Fosforirikas dieet kutsub esile Bmp2 ja Spp1 MRNA ekspressiooni ülesreguleerimise roti neerus

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Kõrge fosforisisaldusega (P) dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi tekkemehhanismi selgitamiseks keskendusime luudega seotud valkudele, nagu luu morfogeneetiline valk 2 ja osteopontiin. Selles uuringus uuriti kõrge P-sisaldusega dieedi mõju Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressioonile rottidel.neerud. Wistari rotid jagati kahte rühma ja neile toideti kontrolltoitu (kontrollrühm) või kõrge P-sisaldusega dieeti (kõrge P-rühma).Neerkaltsiumi ja P kontsentratsioonid tõusid märkimisväärselt kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga. Nii Bmp2 kui ka Spp1 mRNA ekspressioon suurenes märkimisväärselt kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga. Need tulemused näitavad, et kõrge P-sisaldusega dieet kutsub esile Bmp2 ja Spp1 mRNA ülesreguleerimiseneerud.

Märksõnad: kõrge fosforisisaldusega dieet, nefrokaltsinoos, Bmp2, Spp1,neerud, rott

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:emily.li@wecistanche.com

cistanche neeruhaiguste raviks

Sissejuhatus

Nefrokaltsinoos on haigus, mida iseloomustab kaltsiumi (Ca) ladestumine neeru parenhüümis. Eelkõige toidus saadav fosfor (P) on selle häire arengus pöördeline tegur. On näidatud, et kõrge P-sisaldusega dieedi manustamine suurendab Ca kontsentratsiooni veresneerudja Ca ladestumine neeru parenhüümis1-6）. Kuigi käimasolevate uuringute keskmes on kõrge P-sisaldusega dieedi mõju nefrokaltsinoosi tekkele, on selle häire tekkemehhanismi kohta vähe teada. Seetõttu on vaja see probleem õigeaegselt lahendada.

Teatasime, et histoloogilisel uurimisel, kasutades transmissioonelektronmikroskoopiat, täheldati kõrge P-sisaldusega dieediga toidetud rottide neerutuubulites hüdroksüapatiiditaolisi nõelakujulisi kristalle6, 7）. Röntgenikiirguse mikroanalüüs näitas, et kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud Ca ladestused koosnevad peamiselt Ca-st ja P7-st. Need tulemused näitasid, et kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud Ca ladestused on hüdroksüapatiidi vorm. Selle leiu põhjal oletame, et nefrokaltsinoosi arengut kontrollib mehhanism, mis on sarnane luu moodustumise mehhanismiga. Seetõttu keskendus käesolev uuring luuga seotud valkudele, nagu luu morfogeneetiline valk 2 (BMP2). BMP2 on osteogeenne tegur, millel on osteogeneesi indutseeriv aktiivsus8, 9）. Tähelepanuväärne on see, et BMP2 tuvastati emakavälist esilekutsuva tegurinaluumoodustamine10, 11). Seega püstitasime hüpoteesi, et kui BMP2 mängib olulist rolli nefrokaltsinoosi tekkes, siis selle valgu ekspressioonneerudseda reguleeriks kõrge P-sisaldusega dieet. Käesoleva uuringu eesmärk oli välja selgitada, kas kõrge P-sisaldusega dieet mõjutab Bmp2 mRNA ekspressiooni veresneerud.

Vahepeal teatas meie eelmine uuring, et kõrge P-sisaldusega dieet suurendab osteopontiini (OPN) ekspressiooni neerutuubulites, kasutades immunohistokeemilist analüüsi, mis viitab sellele, et OPN võib olla seotud kõrge P-sisaldusega dieediga indutseeritud Ca ladestumise tekkega12. Seetõttu uurisime muutusi Spp1 mRNA ekspressioonisneerudsamuti.

Käesoleva uuringu tulemused võivad anda väärtuslikku teavet mehhanismi kohta, mis vastutab kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi tekke eest.

materjalid ja meetodid

Loomad ja dieedid.

Käesoleva uuringu kiitis heaks Tokyo Põllumajandusülikooli loomade kasutamise komitee ning kõiki loomi peeti vastavalt ülikooli laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhistele (kinnitus nr 300049).

Oluline on märkida, et emastel rottidel tekib nefrokaltsinoos kergemini kui isastel rottidel13, 14）. Lisaks teatasime, et kõrge P-sisaldusega dieet suurendab OPN-i ekspressiooni emaste rottide neerutuubulites 12）. Käesolevas uuringus kasutati seejärel katseloomadena emaseid rotte. Nelja nädala vanuseid emaseid Wistari rotte (Clea Japan, Tokyo, Jaapan) hoiti üksikutes roostevabast terasest traatvõrgust puurides. Katseperioodil asusid puurid kontrollitud valgustusega ruumis 12-h valgus: pimeduse tsükkel (valgus, 0800-2000 h), temperatuur 22 ± 1 kraadi ja suhteline õhuniiskus 60 protsenti kuni 65 protsenti.

Eksperimentaalsete dieetide koostis on näidatudTable 1. Eksperimentaalsed dieedid koostati AIN{{0}}G-dieedi15 põhjal). Eksperimentaalsed dieedid sisaldasid kahte erinevat P kontsentratsiooni (kontrolldieet, 0,3 protsenti; kõrge P-sisaldusega dieet, 1,5 protsenti). P-kontsentratsioon kõrge P-sisaldusega dieedis määrati 1,5 protsendile, kuna meie varasemad uuringud näitasid, et 1,5-protsendiline P kontsentratsioon toidus indutseerib

raske nefrokaltsinoos6, 7, 12, 14） ja kõrge OPN ekspressioon12）. Kõigil eksperimentaalsetel dieetidel oli sama Ca kontsentratsioon (0,5 protsenti). P ja Ca kontsentratsioonid, mis on määratud eksperimentaalsete dieetide analüüsiga, on näidatudTable 1. Enne uuringu algust aklimatiseeriti kõiki rotte 7 päeva, mille jooksul anti neile vaba juurdepääs kontrolltoidule ja deioniseeritud veele. Pärast aklimatiseerumisperioodi jagati rotid juhuslikult kahte sarnase keskmise kehakaaluga rühma ja neile toideti 14 päeva jooksul kas kontrolltoitu (kontrollrühm) või kõrge P-sisaldusega dieeti (kõrge P-rühm). Rottidele anti kogu katseperioodi vältel vaba juurdepääs määratud katsetoidule ja deioniseeritud veele. Katseperioodi lõpus eutaniseeriti rotid anesteetikumi segu (medetomidiin, midasolaam ja butorfanool) intraperitoneaalse süstiga ning vere janeerudproovid koguti analüüsiks. Vereproovid tsentrifuugiti ja supernatante kasutati seerumiproovidena. Neerud eemaldati ja neerukapsel visati ära. Seerum janeerudproove hoiti analüüsiks vajamiseni temperatuuril -80 kraadi. Paremat neeru kasutati Bmp2 ja Spp1 mRNA kvantitatiivseks analüüsiks ja vasakutneerudkasutati Ca ja P kontsentratsioonide analüüsimiseks.

Mineraalide analüüs.

Eksperimentaalsete dieetide näidised janeerudtuhastati 550 kraadi juures 48 tundi muhvelahjus ja mineraalid ekstraheeriti analüüsimiseks 1 mol/L HCl-ga. Ca kontsentratsioonid eksperimentaalsetes dieetides janeerudmäärati aatomabsorptsioonspektrofotomeetriaga16）. P kontsentratsioonid eksperimentaalsetes dieetides janeerudanalüüsiti Gomori17) meetodil.

Bmp2 ja Spp1 mRNA kvantitatiivne analüüs.

Kogu RNA eraldati homogeniseeritud neerust, kasutades TRIzol reagenti (Life Technologies, CA, USA) vastavalt tootja spetsifikatsioonidele. RNA kogust ja puhtust hinnati NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) abil. cDNA sünteesiti SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMixi abil qRT-PCR (Life Technologies) jaoks ja seejärel allutati kvantitatiivsele reaalajas RT-PCR-ile, kasutades SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Bmp2 (edasi, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; tagurpidi, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (edasi, 5'-) analüüsimiseks kasutati spetsiifilisi praimereid18-20) TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; tagurpidi, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') ja Gapdh (edasi, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; tagurpidi, 5'-GCAT-CACCCCCC{{ATTT26}CACCCC{{ATTT26} }'). Reaalajas PCR-reaktsioon viidi läbi StepOne'i reaalajas PCR-süsteemi abil (Applied Biosystems, CA, USA) ja mRNA ekspressioonitasemed normaliseeriti Gapdh mRNA tasemetele. Kontrollrühma väärtuseks loeti 1,00.

Statistiline analüüs.

Tulemused on esitatud keskmistena ± SEM iga 6 roti rühma kohta. Pärast F-testi läbiviimist dispersioonide homogeensuse määramiseks kasutati Studenti t-testi, et määrata kahe rühma vahel olulised erinevused. Kui dispersioonide homogeensus ei olnud võrdne, kasutati Studenti t-testi asemel Welchi t-testi. Erinevusi peeti olulisteks p ＜ 0,05 juures

Tulemused

Kehakaalu, toidutarbimise ja seerumi analüüs.

Lõplik kehakaal ja toidu tarbimine vähenesid oluliselt kõrge P-ga rühmas võrreldes kontrollrühmaga (Tabel 2). Neerkaal ja mineraalide kontsentratsioon.Neermärg- ja kuivkaal suurenes märkimisväärselt kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga (Tabel 3). NeerCa ja P kontsentratsioonid tõusid samuti märkimisväärselt kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga.

Neerude Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressioon.

Bmp2 mRNA tase kõrge P rühmas oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt tõusnud (Joonis fig.1A). Spp1 mRNA ekspressioon suurenes oluliselt ka kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga (Joonis fig. 1B).

Arutelu

Üks kõrge P-sisaldusega dieedi füsioloogilisi mõjusid on nefrokaltsinoosi teke. Käesolevas uuringus suurenesid neerude Ca ja P kontsentratsioonid kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga, mis on kooskõlas eelmiste uuringute tulemustega1-6）. Varasemad uuringud teatasid, et nefrokaltsinoosi histoloogilised skoorid olid positiivses korrelatsioonis neerude Ca ja P kontsentratsioonidega4, 21）. Seega, kuigi käesolevas uuringus ei tehtud neerude histoloogilist vaatlust, näitavad neerude suurenenud Ca ja P kontsentratsioonid, et kõrge P-sisaldusega dieet kutsus esile nefrokaltsinoosi.

Kuna kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud Ca ladestumist peetakse üldiselt hüdroksüapatiidi6, 7) vormiks, oletasime, et nefrokaltsinoosi teket kontrollib osteogeneesiga sarnane mehhanism. Seega uurisime kõrge P-sisaldusega dieedi mõju Bmp2 mRNA ekspressioonile neerudes. Tulemused

näitas, et neeru Bmp2 mRNA ekspressioon suurenes kõrge P-rühmas ja kõrge P-sisaldusega dieet kutsub esile Bmp2 mRNA ekspressiooni ülesreguleerimise neerudes. See leid võib aidata arvesse võtta kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi arengu mehhanismi. Kuigi meie hüpoteesi toetavad lõplikud tõendid puuduvad, on üks võimalus, et osteogeensete transkriptsioonifaktorite ekspressioon on neerude kaltsineeritud piirkondades kõrgem. BMP2 indutseerib osteoblastide diferentseerumist ja luu moodustumist, reguleerides osteogeenseid transkriptsioonifaktoreid nagu Osterix, Runx2 ja Msx28, 9）; seega võib BMP2 soodustada nefrokaltsinoosi selliste osteogeensete transkriptsioonifaktorite reguleerimise kaudu. Praegu jääb BMP2 üksikasjalik roll nefrokaltsinoosi tekkes ebaselgeks. Lisaks, kuna selles uuringus mõõdeti ainult Bmp2 mRNA ekspressiooni, ei ole teada, kas BMP2 valgu ekspressioonis on erinevusi. Kuid meie tulemused viitavad võimalikule mehhanismile, mille abil BMP2 ekspressiooni muutused mängivad tugevat rolli kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi patogeneesis.

Käesolev uuring keskendus lisaks Bmp2 mRNA ekspressioonile ka Spp1 mRNA ekspressioonile. Meie eelmine uuring, milles kasutati immunohistokeemilist analüüsi, näitas OPN-i ekspressiooni kõrget taset kõrge P-sisaldusega dieediga toidetud rottide neerutuubulites12). Käesolevas uuringus leiti, et Spp1 mRNA ekspressioon suurenes kõrge P rühmas ligikaudu 10- korda. Käesolevate ja varasemate uuringute tulemused näitavad, et kõrge P-sisaldusega dieet kutsub esile OPN-i ekspressiooni neerudes. Teisest küljest on teised uurijad näidanud, et OPN kui kivimaatriks on oluline tegur uriinikivide moodustumisel22, 23）; seega viitas meie eelmine aruanne, et OPN-il võib olla maatriksikomponendi roll kõrge P-sisaldusega dieedi poolt indutseeritud Ca ladestumise moodustumisel . Kuid Paloian et al. teatas hiljuti, et OPN mängib rolli kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi ennetamisel OPN KO hiirtel24) . Nimelt näib OPN-i füsioloogiline roll kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi puhul olevat pigem kaltsifikatsiooni pärssimine kui soodustamine veres.neerud. Lisaks kirjeldatakse varasemates aruannetes, et OPN-i tase tõuseb, et kompenseerida edasist patoloogilist emakavälist lupjumistneerudja veresoonkond, kuna OPN on patoloogilise lupjumise kohas ülesreguleeritud.

Nagu eespool mainitud, viitas käesolev uuring BMP2 ja OPN tähtsusele kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosis. Tähelepanuväärne on see, et arvatakse, et BMP2 ja OPN mõju nefrokaltsinoosi tekkele on reguleeritud erinevate mehhanismidega. Need mehaanilised erinevused võivad viidata sellele, et nefrokaltsinoosi aluseks olev mehhanism on keeruline. Järgmine punkt, mida tuleb arvestada, on see, et kasvu pärssimine võis mõjutada Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressioonineerudsest käesolevas uuringus täheldati lõpliku kehakaalu vähenemist kõrge P-rühmas. Meie eelmiste 12) ja praeguste uuringute tähelepanekud võivad seda punkti aidata. Varem teatasime OPN-i valgu ekspressiooni suurenemisest rottide neerutuubulites, kelle kasvukoht

seda ei inhibeerinud kõrge P-sisaldusega dieet12). Lisaks näitas käesolev uuring kasvu pärssimist kõrge P-rühmas, kuid Spp1 mRNA ekspressiooni kõrget taset neerudes. Nende tähelepanekute põhjal näib, et käesoleval uuringul on Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressiooni kasvu pärssimisel väike mõju. Kasvu pärssimise ning Bmp2 ja Spp1 geeniekspressiooni vahelise seose üksikasjad jäävad siiski ebaselgeks. Seetõttu on selle punkti selgitamiseks vaja täiendavaid uuringuid.

Kokkuvõtteks, et selgitada kõrge P-sisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi tekkemehhanismi, määrati käesolevas uuringus kõrge P-sisaldusega dieedi mõju Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressioonile.neerud. Neerude Ca ja P kontsentratsioonid suurenesid märkimisväärselt kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga. Lisaks suurenes Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressioon kõrge P rühmas võrreldes kontrollrühmaga. Need tulemused näitavad, et kõrge P-sisaldusega dieet soodustab Bmp2 ja Spp1 mRNA ekspressiooni ülesreguleerimistneerud.

Viited

1) Hitchman AJ, kellel on SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: fosfaadist põhjustatud neerude lupjumine rottidel. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2) Parker HE: magneesiumi ja fosfori suhted piisava fosforisisalduse korral toidus. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3) Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosforist põhjustatud nefrokaltsinoos ja neerufunktsioon emastel rottidel. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4) Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: kaltsiumi ja fosfori kontsentratsioonid ja suhe toidus mõjutavad nefrokaltsinoosi teket emastel rottidel. J Nutr 132: 252-256, 2002

5) Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Toidu kaltsiumilisandi mõju luude ainevahetusele, neerude mineraalainete kontsentratsioonile ja neerufunktsioonile rottidel, keda toidetakse kõrge fosforisisaldusega dieediga. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: kõrge fosforisisaldusega dieet põhjustab rottidel kiiresti nefrokaltsinoosi ja proksimaalse torukujulise vigastuse. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Traditsioonilise hiina meditsiini (Wulingsan) tõhusus kõrge fosforisisaldusega dieedist põhjustatud nefrokaltsinoosi arengu pärssimisel noortel rottidel. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: sihipärane häirimine hiirerakkudes näitab Smad4 muutuvat nõuet kasvufaktoriga seotud signaalide muutmisel. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 reguleerib Osterixi läbi Msx2 ja Runx2 osteoblastide diferentseerumise ajal. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10) Uristi MR: Luu: moodustumine autoinduktsiooni teel. Science 150: 893-899, 1965

11) Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Luu moodustumise uudsed regulaatorid: molekulaarsed kloonid ja tegevused. Science 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: kõrge fosforisisaldusega dieet kutsub rottidel esile neerutuubulite osteopontiini ekspressiooni. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: soost määratud neerude lupjumine rottidel. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Soolised erinevused mineraalide kontsentratsioonis neerudes ja albumiini eritumisel uriiniga kõrge fosforisisaldusega sööta saanud rottidel. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15) Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 puhastatud dieedid laboratoorsetele närilistele: Ameerika Toitumisinstituudi ad hoc kirjutamiskomisjoni lõpparuanne AIN ümberformuleerimise kohta-76Näriliste dieet . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16）Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: kaltsiumi ja magneesiumi määramine seerumis, uriinis, dieedis ja väljaheites aatomabsorptsioonspektrofotomeetria abil. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: fosfori kolorimeetrilise määramise modifikatsioon kasutamiseks fotoelektrilise kolorimeetriga. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: prenüülrühm aitab kaasa fütoöstrogeeni 8-prenynaringeniini aktiivsusele luu moodustumise suurendamisel ja luu resorptsiooni inhibeerimine in vitro. Endokrinoloogia 154: 1202-1214, 2013

19) Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: vedelikuvool stimuleerib osteopontiini ja luu sialoproteiini ekspressiooni luuüdi stroomarakkude poolt ajaliselt sõltuval viisil. Bone 36: 1047-1055, 2005

20) Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Roti onkostatiin M retseptori kompleksi iseloomustus, mis sarnaneb inimese omaga, kuid erineb hiire tsütokiini retseptorist. PLoS One 7: e43155, 2012

21) Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: kaltsiumi ja fosfori suhte mõju mineraalide eritumisele ja nefrokaltsinoosile emastel rottidel. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Osteopontiiniga identset uriinikivi valku kodeeriva cDNA molekulaarne kloonimine ja sekveneerimine. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23) Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Kusekivi valku (Osteopontin) kodeeriva mRNA struktuur ja ekspressioon. J Biol Chem. 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontiin kaitseb kõrge fosfaadisisaldusega indutseeritud nefrokaltsinoosi ja veresoonte lupjumise vastu. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25） Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontiin on roti arterites neointima moodustumise ajal kõrgenenud ja on inimese aterosklerootiliste naastude uus komponent. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993