritud Y-tüüpi seeriaga, millega kaasnevad kaks Z-iooni, millest üks esineb väiksema arvukusega (joonis 6). Siiski annab Y2 /B2, mis on tuvastatud mõõduka arvukusega ioonina m/z 888,6405 juures, tõendeid Gal-Glc-Cer järjestuse kohta, mis võib pärineda kas GT1a või GT1b isomeerist pärast vastavat desialüülimist kas Neu5Ac või Neu5Ac-Neu5Ac eraldumisega. sisemisest Gal või isomeerist, mis sisaldab asendamata sisemist Gal, nagu GT1d.

Teisest küljest kinnitab m/z 734.5701 juures tuvastatud Y2 disialo Neu5AcNeu5Ac elemendi lokaliseerimist sisemises Gal-s, mis on GT1b isomeeriga kooskõlas olev konfiguratsioon. Distaalse rühma olemasolu tõendab ka B2 ioon m/z juures 581,1828.

HCD MS/MS-is on mitmed signaalid seotud molekuli osalise desialüülimisega, näiteks Y4 ja/või Y3 ioonid, mis vastavad desialüülitud Gg4Cer järjestusele; need ioonid ei saa aga näidata Neu5Ac kinnituskohti neutraalses Gg4 glükaani tuumas. Lisaks on signaal m/z 364,1243 juures, mis vastab GT1b sisemise lõhustamise B3 /B1 ioonile määratud Gal-GalNAc järjestusele, omistatav GT1c isomeerile, kuna see glükovorm sisaldab asendamata terminaalset Gal-GalNAc disahhariidi. Seega, välja arvatud Y2, mis on seotud GT1b-ga, võivad kõik ioonid tuleneda teistest Neu5Ac positsioonilistest isomeeridest, nagu GT1a, GT1, GT1c või isegi harva teatatud GT1d. Teisest küljest võib Y2 ise olla väikese tõenäosusega sündmuse tulemus, mis kõrvaldas ka Neu5Ac sisemise Gal-iga seotud katseelemendist.

Arvestades, et välja arvatud GT1 avaldamine, ei suutnud glükosiidsideme lõhustamisega seotud MS/MS andmed A3 segus üheselt määrata teisi GT1 isomeere, analüüsisime tsükli lõhustamise ioone hoolikamalt, et avastada võimalikku GT1b-d toetavat sisemist killustumist. Märkasime madala intensiivsusega kolmekordselt laetud iooni m/z juures 634,6067, mis on kooskõlas 0,2 tüüpi risttsükli lõhustumisega ühes terminaalses siaalhappejäägis, mis GT1b liikide puhul võib esineda kas 0, 2X4 või 0,2X3 või mõlemat. Kuna GT1b isomeer on üldiselt levinum kui GT1, on joonistel fig 6 ja 7 toodud ioonide määramine ja GT1b-le omane killustumisskeem.

Gal-GalNAc-Gal ahela sümmeetria tõttu ei ole võimalik teisi struktuurseid isomeere täielikult välistada. Kuigi HCD MS/MS andmed näitavad GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ja GT1b(d18:1/18: 0) A3 proovis ei saa välistada teiste GQ1 ja GT1 isomeeride võimalikku esinemist. Kuid meie leiud näitavad, et kolm isomeeri - GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) ja GT1 (d18:1) /18:0) on kindlasti A3 proovis olemas ja neid võib edasi uurida makroalbuminuuria molekulaarsete markeritena.

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Õppeaine registreerimise kriteeriumid

Meetodi väljatöötamiseks ja valideerimiseks hinnati läbilõikelises pilootuuringus 2. tüüpi DM patsientide ja tervete kontrollsubjektide skriiningkohordi. Kokku 30 nefroloogia ambulatoorses osakonnas ning diabeedi ja ainevahetushaiguste ambulatoorses osakonnas käinud 2. tüüpi DM patsienti jagati 3 rühma vastavalt.uriini albumiin/kreatiniini suhe(UACR) järgmiselt: 10 patsienti normoalbuminuuriaga (A1, defineeritud kui UACR < 30 mg/g), 10 mikroalbuminuuriaga (A2, UACR 30–300 mg/g) ja 10 makroalbuminuuriaga (A3, UACR > 300 mg/g) g). Sellesse uuringusse kaasati ka kümme vanuse ja sooga sobivat tervet kontrollsubjekti (C), kes käisid üldarsti vastuvõtul rutiinsetel kontrollidel ilma teadaoleva neeruhaiguseta ja ilma DM-ita (välja arvatud HbA1c väärtusega 5,6% või vähem). Uuring

Kõigil uuringusse kaasatud patsientidel oli DM-i minimaalne 5-aastane kestus, stabiilne neerufunktsioon vähemalt 2 aastat, hea vererõhu kontroll (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for neeru biopsia(hematuuria ja muude proteinuuria põhjuste puudumine, GFR kiire langus).

3.2. Eetikaavaldus

Uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsioonile ja protokolli kiitis heaks asutuse teadusuuringute eetikakomitee (Humanõpingute juhatus - "Victor Babes" Meditsiini- ja Farmaatsiaülikool, Timisoara, nr 15/12.09.2016). Maakonna kiirabihaigla, nr 100/23.11.2016). Kõik patsiendid ja kontrollid nõustusid uuringus osalema, allkirjastades teadliku nõusoleku vormi.

3.3. Laboratoorsed hinnangud

30 2. tüüpi DM patsiendi uriini gangliosiidi uuriti ristlõike pilootuuringus, kasutades 10 tervet kontrolli. Biokeemilised parameetrid viitasid seerumi uureale ja kreatiniinile, 24-tunnisele proteinuuriale, UACR-ile, uriini settele ja uriinikultuurile. Kõik patsiendid olid kuseteede infektsioonide suhtes negatiivsed. Natiivsete gangliosiidisegude koostis tuvastati 24 tunni jooksul kogutud uriiniproovidest. Patsientide ja kontrollide uriiniproove säilitati lühiajaliselt temperatuuril –20 ◦C ja sulatati enne analüüsi.CKDmääratleti vastavalt KDIGO juhendile hindamiseks jakroonilise neeruhaiguse ravi. eGFR arvutati kasutadeskrooniline neeruhaigusepidemioloogia koostöövõrrandi valem (CKD-EPI kreatiniini 2009 võrrand) [16].

3.4. Gangliosiidi ekstraheerimine ja puhastamine

Gangliosiidi ekstraheerimisel järgiti Svennerholmi ja Fredmani [17] välja töötatud ja Vukeli´c jt poolt modifitseeritud meetodit. [18]. Varem kohandasime seda protokolli gangliosiidide ekstraheerimiseks ja puhastamiseks kehavedelikest ning rakendasime seda tserebrospinaalvedeliku (CSF) gangliosiididele. Meetodit on üksikasjalikult kirjeldatud meie eelmises uuringus, mis käsitles CSF gangliosiidide profiilide koostamist ja fragmentatsiooni analüüsi massispektromeetria abil [19]. Lühidalt öeldes ekstraheeriti lipiide kaks korda kloroformi (C)/metanooli (M)/vee (W) seguga kogumahu suhteni 1:2:0,75 C/M/W, kusjuures "W" vastas. uriiniga; seetõttu sisaldas segu 4 ml C, 8 ml M ja 3 ml uriiniproovi. Analüütilise puhtusega kloroform ja metanool osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa) ja neid kasutati ilma täiendava puhastamiseta. Pärast faaside täielikku eraldamist, järgides punktis [19] kirjeldatud protseduure, koguti polaarseid glükosfingolipiide sisaldav ülemine faas.

Kogutud toorgangliosiidide puhastamine saavutati mitmes etapis [19]: sadestunud valgu-soola komplekside eemaldamine, millele järgnes tsentrifuugimine, geelfiltreerimine Sephadex G-25 kolonnis (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA ) väikese molekulmassiga saasteainete eemaldamiseks ja lõpuks üleöö dialüüs temperatuuril 4 ◦C vee vastu. Gangliosiidid ekstraheeriti identsetes tingimustes kõigist uriini alikvootidest, saades A1 (normoalbuminuuria), A2 (mikroalbuminuuria), A3 (makroalbuminuuria) ja C (kontroll) segud.

3.5. Proovi ettevalmistamine massispektromeetria jaoks

Puhastatud A1, A2, A3 ja C gangliosiidi ekstraktid aurustati täieliku kuivaks SpeedVac Concentrator SPD 111 V süsteemis (Savant, Düsseldorf, Saksamaa), mis oli ühendatud vaakumpumbaga. MS-sõeluuringu jaoks lahustati iga kuivekstrakt põhilahuse saamiseks puhtas metanoolis ja säilitati temperatuuril –20 ◦C. Enne MS analüüsi tsentrifuugiti põhilahuseid Sigma 2–16 mudeltsentrifuugis (Sartorius AG, Göttingen, Saksamaa). Orbitrap MS infusiooni jaoks saadi tööproovid kontsentratsiooniga 5 pmol·µL-1 puhtas metanoolis, lahjendades põhilahuse alikvoote. Gangliosiidi kontsentratsioon infundeeritud lahuses arvutati keskmise molekulmassi jaoks 2000 g mol-1.

3.6. Orbitrap massispektromeetria nanoESI-ga

MS katsed viidi läbi LTQ Orbitrap Velos Pro™ massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksamaa), mis oli varustatud võrguühenduseta nanoES allikaga ES 259 ​​(Thermo Fisher, Bremen, Saksamaa).

Seade on hübriidmassispektromeeter, mis ühendab kahte erinevat tüüpi massianalüsaatorit ja pakub palju eeliseid: kõrge tundlikkus ja täpsus, hea andmete kvaliteet ja analüüsi kiirus, võimalus tuvastada väiksemaid komponente keerukates segudes, väike proovikulu, ning ristküsitluse ja proovist proovile ülekandmise vältimist.

Esimene analüsaator on kahe rõhuga lineaarne kvadrupoolne ioonilõks, mis on võimeline eraldama iooni kindla massi-laengu suhtega (m/z) ja aktiveerima selle, suunates ioonidesse kineetilise energia konkreetse m/z-ga. tekitada kokkupõrkest tingitud dissotsiatsiooni. Teine analüsaator on Orbitrap, mis koosneb silindrilisest väliselektroodist ja silindri sisemisest elektroodist, püüdes ioone ümber sisemise elektroodi ringikujulistele orbiitidele. Sellel on suurepärane lahutusvõime ja see pakub võimalust sekveneerida keerukaid ioonliike mitmeetapilistes MS (MSn) katsetes tõhusate killustustehnikate abil.

Borosilikaatkapillaare (pikkusega 10 cm) tõmmati Sutter p-97 mikropipetitõmbajaga, et saada elektropihustuskapillaare, mille otsa suurus oli 10 µm ja koonuse pikkus 4 mm. Emitteri tagaossa sisestati 10 µl lahust kontsentratsiooniga 5 pmol·µL −1 metanoolis ja lahusesse sisestati 0,25 mm plaatinatraat. Plaatinatraadile ja koonusele rakendatud potentsiaaliväärtusi reguleeriti püsivalt, et saavutada komponentide tõhus ionisatsioon. NanoESI protsess käivitati instrumentaalsete parameetrite seadmisega järgmiselt: nanoESI pinge, 0,80 kV; koonuspinge, 40–60 V; desolvatsioonitemperatuur, 80 ◦C; S-objektiivi RF tase, 60%. Need MS-i parameetrite väärtused suurendasid ionisatsiooni ja pidevat pihustamist ning minimeerisid samal ajal gangliosiidimolekuli oligosahhariidsüdamiku külge kinnitatud labiilse Neu5Ac jäägi päritolu fragmentatsiooni.

Kõik massispektrid (MS ja tandem-MS) saadi HR-režiimis, negatiivse iooni režiimi tuvastamisel ja vahemikus 200–2000 m/z. MS-skaneeringud saadi eraldusvõimega 60 000. Massispektromeetrit kasutas ja juhtis LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Saksamaa) ning MS andmete kogumine ja töötlemine saavutati tarkvara Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Bremen, Saksamaa) abil.

MS/MS katsed viidi läbi LTQ-s CID-ga põrkekambris, kasutades kokkupõrkegaasina heeliumi 5.{1}} puhtust rõhul 50 psi. MS/MS skaneeringud saadi eraldusvõimega 20,000. Ioonide valik ja killustamine viidi läbi käsitsi. Eelkäijaioonid valiti isolatsioonilaiusega 1 m / z ühikut ja killustati HCD-ga, kasutades muutuva kokkupõrkeenergiaga vahemikus 30–80 eV, et suurendada fragmentioonide katvust.

Kogunenud skaneeringute kombineerimisel saadud TIC-d ja massispektrid töödeldi Xcalibur 2.1 tarkvaraga (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), mis võimaldab spektreid eraldada, samuti neid siluda ja lahutada.

Enne katseid kalibreeriti m/z skaala väliselt, kasutades selleks spetsiaalset referentsi, mis on kaubanduslikult tuntud kui Pierce® ESI Negative Ion Solution firmast Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Negatiivsete ioonide režiimis andis see standard nii MS kui ka tandem-MS katsetes skaneeritud m/z vahemiku õiglase ioonilise katvusega spektri.

NanoESI MS ja MS/MS tingimuste optimeerimiseks negatiivsete ioonide režiimis, võrdlemiseks ja andmete hindamiseks mõõdeti järgmisi kaubanduslikult saadaolevaid standardseid gangliosiidifraktsioone: GM1 (veise aju); GD1a, GD1b, GT1b ja GQ1b (sea aju); ning GM3 ja GD3 (veisepiim) firmalt Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA), samuti veise aju kogu gangliosiidi ekstrakt, kaubanduslikult tuntud kui Cronassial segu, Abano Termest (Padova, Itaalia).

3.7. Gangliosiidide lühend

Gangliosiidide määramiseks kasutati Svenner-holmi [20] 1980. aastal kasutusele võetud lühendite süsteemi koos IUPAC-IUB biokeemilise nomenklatuuri komisjoni 1998. aasta soovitustega [21] järgmiselt:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a või GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 või 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 või 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. MS andmete tõlgendamine

Kuna seni pole saadaval spetsiaalset arvutitarkvara, andmebaase ega muid IT-teenuseid, mis aitaksid gangliosiidide sõeluuringu ja tandemmassispektrite tõlgendamist, määrati selles uuringus tuvastatud molekulaarsed ioonid gangliosiidiliikidele täpse massi arvutamise ja põhjal. teabest, mida me olime seda tüüpi glükosfingolipiidide ja teadaolevate biosünteesi radade kohta varem omandanud. MS ja MS / MS andmete ja massiarvutuste tõlgendamisel abistas meid gangliosiidi molekulaarsete ja fragmentide ioonide suur inventar, mida oleme siiani tuvastanud ja iseloomustanud erinevates inimkudedes ja vedelikes, kasutades täiustatud MS-i lähenemisviise. Need struktuurid esindavad meie esialgseid andmebaase, mis sisaldusid meie varem avaldatud uuringutes [12, 19, 22–31]. Selles töös kirjeldatud uudsed liigid täiendavad meie praegust gangliosiidide registrit.

HCD MS/MS-is genereeritud oligosahhariidide karkassi järjestuse ioonide määramine järgis üldtunnustatud nomenklatuuri [24, 25].

4. Järeldused

Selles uuringus töötasime välja HR MS-l ja tandem-MS-il põhineva lähenemisviisi gangliosiidi määramiseks DKD-s normo-, mikro- ja makroalbuminuuriaga patsientide ning tervete kontrollide uriiniekstraktide võrdleva analüüsiga, mis viidi läbi identse lahusega. ja instrumentaalsed tingimused. Meie uuringu lõppeesmärk oli välja selgitada DKD vs kontrollrühmas ja haiguse erinevates staadiumides ekspresseeritud neeru gangliosiidide koostises ja struktuuris esinevad muutused.

Selleks otstarbeks optimeeritud MS-platvormi kõrge tundlikkus, reprodutseeritavus, eraldusvõime ja massitäpsus võimaldasid meil kindlaks teha, et ekspresseeritud liikide sialüülimise aste näib mängivat haiguse progresseerumisel olulist rolli, esindades DKD markerit. , isegi II tüüpi DM patsientide normoalbuminuuria staadiumis. Lisaks näitavad Cer koostises täheldatud modifikatsioonid, et glükaani struktuuri kõrval võib lipiidiosa pidada ka DKD etappide molekulaarseks sõrmejäljeks.

Uurimistöö arenenumas faasis kasutati võimaliku biomarkeri rolliga liikide struktuurianalüüsiks HCD MS/MS-i. A3 proovi puhul leiti molekulaarsed ioonid, mis massiarvutuse järgi vastavad GQ1(d18:1/18:0) ja GT1(d18:1/18:{{1). 0}}) isoleeriti ja killustati instrumendi põrkekambris. Nende katsete eesmärk oli koguda teavet molekuli üksikasjaliku struktuurse konfiguratsiooni kohta. Optimeeritud sekveneerimistingimused, eriti kokkupõrke energiavahemik ja põrkegaasi rõhk, kutsusid esile glükosiidsidemete spetsiifilised lõhenemised, mille tulemuseks oli fragmentioonide moodustumine, mis tuvastati tandem-massispektrites oluliste signaalidena. Leiti, et gangliosiidimolekuli süsivesikute ahelas olevate Neu5Ac fragmentide lokaliseerimisega seotud teatud isomeeride jaoks diagnoositi mitu iooni. Nende struktuurselt informatiivsete järjestuste ioonide põhjal avastasime, et GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) ja GT1b(d18:1/18: 0) isomeerid esinevad A3 proovis ja on seotud makroalbuminuuriaga.

Saadud tulemused nõuavad mõningate hüpoteeside täiendavat kinnitamist pikisuunalistes uuringutes, mis viidi läbi suurematel kohortidel, et tõestada põhjuslikku seost uriinis tuvastatud gangliosiidide keerukuse vahel.DKD patsiendidja väga varajane neerukahjustus 2. tüüpi DM-i käigus, isegi normoalbuminuuria staadiumis. Siiski leiame, et praegused leiud avavad uurimissuuna gangliosiidide sialüülimise, O-atsetüülimise ja O-fukosüülimise ning nende O-GalNAc ja CH3COO− poolt tehtud modifikatsioonide rolli uurimiseks haiguse progresseerumisel. Nende tulemuste teine ​​kasulik aspekt on DKD varajase diagnoosimise protseduuride võimalik väljatöötamine, mis põhinevad gangliosiidide profiilide koostamisel, kasutades täiustatud massispektromeetriat.

Viited

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Suhkurtõve ja hüpertensiooni roll kroonilises neeruhaiguses.J. Ren. Inj. Eelmine2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. US Renal Data System 2020 Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States.Olen. J. Kidney Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Diabeetilise neeruhaiguse patofüsioloogia ja ravi ajakohastamine.J. Med. Assoc.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Neerufunktsioon diabeetiliste haiguste mudelites: torukujuline süsteem diabeetilise neeru patofüsioloogias.Annu. Rev. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, O.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; et al. Põletikueelseid tsütokiine seostatakse II tüüpi suhkurtõvega patsientidel podotsüütide kahjustuse ja proksimaalse tubulaarse düsfunktsiooniga diabeetilise neeruhaiguse varases staadiumis.J. Diab. Keeruline.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; et al. Kuseteede podotsüütidega seotud mRNA tasemed korreleeruvad II tüüpi suhkurtõve varase diabeetilise nefropaatia proksimaalsete tuubulite düsfunktsiooniga.Diabetol. Metab. Syndr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Song, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Gangliosiidi GM3 vähenemine rottide streptosotsiini poolt indutseeritud diabeetilistes glomerulites.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. a-seeria Gangliosiidid vahendavad täiustatud glükatsiooni lõpptoodete mõju peritsüütide ja mesangiaalsete rakkude proliferatsioonile: kas tavaline vahendaja võrkkesta ja neerude mikroangiopaatia korral?Diabeet2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

9. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Glükosfingolipiidide akumuleerumise roll streptosotsiini poolt indutseeritud suhkurtõve neerude hüpertroofias.J. Clin. Uurige.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Ene, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Diabeetilise nefropaatia jälgimine ringlevate gangliosiidide abil.J. Immunoass. Immunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]