GRP78 üleekspressioon käivitab PINK1-IP3R-vahendatud neuroprotektiivne mitofagia, 2. osa

2.5. Western Blot

Anesteseerisime rotid Dolethaliga (n=4) 7 dpi juures, et saada Western blot analüüsi jaoks L4–L5 seljaaju segmendid (pikkusega 5- mm). Külmutasime proovid vedelas lämmastikus.

Viimastel aastatel on üha enam uurimistulemusi näidanud, et valgublotanalüüsi ja mälu vahel on tihe seos. Protein blot on analüütiline meetod valgu ekspressiooni tuvastamiseks, mida on laialdaselt kasutatud neuroteaduste uuringutes.

Neuronite vaheline seos on tihedalt seotud mälu salvestamisega. Valkude blotanalüüs võib tuvastada neuronite vahelise seose ja pre- ja postsünaptiliste valkude ekspressiooni, paljastades veelgi valkude olulist rolli mälu moodustamisel ja säilitamisel.

Uuringud on leidnud, et presünaptiliste neuronaalsete valkude ekspressioon on tihedalt seotud mälu kujunemise ja säilitamisega. Näiteks õppimis- ja mäluprotsessi käigus muudavad neuronid presünaptiliste valkude ekspressiooni ning see muutus on seotud uute mälestuste tekke ja talletamisega. Lisaks on mõned uuringud leidnud, et muutused mõnede valkude ekspressioonis on seotud neurodegeneratiivsete haigustega nagu Alzheimeri tõbi.

Seetõttu võib valgublotanalüüs anda põhjaliku ülevaate neuronite vahelisest ühenduse staatusest ja seotud valkude ekspressiooni muutustest, paljastades neuronite molekulaarse mehhanismi. Sellel on suur tähtsus mälu kujunemise mehhanismi ja neurodegeneratiivsete haiguste uurimisel.

Lühidalt öeldes näitab seos valgublotimise ja mälu vahel valkude rolli neuronite ja mälusalvestuse vahelises seoses. See annab uusi ideid ja suundi mälu kujunemise mehhanismi ja neurodegeneratiivsete haiguste uurimiseks. Edendagem aktiivselt neuroteaduslikke uuringuid ning panustagem tervisesse ja pikaealisusesse! On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, kuna sellel on antioksüdantne, põletikuvastane ja vananemisvastane toime, mis võib aidata vähendada oksüdatiivseid ja põletikulisi reaktsioone ajus, kaitstes seeläbi närvisüsteemi tervist. süsteem. Lisaks võib Cistanche soodustada ka närvirakkude kasvu ja paranemist, parandades seeläbi närvivõrkude ühenduvust ja funktsiooni. Need mõjud võivad aidata parandada mälu, õppimisvõimet ja mõtlemiskiirust ning võivad samuti ära hoida kognitiivse düsfunktsiooni ja neurodegeneratiivsete haiguste teket.

Klõpsake teada, kuidas ajufunktsiooni parandada

Proove säilitati või töödeldi edasi homogeniseerimisega lüüsipuhvris (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM sahharoosi, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA ning proteaasi (Sigma-Aldrich) ja fosfataasi inhibiitorite (Roche, Basel, Swit) kokteil ) Potteri homogenisaatoriga jääl.

Pärast lüsaatide tsentrifuugimist 800 × g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C kogusime supernatandi tuumajärgse fraktsioonina ja kvantifitseerisime valgud BCAassay abil (Pierce Chemical Co.).

Western blot analüüsi jaoks laadisime igalt loomalt 30 µg L4–L5 segmentide tuumajärgseid fraktsioone 12% SDS-polüakrüülamiidgeelidele, et teostada valkude elektroforeetiline eraldamine, millele järgnes ülekandmine PVDF membraanile BioRadcuvette süsteemis 25 mM. Tris, pH 8,4, 192 mM glütsiin, 20% (maht/maht) metanool.

Blokeerisime membraanid 5% BSA-ga PBS-s pluss 0,1% Tween-20 1 tund toatemperatuuril ja inkubeerisime seejärel öö läbi temperatuuril 4 ◦C primaarse antikehaga: hiire anti- -aktiiniga ( 1:10000, SigmaAldrich, hiire anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), hiire anti-CV (1:1000, Invitrogen), küüliku anti-HSP60 (1:500, antikehad võrgus), hiire anti-CV NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), hiire anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), küüliku anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, Ühendkuningriik), hiire anti-PINK1 (1:500, Abcam), küüliku anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), küüliku anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Pärast mitut pesemist inkubeeriti membraane 2 tundi sobiva sekundaarse antikehaga, mis oli konjugeeritud mädarõika peroksidaasiga (1:5{5}}00, vektor). Membraan visualiseeriti kemoluminestsentsseguga 1:1 (0,5 M luminool, 79,2 mM p-kumaarhape, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) ja (8,8 M vesinikperoksiid, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) ja pildid tehti Gene Genome aparaadiga ja analüüsiti tarkvaraga Gene Snap ja Gene Tools (Syngene).

2.6. In vitro mudel

NSC34 rakke kultiveeriti modifitseeritud Eagle'i keskmise kõrge glükoosisisaldusega keskkonnas (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (Sigma-Aldrich), 100 ühikut/ml penitsilliini ja 0,5x penitsilliini/streptomütsiini lahust. (Sigma-Aldrich) ja hoiti niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 atmosfääris, põhimõtteliselt nagu eelnevalt kirjeldatud [26].

Pärast 4-päevast rakukultuuri söödet muutmata oli NSC34 rakkudel diferentseeritud sarnane fenotüüp, mida iseloomustas pikkade neuriitide olemasolu. 4. päeval lisati rakkudele ravimid. Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) ja EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) lahused valmistati kontsentratsiooniga 10X ja lahustati DMEM-is.

24 tunni pärast hinnati rakkude elujõulisust, inkubeerides rakke 4 mg / ml MTT lahusega 3 tundi. Moodustunud sinised formatsaani kristallid lahustati DMSO-s ja neeldumist 570 nm juures mõõdeti mikroplaadilugejaga (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofektsioon

Transfekteerisime miljon rakku 2 µg plasmiidiga, et ekspresseerida GFP, GRP78, HAPARK, hiire sh-eGFP, hiire sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), hiire sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) ja /või hiire sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio), kasutades Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Šveits) ja Nucleofactor V komplekti (Lonza), järgides tootja soovitusi.

Staatiliseks tsütomeetriliseks analüüsiks külvasime rakud {{0}}süvendisse, mis oli kaetud 10% kollageeniga. Pärast kultiveerimist fikseerisime rakud 4% PFA-ga, loputasime kaks korda PBS-iga ja säilitasime või lisasime seejärel blokeeriva puhvri, mis sisaldas PBS 0,3% (v/v) Triton X-100 ja 10% veise loote seerumit. Pärast 3-päevast rakukultuuri lisati DMEM-is lahustatud ravimid.

Nende katsete jaoks kasutasime 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) või 10 µM BAPTA-AM (Sigma). -Aldrich). 5 tundi pärast töötlemist fikseerisime rakud immunotsütokeemia jaoks 4% PFA-ga või homogeniseerisime need modifitseeritud RIPA puhvris (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% naatriumdeoksükolaati, 0,1% SDS, proteaasi ja fosfataasi kokteilid) immunoblotimiseks. Immunohistokeemia viidi läbi, loputades proove kaks korda PBS-iga ja inkubeerides blokeeriva puhvriga, mis sisaldas PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 ja 10% veise loote seerumit.

Inkubeerisime järgmiste primaarsete antikehadega: küüliku anti-IP3R (1:200, Abcam), hiire anti-HA (1:2000, Abcam), hiire anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) ja küüliku anti-HSP60 (1:500, Antikehad võrgus). Et hinnata ülalkirjeldatud viisil elujõulisust MTT abil, jätsime ravi 24 tunniks.

2.8. Mitokondriaalse superoksiidi tootmise ja ∆ψM mõõtmine

Rakke inkubeeriti 2,5 uM MitoSOX-iga superoksiidi analüüsiks või 2,5 uMTMRM-iga ∆ψM analüüsi jaoks, nii Molecular Probes'ist kui ka Invitrogenist viimase 30-minutise ravi jooksul. Fluorestsents tuvastati IX81 Olympus mikroskoobiga ja kvantifitseeriti staatilise tsütomeetria tarkvara abil.

2.9. Hapnikutarbimise elektrokeemiline mõõtmine

Rakke (1 × 106 1 ml kohta HBSS-s) loksutati gaasikindlas kambris temperatuuril 37 ◦C. Mõõtmised tehti Clark-tüüpi O2 elektroodiga (Rank Brothers, Cambridge, UK) ja registreeriti Dup.18 andmetega. hankimisseade (WPI) kohe pärast 5-töötlemist sõiduki või Tunniga.

2.10. Mitokondriaalne ja tsütosoolne fraktsioneerimine

Rakud homogeniseeriti lüüsipuhvris (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM sahharoosi ning proteaaside (Sigma-Aldrich) ja fosfataasi inhibiitorite (Roche) kokteil) Potteri homogenisaatoriga jääl.

Pärast lüsaatide tsentrifuugimist kiirusel 2000 × g 5 minutit, tsentrifuugiti supernatanti kiirusel 10 000 × g 12 minutit. Supernatanti peeti lahustuvaks fraktsiooniks (S2) ja see sisaldab tsütosoolseid valke ja mikrosoome.

Pellet (P2) oli rikastatud mitokondriaalne fraktsioon, mis resuspendeeriti modifitseeritud RIPA puhvris (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8). }}, 0,5% naatriumdeoksükolaadi, 0,1% SDS-i, proteaasi ja fosfataasi kokteilid) ja valgu kontsentratsioon määrati BCA testiga. Seejärel töödeldi proove Western blot jaoks.

2.11. Transmissiooni elektronmikroskoopia

Sukeldasime seljaaju L{{0}}L5 segmendid (1-mm viilud) 2% (mass/maht) PFA ja 2,5% (maht/maht) glutaaraldehüüdi (EM-klass) fikseerivasse lahusesse. 0,1 M PBS-is, pH 7,4 ja asetati need 2 tunniks kiikplatvormile, seejärel fikseeriti 1% (mass/maht) PFA-s ja seejärel järelfikseeriti 1% (mass/maht) osmiumtetroksiidiga (TAAB Lab). ), mis sisaldab 0,08% (mass/maht) kaaliumheksatsüanoferraati (Sigma-Aldrich) PBS-is 2 tundi.

Tegime neli pesu deioniseeritud veega ja järjestikuse dehüdratsiooni atsetoonis. Kõik protseduurid viidi läbi 4 ◦C juures, nagu eelnevalt kirjeldatud [33]. Manustasime proovid EPON-vaiku ja polümeriseerisime temperatuuril 60 ◦C 48 tundi.

Proove töödeldi poolõhukeste lõikude (1 µm) saamiseks Leicaultracut UCT mikrotoomiga, värviti 1% (mass/maht) toluidiinsinise vesilahusega ja uuriti valgusmikroskoobiga, et tuvastada MN-idega rikastatud ventraalsed sarvepiirkonnad.

Üliõhukesed lõigud (70 nm) lõigati teemantnoaga, asetati kaetud võredele ja vastandati tavapärase uranüülatsetaadi ja Reynoldsi pliitsitraadi lahustega.

Lõpuks vaatlesime sektsioone ülekandeelektronmikroskoobiga (Jeol 1400), mis oli varustatud GatanUltrascan ES1000CCD kaameraga. Valisime iga tingimuse kohta kolm viilu, analüüsisime kolme MN-i sektsiooni kohta ja mõõtsime ImageJ tööriistade abil tuumade alasid võrreldes MN-i kogupindalaga.

2.12. Bioinformaatika ja statistika

Kasutasime dispersioonanalüüse (ANOVA), et võrrelda väärtusi erinevate katserühmade vahel andmete puhul, mis vastasid normaalsuse eeldusele. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey post hoc mitme vahemiku testi või Studenti t-testi. Kõik statistilised analüüsid tehti GraphPad Prism5 tarkvara abil (n=3–5; p < 0,05 olulisuse jaoks).

3. Tulemused

3.1. Tekst

3.1.1. GRP78 üleekspressiooni proteoomiline analüüs näitas, et peamise sihtmärgina on mitokondrid

GRP78 üleekspressiooni poolt vahendatud neuroprotektsioonini viivate molekulaarsete mehhanismide kindlakstegemiseks teostasime võrdleva märgisevaba proteoomilise analüüsi, et tuvastada nii kvantitatiivsed kui ka kvalitatiivsed erinevused RA-ga vigastatud loomade vahel, kes olid nakatunud adenoviirustega GRP78 (Ad-GRP78) üleekspressiooniks, mis varem oli neuroprotektiivne. MN-de või beeta-galaktosidaasi (Ad-ß-Gal) kontrollina [20].

Vastavalt meie laboris läbi viidud varasematele uuringutele [20, 25] oli analüüsi jaoks valitud ajahetk seitse päeva pärast vigastust (dpi). Varasemas võrdluses distaalse aksotoomia ja istmikunärvi õmbluse järgse regeneratsiooni mudeli ja meie degeneratiivse RA mudeli vahel täheldasime, et signaaliülekande sündmused olid sarnased kuni 7 dpi-ni, mil pärast RA ilmnesid erinevad pro-degeneratiivsed sündmused [20, 25].

L4-L5 seljaaju segmentide tuumajärgsete fraktsioonide märgisevaba LC-MS/MS analüüsi tulemusel tuvastati 1420 valku, vähemalt kaks peptiidi valgu kohta, nagu on varem teatatud teiste proovide ja uuringute kohta [25] .

Kokku muutus RA-ga vigastatud loomadel Ad-GRP78 või Ad-ß-Gal üleekspressiooni tõttu märkimisväärselt 566 ja 732 valku või peptiidi, võrreldes RA-ga vigastatud loomadega, kes ei olnud viirusega nakatunud (p < 0 .05) (tabelid S1 ja S2).

Võrdlesime mõlemat loendit ja leidsime, et 22{4}} olid Ad-GRP78 üleekspressiooni tõttu unikaalselt muudetud (tabel S3). Nende valkude funktsionaalne märkimine, kasutades annotatsiooni, visualiseerimise ja integreeritud avastamise andmebaasi (DAVID) tööriista, võimaldas meil tuvastada. kõige olulisemad bioloogilised funktsioonid andmekogumis (FDR < 0,05) [34,35].

GRP78 üleekspressioon põhjustas erinevusi mitokondriaalsetes protsessides, funktsioonides ja komponentides osalevate valkude tasemetes (tabel S4A–C, joonis S1A–C). Geeniontoloogia (GO) terminid ja nende andmete KEGG radade rikastamise analüüs näitasid, et Ad-GRP78-ga nakatunud loomadel vähenes märkimisväärselt paljude mitokondriaalsete funktsioonidega valkude tase, sealhulgas mitokondriaalse välise ja sisemise näo valgud, hingamiskompleksi valgud, ja maatriksvalgud.

Kinnitasime proteoomilises loendis ilmnenud valgutasemete erinevusi, nagu GRP75, mis oli ülesreguleeritud (p < 0.05) ja V kompleksi subühik (CV ), allareguleeritud (p=0.03) GRP78 rühmades ootuspäraselt (joonis 1A).

Kogu nimekirjas olid kõige tugevamini allareguleeritud 2-oksoglutaraat/malaadikandjavalk OGC (SCL25A11), MT-ND3 (kasvaja supressor, mis osaleb themalaat-aspartaadi süstikul ja regenereerib NADH kogumit mitokondriaalses maatriksis, et võimaldada kompleksi I funktsioon), kompleksi I NADH dehüdrogenaasi subühik 3, gammaaminovõihappe aminotransferaas ABAT ja kompleksi III ubikinool-tsütokroom C reduktaasi subühik. Seevastu reguleeriti väga vähe valke (joonis 1B).

Üks ülesreguleeritud valk oli ootuspäraselt GRP78 ja teised ülesreguleeritud valgud olid aminohapete transporter EAAT2, mis paikneb peamiselt plasmamembraanis ja mõnikord mitokondrites ergastavate sünapside juures, ning hüdroksüatsüül-CoA dehüdrogenaas HADHA, mis katalüüsib mitokondri beeta kolme viimast etappi. -pika ahelaga rasvhapete oksüdatsioon.

Laiendasime analüüsi, et uurida, kas mitokondrite ormitokondrite funktsiooniga seotud valkude teisi valke muudeti proteoomilisest loendist välja, et kinnitada funktsionaalset mitokondrite mõju (joonis 1C).

Täheldasime, et mitokondriaalne konserveerunud dünamiiniga seotud GTPaasi optiline atroofia 1 (OPA1), mis on seotud fusiooniga [36], oli allareguleeritud (p < 0.1); LONP1, ATP-sõltuv proteaas, mis vahendab valesti kokkuvolditud polüpeptiidide selektiivset lagunemist, kaldus suurenema, kuid erinevusi ei täheldatud ubikinooni NDUFA9, transkriptsioonifaktori NRF2, mis reguleerib geene, mis sisaldavad antioksüdantide vastuseelemente või muud dünamiini. infusiooniga seotud GTPaas, näiteks mitofusiin 2 (MFN2) [36].

Mitokondrites leitud muutuste põhjalik kokkuvõte on näidatud joonisel 1D oleval skeemil. Mitokondriaalne dünaamika on stressireaktsioonide jaoks oluline, kuna kahjustatud mitokondrid sulanduvad materjalivahetuseks ning mitokondriaalne lõhustumine võimaldab kahjustatud mitokondrite eraldamist ja sellele järgnevat mitofaagiat [37].

Arvestades, et suur hulk allareguleeritud valke lokaliseerub mitokondrites ja MFN2 ja L/S OPA1 vormide suhte analüüsimisel mitokondrite sulandumise aktiivsuse osas ilmseid muutusi ei täheldatud (joonis 1C), uurisime mitofagiaga seotud markereid.

Klassikaliselt toimub mitokondrite autofagiast sõltuv lagunemine pärast depolarisatsiooni ja selle käivitab tavaliselt fosfataasi ja tensinhomoloogi (PTEN) poolt indutseeritud oletatava kinaasi 1 (PINK1) täispikkuses akumuleerumine mitokondri välismembraanil.

Seejärel värvatakse tsüklisisene E3 ubikvitiini-valgu ligaas Parkin, et tähistada depolariseeritud mitokondrite mitokondriaalset välismembraani valku ubikvitüülimise teel [38–41]. Joonise 2A ülaosas pole Parkini taseme muutusi, kuid täispika PINK1 märkimisväärne vähenemine, mis on põhjustatud RA vigastusest ipsilateraalses L4-L5 seljaaju segmendis kontrollrühmaga 7 dpi juures. Seevastu GRP78 üleekspressioon vähendas Parkini, kuid kahekordistas PINK1 taset pärast RA-d võrreldes mitteseotud valgu -Gal kontrollekspressiooniga (joonis 2A, alumine).

Täispika PINK1 ülesreguleerimine on kooskõlas mitofagia esilekutsumisega [42] ja Parkini vähenemine võib olla seotud organellide lagunemise kaugelearenenud olekuga, mida on täheldanud ülejäänud mitokondrite valgud.

Lisaks uurime mitokondrite ja nende mikrotuubulitega seotud valkude 1A/1B kerge ahela 3 (LC3)-positiivsete puncta kooslokaliseerimist, mis on makroautofagia põhimasina põhikomponent ja mis on vajalik mitofagia protsessi jaoks [43].

Konfokaalset mikroskoopiat kasutades täheldasime anti-COX IV abil märgistatud mitokondrite kooslokaliseerumise olulist suurenemist LC3--positiivse punktiga pärast RA-d ainult kahjustatud MN-ides, mis ekspresseerisid GRP78 üle 7 dpi juures (joonis 2B).

Kinnitasime mitofagia olemasolu avuleeritud MN-ides ainult GRP78 üleekspresseerimisel proovide analüüsiga, kasutades ülekandeelektroonilist mikroskoopiat.

Me täheldasime Ad-GRP78 loomade MN-ides ohtralt neelatud mitokondritega vakuoole, mis on mitofagia tunnus [37] ja mis meenutavad mitofagosoome, ja mitut ERcisternae't, mis on tihedas seoses mitokondritega Ad-GRP78 loomade MN-ides, kuid me ei tuvastanud neid Ad- -Gal RA-ga vigastatud loomadel. rotiproovid 5 dpi juures (joonis 2C).

Joonis 1. GRP78 üleekspressioon RA-ga vigastatud loomadel on suunatud mitokondriaalsetele valkudele. (A) Immunoblot- ja tulpdiagrammid, mis näitavad GRP78, GRP75 ja CV valgu tasemete keskmisi voltimismuutusi (± SEM) L4-L5 seljaaju segmentides GRP78 vs.

-Gal üleekspresseerivad RA-vigastatud rotid 7 dpi võrra. Tasemed normaliseeriti aktiini väärtustele (n=4; * p < 0,05 vs. Ad- -Gal, Studenti t-test). (B) Mitokondriaalsete valgukordade muutuste histogramm, mis saadi L4-L5 seljaaju segmentide proteoomilise analüüsiga RA-ga vigastatud loomadelt, kes ekspresseerivad GRP78 üle, võrreldes Ad- -Gal rühmaga 7 dpi võrra. (C) Immunoblot- ja tulpdiagrammid, mis näitavad aktiiniks normaliseeritud NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 keskmisi voltimismuutusi (± SEM). (Rühmade vahel olulisi erinevusi pole. Studenti t-test). (D) Skemaatilised mitokondrid valkudega, mida on muutnud GRP78 üleekspressioon RA-ga vigastatud loomade L4-L5 seljaaju segmentides, mis on esile tõstetud kollase (vähenenud) või sinisega (suurenenud) 7 dpi juures.

Joonis 2. Mitofaagiat moduleeritakse in vivo pärast RA-d rottidel, kes üleekspresseerivad GRP78. (A) Immunoblotid ja vastavad tulpdiagrammid valgutasemete PINK1 ja PARK kordade muutuste analüüsi jaoks (keskmised ± SEM), mis on normaliseeritud aktiini tasemele, RA-vigastatute L4-L5 seljaaju segmentides vs.

juht (ülemine) või Ad{{0}}Gal ja Ad-GRP78 (all) 7 dpi võrra. (n=4; * p < 0,05,õpilase t-test). (B) Vasakul mikrofotod tüüpilistest MN-idest ipsilateraalses kohas RA-vigastatud loomadelt, kellele manustati intratekaalselt AAVrh10-GFP või AAVrh10-GRP78 rühma 7 dpi juures. Proovid värviti COX IV (punane) ja LC3 (roheline) jaoks ning värviti fluorestseeruva Nissl-ga (sinine).

Skaalariba=10 µm ja digitaalne suum 10X.

Pange tähele, et kaaslokaliseerimist täheldatakse ainult AAVrh10-GRP78 rühmas. Paremal, tulpdiagramm, mis näitab COX IV ja LC3 kaaslokalisatsioonipunktide % analüüsi. COX IV ja LC3 kaaslokaliseerimise keskmine ± SEM (n=4; ** p < 0.01,õpilase t-test). (C) tüüpilised transmissioonelektronmikroskoopia kujutised, kus mitokondrid eristuvad seljaaju MN-ides: a, MN tsütoplasma pilt, mis näitab mitokondrite kontrolli all olevat looma; b, MN tsütoplasma kujutis RA-ga vigastatud rotilt Ad- -gal rühmast; c, MN-i tsütoplasma pilt RA-ga vigastatud rotilt Ad-GRP78 rühmast, kus mõned mitokondrid on tähistatud punaste tärnidega; d, on näidatud (C) suurema suurendusega pilt, mis osutab suurtele mitokondrite ja ER kontaktile. Skaalaribad on näidatud joonistel.

Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et GRP78 üleekspressioon võib pärast RA-d indutseerida mitofagiiinist lahtiühendatud MN-e ja see võib soodustada neuroprotektsiooni.

3.1.2. GRP78 üleekspressioon taastab kahjustatud mitokondriaalse funktsiooni

Seejärel uurisime täiendavalt GRP78 üleekspressiooni mõju ER-stressi in vitro mudeli mitokondriaalsele kasutamisele, kuna see solvang ilmneb varakult pärast RA vigastust in vivoas, millest on varem teatatud [20, 26], ja see on usaldusväärne meetod uudsete neuroprotektiivsete ainete skriinimiseks [2, 44]. ].

Selles mudelis kasutatakse tunikamütsiini (Tun), mis on ER-stressi indutseerija, mis põhjustab N-atsetüülglükoosamiini-lipiidide vaheühendite moodustumist, takistades seeläbi äsja sünteesitud valkude glükosüülimist ja põhjustades valkude valesti voltimist. Me kasutasime seda seetõttu, et peatatud sekretoorne rada on samuti RA järgses eurodegeneratiivses protsessis võtmetähtsusega [26].

Esmalt kontrollisime, et NSC34 motoneuronilaadsete rakkude nukleofektsioon sobiva vektoriga põhjustas GRP78 tootmise (joonis 3A). Nendes rakkudes suurendas GRP78 ekspressioon märkimisväärselt Tun-i sisaldavat ellujäämiskeskkonda (joonis 3B).

Kuigi Tun-ravi indutseerib tavaliselt GRP78 ise, on see endogeenne üleekspressioon üsna hilja (24 tunni pärast) (joonis S2). Samuti mõtlesime, kas saaksime kindlaks teha, kas GRP78 üleekspressioonil on neuroprotektiivne toime mõnes teises in vitro mudelis, mille kohta me varem teatasime, et see reprodutseerib mitmeid MN-i surma tunnuseid pärast RA vigastust [26].

See mudel põhineb nokodasooli poolt indutseeritud tsütoskeleti kahjustusel, mis häirib mikrotuubulite polümerisatsiooni. GRP78 ekspressioon suurendas ka nokodasooli juuresolekul kultiveeritud rakkude elujõulisust (joonis 3B).

Seejärel hindasime mitokondriaalset funktsiooni, mõõtes reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teket mitokondrites, kasutades MitoSOX-i, mitokondriaalset membraanipotentsiaali (∆ψm), kasutades tetrametüülrodamiini metüülestrit (TMRM), ja O2 tarbimise määra meie NSC34 rakkudes, mis on allutatud ER stressile. GRP78 üleekspressiooniga või ilma.

Positiivse kontrollina kasutasime efavirensi (EFV), mitotoksilist ainet, mis muudab kõiki kolme parameetrit [45]. Täheldasime, et MitoSOX tasemed tõusid järk-järgult pärast Tun lisamist, saavutades statistilise olulisuse 24 tunni võrra ja et ROS-i teke suurenes EFV-ga töödeldud rakkudes märkimisväärselt esimesest ravijärgsest tunnist võrreldes kandjaga töödeldud kontrollidega (joonis S3A).

GRP78 üleekspressioon põhjustas 24 tundi pärast Tun- või EFV-ravi märkimisväärselt madalamat ROSin-mitokondrite taset võrreldes GFP-d ekspresseerivate rakkudega (joonis 3C). ∆ψm varises pärast 5 ja 24-tunnist Tun-ravi ning pärast 24-tunnist EFV-ravi (joonis S3B). Selle parameetri taastamine saavutati GRP78 üleekspressiooniga Tun- või EFV-ga töödeldud rakkudes (joonis 3D).

O2 tarbimise määr vähenes 80-minutise analüüsi jooksul pärast Tun lisamist rakkudes, mis ekspresseerivad GFP-d (kalle −0.063, R2=0.98), kuid O2 tarbimine vähenes. stabiilne GRP78-üleekspresseerivates rakkudes, hoolimata Tun olemasolust (kalle −0,221, R2=0,99) (joonis 3E, vasakul).

5 tunni pärast oli hingamine GRP78-üleekspresseerivate rakkude puhul normaalne ja GFP-d ekspresseerivates rakkudes tõsiselt kahjustatud (joonis 3E, paremal). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et GRP78 nõrgendab ER stressist või mitotoksilisusest põhjustatud mitokondrite düsfunktsiooni.

For more information:1950477648nn@gmail.com