Herba Cistanche ekstrakt parandab mitokondriaalse glutatiooni staatust ja hingamist roti südametes koos võimaliku valkude lahtiühendamise esilekutsumisega

Sissejuhatus

Varem isheemilise müokardi reperfusioon põhjustab mitmeid mitokondriaalseid muutusi, sealhulgas suurenenud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmine, Ca2+ülekoormus ja adenosiintrifosfaadi (ATP) tootmise vähenemine, mis kõik võivad põhjustada nekroosi ja/või apoptoosi poolt vahendatud rakusurma (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Kuna mitokondrid mängivad määramisel otsustavat rolliKardiomüotsüütide saatuse tõttu pärast isheemia/reperfusiooni (I/R) väljakutset peaks kaitse müokardi I/R vigastuse eest olema suunatud mitokondriaalse struktuurse ja funktsionaalse terviklikkuse säilitamisele. Mitokondriaalse energia metabolismi säilitamine pärast I / R väljakutset on eriti oluline, kuna südame kontraktiilne funktsioon sõltub peaaegu täielikult mitokondrite tekitatud ATP-st. Kardiomüotsüüdid, mis on elus, kuid ei tõmbu kokku, on väga vähe kasulikud.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, kogu kuivatatud taimCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) on parasiitaim, mis kasvab peamiselt Põhja- ja Kirde-Hiina kõrbealadel. Herba Cistanche, mis on hiina meditsiinis klassifitseeritud "Yangi turgutavaks" ravimtaimeks, on ette nähtud neerupuudulikkuse, naiste steriilsuse ja soolestiku kuivusest tingitud kõhukinnisuse korral seniilsetel patsientidel (Chen, 1998). Varasemad uuringud meie laboris on näidanud, et metanoolHerba Cistanche ekstraktsuurendab müokardi ATP genereerimisvõimet (Leung & Ko, 2008) ja kaitseb müokardi I/R vigastuste eest rottidel (Leung, 2006). Kui ATP genereerimisvõime stimuleerimine oli paralleelne mitokondriaalse elektronide transpordi suurenemisega (Leung & Ko, 2008), siis Herba Cistanche raviga saadud südamekaitse I/R vigastuste vastu seostati müokardi ATP ammendumise vähenemisega (Leung, 2006). Käesolevas uuringus, et määratleda mitokondrite rolli Herba Cistanche kardioprotektiivses toimes, uurisime Herba Cistanche'i ravi mõju mitokondriaalse glutatiooni seisundile, Ca2+ sisaldusele, membraanipotentsiaalile ja hingamissagedusele roti südametes. .

materjalid ja meetodid

Taimne materjal

Herba Cistanche osteti kohalikult (Hongkongis asuv) ravimtaimede edasimüüjalt (Lee Hoong Kee). Tarnija kinnitas ürdi autentsuse ja kviitungi näidis (HKUST00301) deponeeriti Hongkongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli (HKUST) biokeemia osakonda. Varasemate uuringute põhjal viidi läbi ürdi ekstraheerimine metanooliga, mis näitasid, et selline ekstrakt suurendas mitokondriaalset ATP teket ja kaitses roti südametes I/R vigastuste eest (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Lühidalt, Herba Cistanche (400 g) lõigati väikesteks tükkideks ja ekstraheeriti, kuumutades püstjahuti all 300 ml metanoolis 60 kraadi juures 2 tundi, nagu eelnevalt kirjeldatud (Leung & Ko, 2008). Protseduuri korrati kaks korda. Ühendatud ekstrakt kuivatati, aurustades lahusti alandatud rõhul; saagis oli 42% (w/w) toorürdi kogusest. Ekstrakti hoiti kuni kasutamiseni 4 kraadi juures. Kuigi Hiina ürte ekstraheeritakse traditsiooniliselt suukaudseks tarbimiseks veega, kasutati meie varasemas uuringus proovide töötlemise ja säilitamise mugavuse huvides metanooli (Yim & Ko, 2002) ning leidsime, et metanooli ekstraheerimine on igas mõttes rahuldav.

Loomade hooldus ja uimastiravi

Täiskasvanud emased Sprague-Dawley rotid (8–10 nädala vanused; 200–230 g) peeti kontrollitud niiskusega ruumis 12-tunnise pimeduse/valguse tsükliga ligikaudu 22 kraadi juures ning neile lubati süüa ja vett ad libitum. Loomad jaotati juhuslikult erinevatesse rühmadesse, igas rühmas oli viis looma. Rotid said kätteHerba Cistanche ekstraktintragastraalselt ({0}},2 g/ml vees) annuses 0,5 g/kg või 1,0 g/kg 3 järjestikuse päeva jooksul. Kontrollloomad (ravimata) said ainult vett. Kakskümmend neli tundi pärast viimast annustamist saadi anesteseeritud loomadelt biokeemiliseks analüüsiks südamevatsakeste kude. Kõik katseprotokollid kiitis heaks uurimispraktika komitee HKUST.

Mitokondriaalsete fraktsioonide valmistamine

Südamevatsakeste peenestatud kuded (~{0}},6 g) homogeniseeriti 10--kordses (w/v) liias jääkülmas sahharoosipuhvris [0,32 M sahharoosi, 1 mM etüleendiamiintetraäädikhapet (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4], kasutades teflon-klaasist homogenisaatorit, kiirusel 4000 p/min, 25–30 tõmbega. Mitokondriaalsed pelletid valmistati koehomogenaatidest tsentrifuugimisega 800 × g juures 4 kraadi juures 30 minutit ja puhtus määrati suktsinaatdehüdrogenaasi ja laktaatdehüdrogenaasi suhtelise spetsiifilise aktiivsuse mõõtmisega vastavalt supernatandis ja pelletis, nagu eelnevalt kirjeldatud (Evans, 1992). Mitokondriaalsed pelletid suspendeeriti 1 ml homogeniseerivas puhvris.

Mitokondriaalse redutseeritud glutatiooni ja oksüdeeritud glutatiooni taseme mõõtmine

Mitokondriaalne redutseeritud glutatiooni (GSH) tase määrati ensümaatiliselt, kasutades 5,59-ditiobis(2- nitrobensoehapet) (DTNB) ja glutatioonreduktaasi (GR), järgides Griffithi (198{{17}) modifitseeritud protokolli. }). Alikvoot (210 µL) mitokondriaalsest fraktsioonist segati 90 µL 10% (maht/maht) 5-sulfosalitsüülhappega (SSA) ja segu tsentrifuugiti 600 x g juures 10 minutit. Oksüdeeritud glutatiooni (GSSG) taseme mõõtmiseks segati 100 µl SSA supernatante 10 µL 20% (mass/maht) 2-vinüülpüridiini ja 10 µL 60% (maht/maht) trietanoolamiiniga mikrofuugitorudes. Igal katseklaasil lasti seista toatemperatuuril vähemalt 1 tund. Reaktsioonisegu, mis sisaldas 0,63 mM DTNB-d ja 0,053 mM NADPH-d (redutseeritud nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat) fosfaatpuhvris (0,1 M, koos 5 mM Na2EDTA-ga; pH 7,5), eelinkubeeriti 30 kraadi juures 2 minutit. Alikvoot (30 µL) kas SSA proovi supernatanti (kogu glutatioon) või GSSG proovi lisati 96-süvendiga mikrotiiterplaadi süvendisse ja 180 µL eelsoojendatud reaktsioonisegu, mis sisaldas 0,525 U/. Järgmisena lisati ml GR. Neeldumise muutusi 412 nm juures jälgiti spektrofotomeetriliselt 5 minutit. GSH ja GSSG kontsentratsioonid hinnati kalibreerimiskõverate põhjal, kasutades standarditena GSH-d ja GSSG-d [lahustatud 3% (mass/maht) SSA-s] ja väljendatud ühikuna nmol/mg valku. GSH taseme hindamiseks lahutati kogu GSH-st kaks korda suurem GSSG kogus.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriaalse Ca{0}} sisalduse mõõtmine

Mitokondriaalset Ca{{0}} sisaldust mõõdeti Ca2+-tundliku fluorestsentssondi, Fluo-5N AM estriga (Molecular Probes, Eugene, OR), kasutades Victor2 Multi-Label Counter. (mudel 1420; PerkinElmer, Turu, Soome), nagu on kirjeldanud Menze et al. (2005). Ca2+ dissotsiatsioonikonstandid (Kd väärtused) määrati Ca2+ kalibreerimiskomplekti abil, mis kehtis kontsentratsioonivahemikus 1–1000 µM; hinnangulised Kd väärtused olid 90–100 µM ning vastavalt komplekti tootja andmetele olid need väga usaldusväärsed. Mitokondriaalse fraktsiooni alikvoot (25 µL) (lõppkontsentratsioon 0,5 mg valku/ml) segati 25 µL inkubatsioonipuhvriga {100 mM KCl ja 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propaansulfoonhape]; pH 7,2} 96-süvendiga mustas mikrotiiterplaadis. Segu inkubeeriti 25 kraadi juures 15 minutit; Seejärel lisati 25 µL digitoniini (50 µg/mL) ja 25 µL Fluo-5N AM estrit (1 µM 0,005% (mass/maht) Pluronic F-127-s). Membraani läbitungimist hõlbustades vahendas digitoniin fluorestsentsvärvi mitokondriaalset sisenemist. Leidsime, et Fluo-5N tase roti südame mitokondriaalsetes preparaatides tõusis digitoniini juuresolekul 20-korda. Reaktsioonisegusid inkubeeriti 25 kraadi juures 30 minutit ja fluorestsentsnäidud mõõdeti ergastuslainepikkusel 488nm ja emissioonilainepikkusel 532nm. Mitokondriaalset Ca2+ sisaldust hinnati kalibreerimiskõvera abil ja väljendati kui µmol/mg valku.

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõtmine

Membraani potentsiaali (ΔΨm) hinnati Bonavita et al. (2003), kasutades fluorestsentsvärvi, lipofiilset katioonset sondi 5596, 69- tetrakloro-1, 193, 39-tetraetüülbensimidasolüülkarbotsüaniinjodiid, mida tavaliselt nimetatakse JC-1. Mitokondriaalsete fraktsioonide alikvoote (50 µL) (reguleeritud 1 mg valku/ml) inkubeeriti 37 kraadi juures 50 µL substraadilahusega (sisaldab 6 mM püruvaati ja 6 mM malaati), 25 µl eeltöödeldud adenosiindifosfaadi lahusega (30 (ADP) ja 25 µL 3 µM JC-1, pimedas. ΔΨm väärtused saadi fluorestsentsi mõõtmisel lainepikkusel 535 nm (FL1) versus 580 nm (FL2), kasutades Victor2 MultiLabel loendurit. JC-1 moodustab mitokondrites agregaate, mille tulemuseks on kõrged FL2 fluorestsentsi väärtused ja mis näitab normaalset mitokondriaalset potentsiaali. ΔΨm kadumine viib FL2 fluorestsentsi vähenemiseni (JC-1 agregeerub vähemal määral) ja samaaegselt FL1 fluorestsentsi suurenemiseni (JC-1 monomeeridest). Andmed väljendati FL1/FL2 fluorestsentsi väärtuste suhetena. Katse kinnitamiseks kasutati karbonüültsüaniidi m-klorofenüülhüdrasooni (CCCP), ΔΨm-kollapseerivat ainet.

Mitokondriaalse hingamise mõõtmine

Mitokondriaalse hingamise kiirust mõõdeti 37 kraadi juures, kasutades Hansatech Oxygraph-Plus instrumenti, mis oli varustatud Clarki tüüpi hapnikuelektroodiga (Sarasota, FL, USA). Mitokondriaalsed fraktsioonid (0,6 mg valku/ml) suspendeeriti hingamispuhvris, mis sisaldas 125 mM KCl, 20 mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM etüleenglükooltetraäädikhapet (EGTA) ja 2 mM KH2PO4; pH 7,2. Pärast 2-minutilist inkubeerimist 37 kraadi juures sai iga proov 50 µL substraadilahust (5 mM püruvaati ja 5 mM malaati). Hingamissagedust mõõdeti 1 mM ADP juuresolekul (olek 3) ja pärast kogu ADP fosforüülimist ATP-ks (olek 4). Seisundi 3:seisundi 4 hingamissageduste suhe on hingamiskontrolli indeks, mis näitab hingamise ja fosforüülimise vahelise seose tihedust (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Enne substraadilahuse lisamist mõõdeti oleku 1 hingamissagedust kuni oleku 2 hingamise alguseni ja oleku 2 hingamissagedust hinnati enne ADP lisamist.

Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil mitme rühma võrdlemiseks. Oluliste erinevuste tuvastamiseks kahe rühma vahel kasutati vähima olulise erinevuse (LSD) väärtusi, kui p väärtused olid < 0,05.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tulemused

Nagu on näidatud joonistel 1 ja 2, töötlemine metanooligaHerba Cistanche ekstrakt({0}},5 või 1,0 g/kg/päevas × 3) suurendas oluliselt mitokondriaalset glutatiooni taset roti südametes, mida tõendab annusest sõltuv GSH taseme tõus (11–30%) ja GSSG tase (31%).

Herba Cistanche ravi vähendas annusest sõltuvalt mitokondriaalset Ca2+ taset roti südametes võrreldes kontrollidega; supressioon oli 41% annuses 1.0 g/kg (joonis 3).

Herba Cistanche ravi suurendas mitokondriaalset ΔΨm, mida tõendab FL1 / FL2 suhte vähenemine (14–16%). CCCP (100 µM) põhjustas ΔΨm kollapsi, mida näitab FL1/FL2 suhte suurenemine (joonis 4).

Herba Cistanche ravitõhustatud mitokondriaalne hingamine, mida tõendab oluliselt kõrgem oleku 3 hingamismäär (84%) katseloomadel võrreldes kontrollidega (tabel 1). Seisundi 2 ja oleku 4 hingamistasemed tõusid vastavalt 47 ja 80%, kuid oleku 4 hingamise stimulatsiooni pärssis täielikult 1 mM guanosiin-5'-difosfaat, 2/3 lahtiühendava valgu inhibiitor. Ravi Herba Cistanche'iga ei mõjutanud hingamiskontrolli indeksit, mis on hinnatud oleku 3/seisundi 4 hingamissageduste suhte järgi.

Arutelu

Herba Cistanche'iga töödeldud roti südametest eraldatud mitokondrid näitasid paranenud glutatiooni staatust, mida näitasid suurenenud GSH tasemed ja vähenenud GSSG tasemed. Mitokondriaalse glutatiooni redoksstaatuse säilitamine on südame-veresoonkonna kaitse jaoks ülioluline I/R vigastuste vastu (Chiu & Ko, 2003). Tsütosoolse Ca2+ sisaldus suureneb müokardi isheemia ajal sisemise membraani Ca2+ uniporteri poolt (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), mis viib mitokondriaalse Ca{{6} tekkeni. } kogunemine. Meie tulemused näitavad, et ravi Herba Cistanche ekstraktiga parandas mitokondriaalset glutatiooni redoksseisundit ja vähendas mitokondriaalset Ca2+ taset, mis võib pakkuda kaitset müokardi I/R vigastuse eest (Leung, 2006). Herba Cistanche'i suutmatus suuremas annuses 1,0 g/kg GSSG ja Ca2+ taset veelgi vähendada võib olla seotud glutatiooni redokspotentsiaali ja kaltsiumi seisundit mõjutava isepiirava regulatsioonimehhanismiga. mitokondrites.

Mitokondrid tekitavad elektronide transpordi teel elektrokeemilise prootoni gradiendi läbi sisemembraani. Seda gradienti kasutab ATP süntaas ADP fosforüülimiseks ATP-ks. Mitokondriaalse membraani potentsiaali vähenemine, nagu hüpoksia / reoksüdatsiooni korral pärast kultiveeritud kardiomüotsüütide vigastust (Chiu et al., 2008), vähendab ATP teket. Herba Cistanche ravi, mis võib suurendada müokardi mitokondriaalse membraani potentsiaali, võib suurendada ATP teket, eriti post-isheemilise reperfusiooni ajal. Jällegi võib isemajanduva regulatiivse mehhanismi olemasolu selgitada, miks Herba Cistanche ravi mõju mitokondriaalse membraani potentsiaalile ei sõltu annusest.

Ravi Herba Cistanche'iga suurendas oluliselt hapnikutarbimise põhjal hinnatuna seisundi 3 hingamissagedust roti südame mitokondrites. See leid on kooskõlas tulemustega, mis on saadud mitokondriaalse ATP tekkevõime in vitro ja situ mõõtmistel (Leung & Ko, 2008). Huvitav on see, et kuigi Herba Cistanche ravi vähendas müokardi ATP püsiseisundi taset (andmeid pole näidatud), suurendas ravi mitokondriaalset ATP teket. Lahtise hingamise kaasamine võib neid vastuolulisi tähelepanekuid selgitada. Lahtiühendatud oksüdatiivne fosforüülimine toimub siis, kui prootonid liiguvad läbi mitokondriaalse sisemembraani tagasi mitokondriaalsesse maatriksisse, hajutades seega elektronide transpordiahela poolt moodustatud membraanipotentsiaali. Selle tulemuseks on ATP moodustumist juhtiva prootoni liikumapaneva jõu vähenemine (Garvey, 2003). Selle tulemusena väheneb Ca2+ kontsentratsioon ja ROS tootmine mitokondrites dramaatiliselt (Teshima et al., 2003). See soovitus on kooskõlas käesoleva uuringu tulemustega, mis näitasid mitokondriaalse Ca2+ taseme langust Herba Cistanchega töödeldud südametes. Mis puutub lahtihingamisse, siis Herba Cistanche'i ravi võib indutseerida lahtiühendavate valkude (UCP) sünteesi. On teada, et UCP-d lahutavad oksüdatiivse fosforüülimise ja UCP1 ekspressioon transgeensete hiirte südametes on kaitstud I / R-indutseeritud müokardi kahjustuste eest (Hoerter et al., 2004). UCP-de lahtisidumist inhibeerisid puriinnukleotiiddifosfaadid ja trifosfaadid (nagu ADP, ATP, guanosiindifosfaat (GDP) ja GTP) (Echtay et al., 2002). Käesolevas uuringus mõõdeti ADP (substraadina) juuresolekul mitokondriaalseid parameetreid, nagu membraanipotentsiaal ja hingamissagedus; UCP-de lahtisidumise efekt oli seetõttu pärsitud. Kui aga mõõdeti mitokondriaalse seisundi 4 hingamissagedust ADP puudumisel, oli see määr kõrgem Herba Cistanchega töödeldud südametest valmistatud mitokondrites kui töötlemata kontrollide südametes. State 4 hingamissagedus peegeldab mitokondrite hapnikutarbimist, kui prootonid lekivad tagasi mitokondriaalsesse maatriksisse mehhanismi kaudu, mis ei hõlma F1 F0 -ATPaasi (Garvey, 2003). UCP-de võimalikku osalust Herba Cistanche põhjustatud seisundi 4 hingamise suurenemises toetab järeldus, et SKT pärsib seda võimendust (Bento et al., 2007).

Kokkuvõtteks võib öelda, et ravi Herba Cistanche'ga võib parandada mitokondriaalset glutatiooni seisundit, vähendada mitokondriaalset Ca{0}} taset ning suurendada mitokondriaalse membraani potentsiaali ja hingamissagedust roti südametes. Mitokondriaalse glutatiooni staatuse ja funktsionaalse võime paranemine ning UCP-de oletatav esilekutsumine võib olla seotud südamekaitsega, mida pakubHerba Cistanche ravipärast I/R vigastust.

LOODUSLIK KISTANŠE TUBULOSA TAIM KISTANŠEKSTRAKT PHGS75% ECH 30% ACT 12%