FOXO reguleerib antimikroobsete peptiidide ekspressiooni ja soodustab hemotsüütide fagotsütoosi krevettide antibakteriaalses immuunsuses

Abstraktne

Selgrootud loodavad patogeense infektsiooni vastu seista kaasasündinud immuunsusele, sealhulgas humoraalsele ja rakulisele immuunsusele. Varasemad uuringud näitasid, et kahvlipea kasti transkriptsioonifaktor O (FOXO) osaleb imetajate limaskesta immuunvastustes ja selgrootute soolestiku humoraalses immuunregulatsioonis. Siiski pole teada, kas FOXO osaleb selgrootute süsteemse ja rakulise immuunsuse reguleerimises. Käesolevas uuringus tuvastasime krevettide (Marsupenaeus japonicus) FOXO ja leidsime, et see ekspresseeriti tavalistes krevettides suhteliselt algtasemel, kuid Vibrio anguillarum'i poolt nakatatud krevettide puhul oli see oluliselt ülesreguleeritud. FOXO mängis olulist rolli hemolümfi ja soolestiku mikrobiota homöostaasi säilitamisel, soodustades Relishi ekspressiooni, immuunpuudulikkuse (IMD) raja transkriptsioonifaktorit antimikroobsete peptiidide (AMP) ekspressiooniks krevettides. Samuti leidsime, et patogeeni infektsioon aktiveeris FOXO ja indutseeris selle tuuma translokatsiooni, vähendades seriini / treoniini kinaasi AKT aktiivsust. Tuumas reguleeris aktiveeritud FOXO otseselt oma sihtmärk-Amp ja Relishi geenide ekspressiooni bakteriaalse infektsiooni vastu. Lisaks tuvastati, et FOXO osaleb rakulises immuunsuses, soodustades hemotsüütide fagotsütoosi fagotsütootilise retseptori püüdja ​​retseptori C (Src) ja kahe väikese GTPaasi Rab5 ja Rab7 ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu, mis on seotud fagosoomide kaubitsemisega lüsosoomi. tsütoplasmas. Kokkuvõttes näitasid meie tulemused, et FOXO avaldab mõju hemolümfi ja enteraalse mikrobiota homöostaasile, aktiveerides IMD-rada normaalsetes krevettides ning soodustades otseselt või kaudselt AMP ekspressiooni ja suurendades hemotsüütide fagotsütoosi bakteritega nakatunud krevettide patogeenide vastu. See uuring näitas FOXO erinevaid funktsioone selgrootute limaskesta (lokaalses) ja süsteemses antibakteriaalses immuunsuses.

Tistanche toidulisandi eelised - kuidas tugevdada immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Sissejuhatus

Forkhead box transkriptsioonifaktori O perekonna valgud (FOXO-d) osalevad organismide erinevates kriitilistes bioloogilistes protsessides, sealhulgas rakutsükli reguleerimises, kahjustatud DNA parandamises, vähivastases immuunsuses ja eluea reguleerimises [1,2]. Imetajatel on neli erinevat FOXO valku (FOXO1, FOXO3, FOXO4 ja FOXO6); selgrootutel on aga ainult üks FOXO, mida Caenorhabditis elegansis tuntakse ka kui Daf-16 [3]. FOXO transkriptsioonilist aktiivsust reguleerivad mitut tüüpi translatsioonijärgsed modifikatsioonid, nagu fosforüülimine, atsetüülimine, metüülimine ja ubikvitineerimine [4]. Need modifikatsioonid mõjutavad FOXO tuuma translokatsiooni või tuumast väljumist ning selle interaktsiooni kaasrepressorite ja kaasaktivaatoritega, mis võivad soodustada või vähendada FOXO aktiivsust ja vahendada selle erinevaid bioloogilisi funktsioone [5, 6]. Pärast aktiveerimist osaleb FOXO paljudes füsioloogilistes funktsioonides, reguleerides mitmesuguste sihtgeenide transkriptsiooni [7]. FOXO-sid aktiveerivad mitmesugused ekstratsellulaarsed stiimulid, sealhulgas kasvufaktorid, tsütokiinid ja hormoonid [8]. Kasvusignaalid, nagu insuliin või insuliinitaoline kasvufaktor 1 (IGF-1), interakteeruvad insuliiniraja retseptoritega ja aktiveerivad fosfatidüülinositool-3-kinaasi (PI3K) signaaliülekande, mis viib FOXO fosforüülimiseni seriini/treoniini kinaas, proteiinkinaas B (AKT) [9]. Fosforüülitud FOXO translokeerub tuumast tsütosooli või takistab selle translokatsiooni tsütosoolist tuuma, kus see muutub ubikvitineerituks, mis viib selle lagunemiseni proteasoomi poolt [10]. Seevastu väliste kasvusignaalide puudumisel on PI3K-AKT signaalirada inaktiivne ja fosforüülimata FOXO translokeerub tuuma, et soodustada sihtgeeni transkriptsiooni [11]. FOXO osaleb ka selgrootute antibakteriaalsetes ja viirusevastastes kaasasündinud immuunvastustes [12,13]. FOXO krooniline aktiveerimine Drosophila vananevas sooles surub alla peptidoglükaani äratundmisvalgu SC2 (immuunpuudulikkuse (IMD) raja negatiivne regulaator) ekspressiooni ja lõhub soolestiku immuunsüsteemi homöostaasi [14]. FOXO reguleerib otseselt antimikroobsete peptiidide (AMP) geene nakatumata Drosophila epiteeli kudedes vastuseks nälgimisstressile, mis ei sõltu patogeenidele reageerivatest kaasasündinud immuunsuse radadest [15]. Kuid patogeeni infektsioon võib indutseerida ka enterotsüütide FOXO sisenemist tsütoplasmast otse Drosophila soolestikku [12]. FOXO-sõltuv AMP-de regulatsioon esineb ka imetajate epiteeli kudedes, mis viitab sellele, et see on loomadel evolutsiooniliselt konserveerunud [16]. Mitmed uuringud näitasid, et FOXO-sid aktiveerivad patogeenid või tsütokiinide stimuleerimine limaskesta immuunvastustes [17]. Nende translokatsiooni tuuma ja seondumist nende sihtgeenide promootoritega stimuleerib mitogeen-aktiveeritud valgu (MAP) kinaasi rada ja inhibeerib PI3K/AKT rada. FOXO-de sihtgeenid hõlmavad põletikueelseid signaalmolekule, adhesioonimolekule ja kemokiini retseptoreid [17]. Kas FOXO-d on seotud patogeenide vastaste süsteemsete immuunvastustega, jääb ebaselgeks. AMP-de ekspressiooni soodustamine patogeenide vastu on selgrootute humoraalse kaasasündinud immuunsuse oluline mehhanism [18]. Drosophila kaasasündinud immuunsuse korral osalevad Toll- ja IMD-rajad AMP ekspressiooni reguleerimises ning AMP-d mängivad olulist rolli sissetungivate patogeenide kõrvaldamisel [19–21]. Sarnaselt putukate immuunsusega osalevad Toll, IMD ja Januse kinaasi (JAK) / signaali muundur ja transkriptsiooni (STAT) radade aktivaator AMP ekspressiooni reguleerimises koorikloomadel [22, 23]. Vaja on selgitada, kas FOXO suudab reguleerida AMP-de ekspressiooni sõltumata Toll-, IMD- ja JAK/STAT-radadest patogeenidega nakatumise vastu vähilaadsetel. Lisaks humoraalsele immuunsusele tuginevad selgrootud ka rakulisele immuunsusele, et täita kaasasündinud immuunsusfunktsioone patogeense infektsiooni vastu. Hemotsüütide fagotsütoos on patogeense infektsiooni vastase rakulise immuunsuse üks olulisi mehhanisme [24]. Varasemad uuringud on leidnud, et FOXO{50}}vahendatud autofagia on vajalik looduslike tapjarakkude (NK) arenguks [25]. Lisaks osaleb FOXO neutrofiilide bakteriaalse fagotsütoosi soodustamises [26]. Kuigi koorikloomadel puuduvad spetsiaalsed immuunrakud, nagu NK-rakud või neutrofiilid, võivad krevettide hemotsüüdid fagotsütoosi kaudu avaldada süsteemset kaasasündinud immuunsust patogeensete bakterite infektsiooni vastu [27]. Siiski on ebaselge, kas FOXO osaleb krevettide hemotsüütide patogeeni fagotsütoosis. Krevettide vesiviljelus on üks maailma kiiremini kasvavaid loomsete valkude tootmisharusid ja on andnud olulise panuse ülemaailmse kasvava nõudluse rahuldamisse loomsete valkude järele. Praegu on ülemaailmne krevettide toodang ligikaudu 4,88 miljonit tonni väärtusega ligikaudu 39 miljardit USA dollarit [28]. Suure hulga loomade kooskasvatamine põhjustab aga loomadel märkimisväärset stressi, mis soodustab patogeenide, sealhulgas bakterite ja viiruste, paljunemist ja kliinilisi haigusi, mille tulemuseks on suur majanduslik kahju tööstusele [29]. Krevettide immuunmehhanismide uuringud võivad pakkuda uusi strateegiaid haiguste ennetamiseks ja tõrjeks [30]. Käesolevas uuringus tuvastasime kuruma krevetis (Marsupenaeus japonicus) FOXO. Pärast Foxo ekspressiooni katkestamist ja Vibrio anguillarum'i väljakutset leidsime, et bakterite kliirens ja krevettide ellujäämise määr vähenesid märkimisväärselt. Edasine uuring näitas, et FOXO soodustas otseselt või kaudselt AMP-de ekspressiooni ja suurendas krevettide bakterite fagotsütoosi. Analüüsiti FOXO võimalikke mehhanisme krevettide patogeeni nakatumise vastu.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Tulemused

FOXO-d ekspresseeritakse algtasemel nakatamata krevettides ja on ülesreguleeritud V. anguillarum'iga nakatunud krevettides

M. japonicus'e hemotsüütide transkriptoomilise sekveneerimise põhjal saime Foxo täispika cDNA järjestuse (GenBank registreerimisnumber: MW080526). Domeenide võrdlus näitas, et prognoositaval FOXO valgul on Forkhead (FH) domeen, mis on sarnane Homosapiens FOXO-dega, sealhulgas FOXO1, FOXO3, FOXO4 ja FOXO6, ning millel on sarnane AKT fosforüülimine (S1A joonis 1). Fülogeneetilise analüüsi tulemused näitasid, et FOXO-d jagunesid kaheks klastriks, sealhulgas selgroogsete ja selgrootute FOXO-d, ning krevettide FOXO rühmitus fülogeneetilise puu selgrootute harusse (S1B joonis 1). Sarnaselt inimese FOXO-dele [31] on krevettide FOXO-l ekstratsellulaarse reguleeritud kinaasi (ERK) fosforüülimise modifikatsioonisaidid ja CREB Binding Protein (CBP) atsetüülimise modifikatsioonisaidid, kuid puuduvad sir tuin 1 (SIRT1) deatsetüülimise modifikatsioonisaidid ja c-JUN N-terminaal. kinaasi (JNK) fosforüülimise modifikatsiooni saidid (S2 joonis fig.). Polüklonaalsed antikehad, mis tunnevad ära krevettide FOXO, valmistati, kasutades Escherichia colis ekspresseeritud FOXO rekombinantset FH domeeni (joonis 1A). FOXO kudede jaotumise analüüs mRNA ja valgu tasemel näitas, et seda ekspresseeriti kõigis testitud kudedes (joonis 1B). FOXO ekspressiooni ajalist kulgu V. anguillarum'iga nakatunud krevettide hemotsüütides ja sooltes analüüsiti qPCR ja Western blot analüüsi abil. Tulemused näitasid, et FOXO oli hemotsüütides ja sooltes ülesreguleeritud mRNA tasemel (joonised 1C ja 1D) ja valgu tasemel (joonis 1E ja 1F). Need tulemused viitasid sellele, et FOXO osaleb vastuses V. anguillarum'i infektsioonile ja ajendasid meid uurima FOXO funktsiooni krevettide immuunsuses.

FOXO osaleb tervete krevettide hemolümfi ja soolestiku mikrofloora homöostaasi reguleerimises

FOXO funktsiooni uurimiseks krevettide hemolümfis ja soole mikrofloora homöostaasis viidi läbi RNA interferents ja analüüsiti bakterite koormust. Tulemused näitasid, et Foxo ekspressioon vähenes märkimisväärselt Foxo-RNAi krevettides (joonised 2A ja 2B). Foxo RNAi sihtmärgiväliseid mõjusid analüüsiti ka teiste Foxi perekonna geenide (sealhulgas Foxk2 ja Foxn3) ekspressiooni tuvastamise teel. Tulemused näitasid, et Foxo koputamine ei vähendanud Foxk2 ega Foxn3 ekspressioonitasemeid (joonis S3A – S3C). Kasutades Western blot analüüsi ja fluorestsents-immunotsütokeemia analüüse, jälgisime lisaks FOXO rakusisese jaotumist bakterite poolt nakatatud krevettide soolestikus ja hemotsüütides pärast Foxo vaigistamist. Tulemused näitasid, et võrreldes dsGfp rühmaga langes Foxo-RNAi krevettide FOXO tase tuumas oluliselt, isegi kui krevetid olid nakatunud V. anguillarum'iga (S3D-S4E' joonised). Kõik ülaltoodud tulemused viitasid sellele, et meie Foxo RNAi test võib Foxo spetsiifiliselt vaigistada hemotsüütides ja sooltes (sealhulgas tsütoplasmas ja tuumas). Järgmisena analüüsisime bakterite koormust hemolümfis ja sooltes pärast Foxo hävitamist krevettidel normaalsetes tingimustes (ilma bakteriaalse väljakutseta). Tulemused näitasid, et bakterite arv hemolümfis ja soolestikus suurenes oluliselt pärast Foxo ekspressiooni edukat katkestamist (joonised 2C ja 2D). Lisaks analüüsisime Foxo-RNAi krevettide ellujäämismäära ilma bakteriaalse väljakutseta ja tulemused näitasid, et Foxo-knockdown krevettide ellujäämismäär vähenes oluliselt võrreldes kontrollrühmaga (joonis 2E). Nende tulemuste edasiseks kontrollimiseks analüüsisime antibiootikumidega töödeldud Foxo-RNAi krevettide ellujäämismäära ja tulemused näitasid, et võrreldes dsGfp rühmaga ei vähenenud iduvabade krevettide elulemus oluliselt (joonis 2F). Kõik tulemused näitasid, et FOXO mängib normaalsetes tingimustes rolli krevettide in vivo mikrobiota (sealhulgas hemolümfi ja enteraalse mikrobiota) homöostaasis.

cistanche toidulisandi eelised - suurendavad immuunsust

FOXO osaleb hemolümfi ja soolestiku mikrofloora homöostaasi reguleerimises, edendades Relishi ja Amp ekspressiooni tervetel krevettidel

Varasemad uuringud näitavad, et terved krevetid sisaldavad tsirkuleerivas hemolümfis vähe, kuid stabiilset hulka baktereid ja seedetraktis palju, kuigi püsivaid baktereid ning immuunfaktoreid, nagu antimikroobsed peptiidid (AMP), mida reguleerib tuumafaktor kappa B (NF). -κB) rada ja reaktiivsed hapniku liigid (ROS), mida reguleerib topeltoksüdaasi (DUOX) rada, mängivad olulist rolli homöostaasi hemolümfis ja soolestiku mikrobiotas [32–34]. Et uurida FOXO osalemise mehhanismi hemolümfi ja soolestiku mikrofloora homöostaasi regulatsioonis normaalsetes tingimustes, tuvastasime esmalt FOXO subtsellulaarse jaotumise hemotsüütides ja sooltes normaalsetes tingimustes. Tulemused näitasid normaalsetes tingimustes nõrka FOXO signaali krevettide hemotsüütide ja soolerakkude tuumades (joonised 3A ja 3B), mis viitab sellele, et normaalsetes tingimustes aktiveeris krevettide in vivo mikrobiota veidi FOXO-d. AMP ekspressiooni reguleerib IMD rada Drosophila soolestikus [35]. Seetõttu eeldasime, et transkriptsioonifaktor Relish võib olla FOXO sihtgeen. Pärast Foxo löömist tuvastasime krevettide hemotsüütides ja sooltes Relishi, IMD raja transkriptsioonifaktori, mRNA ekspressiooni. Tulemused näitasid, et Relishi ekspressioon vähenes märkimisväärselt Foxo-knockdowni krevettides (joonised 3C ja 3D) ning sarnased tulemused saadi valgu tasemel (joonis 3E ja 3E'). Tulemused näitasid, et FOXO võib soodustada Relishi ekspressiooni ja aktiveerida IMD rada. Kinnitamaks, et FOXO osaleb hemolümfi ja seedetrakti homöostaasis IMD signaaliülekande kaudu, saadi iduvabad krevetid (joonis 3F) ning tuvastati RELISH aktivatsioon ja AMP ekspressioon. Võrreldes kontrolliga, vähenes FOXO ja RELISH kogus soolerakkude ja hemotsüütide tuumades oluliselt (joonised 3G ja 3H). Vahepeal skriiniti idus AMP-de, sealhulgas crustiinide (CrusI-2 kuni 5) ja anti-lipopolüsahhariidide (Alf A1, B1, C1, D1 ja E1) ekspressiooni, mida võib-olla reguleerivad FOXO ja/või RELISH. -vabad krevetid ja tulemused näitasid, et CrusI-3, Alf-B1 ja Alf-C1 ekspressioon vähenes oluliselt krevettide hemootsüütides ja sooltes (joonised 3I ja 3J). Arvestades, et Alf-B1 ja Alf C1 ekspressiooni reguleeris IMD rada [36], näitasid need tulemused, et FOXO osaleb normaalsetes tingimustes hemolümfi ja seedetrakti homöostaasi reguleerimises IMD raja kaudu, et soodustada AMP-d.

Joonis 1. V. anguillarum'i poolt nakatatud krevettides oli FOXO ülereguleerimine. (A) FOXO FH domeeni rekombinantne ekspressioon E. coli-s ja Western blot meetod FOXO tuvastamiseks, kasutades küülikutel valmistatud FOXO-vastaseid polüklonaalseid antikehi. Rada 1, E. coli koguvalgud koos Foxo-pGEX4T-1. Rada 2, bakterite koguvalgud pärast IPTG induktsiooni. Rada 3, puhastatud rekombinantne FOXO. Rada 4, FOXO töötlemata krevettide soolestikus tuvastati Western blot analüüsi abil. M, valgu molekulmassi markerid. (B) Foxo jaotus kudedes mRNA (ülemine paneel) ja valgu (alumine paneel) tasemel tuvastati vastavalt RT-PCR ja Western blot analüüsiga. ACTB on -aktiini lühend. (C, D) Foxo mRNA ekspressioonimustreid hemotsüütides (C) ja sooltes (D) analüüsiti qPCR abil, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef{11}} geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (E, F) FOXO valgu ekspressioonimustrid hemotsüütides (E) ja sooltes (F) tuvastati Western blot analüüsiga. Kolme korduse statistilise analüüsi tulemused olid näidatud alumistel paneelidel. Western blot'i ribad digitaliseeriti ImageJ tarkvara abil, skaneerides ribasid kolmest sõltumatust kordusest. FOXO / -aktiini suhtelised ekspressioonitasemed väljendati keskmisena ± SD ja kontrollkrevettide väärtus määrati üheks. Vearibad joonisel näitavad SD-sid (kolm kordust).

FOXO aktiveeritakse krevettides V. anguillarum'i nakatumise tõttu ja osaleb hemolümfi ja soolte patogeeni eemaldamises

On teatatud, et FOXO saab aktiveerida bakteriaalse või tsütokiini stimulatsiooniga ja see kandub ümber tuuma, et reguleerida teatud sihtgeenide ekspressiooni imetajatel [17]. Et tuvastada, kas FOXO aktiveeriti bakterite poolt nakatatud krevettides, analüüsiti FOXO subtsellulaarset jaotumist krevettide soolestikus Western blot analüüsi abil. Tulemused näitasid, et FOXO kogus soolerakkude tsütoplasmas vähenes järk-järgult 2-4 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist (joonis 4A). Seevastu FOXO kogus soolestiku rakkude tuumas suurenes pärast V. anguillarum'iga nakatumist oluliselt (joonis 4B). FOXO rolli analüüsimiseks süsteemses immuunsuses kasutati fluorestseeruvat immunotsütokeemilist testi, et jälgida FOXO tuuma translokatsiooni krevettide hemotsüütides 2 tundi pärast V. iga-aastast larum stimulatsiooni. Leidsime, et bakterite poolt põhjustatud FOXO translokatsioon tuuma suurenes märkimisväärselt, kuid PBS-ga nakatatud krevettides ei toimunud ilmset muutust (joonised 4C ja 4C'). Et uurida, kas tuuma ümberpaigutatud FOXO osaleb patogeeni kliirensis, analüüsisime Foxo-knockdowni krevettide hemolümfi ja soolte bakterikoormust 6 tundi pärast bakteriaalset nakatamist. Leidsime, et pärast Foxo kukkumist suurenes bakterite koormus hemolümfis ja sooltes märkimisväärselt võrreldes kontrollrühmade omaga (joonis 4D). Veelgi enam, V. anguillarum'iga nakatunud Foxo-knockdown krevettide ellujäämismäär vähenes oluliselt võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4E). Need tulemused näitasid, et FOXO aktiveerus enteraalsetes rakkudes ja hemotsüütides ning viitas sellele, et FOXO osaleb lokaalsetes ja süsteemsetes immuunvastustes bakteriaalse infektsiooni vastu.

Joonis 2. FOXO osaleb soolestiku (lokaalses) ja süsteemses antibakteriaalses immuunvastuses. (A, B) Foxo-RNAi efektiivsus krevettide hemotsüütides (A) ja sooltes (B), määratuna qPCR (A) ja Western blot analüüsi (B) abil. qPCR kuupäeva analüüs, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni. Vearibad näitavad SD-sid. (C) Foxo-knockdown krevettide hemolümfibakterite tuvastamine tahke LB kultuuri abil (kolm kordust); Kontrollina kasutati dsGfp süstimist. Lahjendussuhe oli 1:10. (D). Bakterite arv hemolümfis ja sooltes Foxo knockdown krevettide ja dsGfp-injection krevettide puhul ilma bakteriaalse väljakutseta. (E). Foxo-RNAi krevettide ellujäämismäär ilma bakteriaalse väljakutseta. Kontrollina kasutati dsGfp süstimist. (F). Antibiootikumidega töödeldud Foxo-RNAi krevettide ellujäämismäär. Kontrollina kasutati dsGfp süstimist. Tavaline: metsikut tüüpi krevetid ei ole antibiootikumidega töödeldud.

Joonis 3. FOXO põhikogus translokeerub hemotsüütide ja soolerakkude tuumadesse, soodustab Relishi ekspressiooni ja seejärel aktiveerib IMD raja, et reguleerida normaalsetes tingimustes hemolümfi ja soolestiku mikrobiota homöostaasi. (A) FOXO subtsellulaarse jaotuse tuvastamiseks normaalsete krevettide hemotsüütides kasutati immunotsütokeemiat. Skaalariba=20 μm. Cy: tsütoplasma; Nu: Tuum. (B) Western blot analüüsi kasutati FOXO subtsellulaarse jaotumise tuvastamiseks normaalsete krevettide ja V. anguillarum'iga nakatunud krevettide soolerakkudes. (C) Relishi ekspressioon mRNA tasemel tuvastati krevettide hemotsüütides pärast Foxo löömist qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef{4}} geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (D) Relishi ekspressioon mRNA tasemel krevettide soolestikus pärast Foxo löömist tuvastati qPCR abil, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef{6}} geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (E) RELISH-i tase tuvastati krevettide puhul Western blot meetodil pärast Foxo löömist. (E') Kolm paneeli E koopiat digitaliseeriti ImageJ tarkvara abil. (F) Hemolümfi ja soolte bakteriaalne koormus krevettides 24 tundi pärast antibiootikumravi. (G) FOXO tuumas tuvastati krevettide hemotsüütides ja sooltes Western blot analüüsiga 24 tundi pärast antibiootikumidega töötlemist. (H) RELISH tuumas tuvastati krevettide hemotsüütides ja sooltes Western blot analüüsiga 24 tundi pärast antibiootikumidega töötlemist. (I, J) Amps ekspressioon iduvabade krevettide hemotsüütides (I) ja soolestikus (J) määrati qPCR abil, kasutades sisemiste võrdlusgeenidena -aktiini ja Ef-1. Kontrollina kasutati tavalisi krevette (H2O süstimine).

Varasemad uuringud näitasid, et FOXO transkriptsiooni aktiivsust reguleerib fosforüülimise modifikatsioon ja seriini / treoniini kinaas AKT reguleerib Forkheadi transkriptsioonifaktorite aktiivsust, fosforüülides neid ja pärssides nende ebaselget translokatsiooni [9, 37]. Et uurida, kas AKT mõjutab FOXO suurenemist tuumas pärast patogeensete bakteritega nakatumist, tuvastasime pärast krevettide Akt-i hävitamist kõigepealt FOXO sisalduse tsütoplasmas ja tuumas Western blot analüüsiga. Tulemused näitasid, et FOXO kogus hemotsüütide tuumas ja soolerakkudes suurenes oluliselt pärast Akt ekspressiooni katkestamist (joonised 5A ja 5B) krevettidel 2 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist (joonised 5C ja 5C'). Eksperimentaalsete tulemuste kontrollimiseks kasutasime ka immunotsütokeemia testi, et jälgida FOXO subtsellulaarset jaotumist krevettide hemotsüütides pärast Akt-i löömist. Tulemused näitasid, et FOXO suurenes märkimisväärselt hemotsüütide tuumas, kui Akt on 2 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist kukkunud (joonised 5D ja 5D'). Et uurida, kas patogeeni infektsioon mõjutab AKT aktiivsust, tuvastasime AKT fosforüülimise muutuse pärast patogeeniga nakatumist, kasutades inimese p-AKT (Ser473) antikeha (kreveti AKT fosforüülimiskoht on Ser486) ja leidsime, et fosforüülitud AKT tase langes oluliselt krevettide hemotsüüdid ja sooled pärast 30-minutilist V. anguillarum'i infektsiooni (joonised 5E ja 5F). Need tulemused näitasid, et patogeeni nakatumine võib vähendada fosforüülitud AKT taset, mis pärsib ensüümi aktiivsust ja vähendab AKT võimet fosforüülida FOXO-d. Fosforüülimata FOXO siseneb tuuma ja indutseerib selle sihtgeenide ekspressiooni. joonisel on näidatud SD-d.

cistanche ekstrakt

Patogeeni infektsioon vähendab AKT aktiivsust ja kutsub esile FOXO tuuma translokatsiooni

FOXO avaldab immuunkaitset sissetungivate bakterite vastu, reguleerides antimikroobsete peptiidide ekspressiooni bakteritega nakatunud krevettides

Et uurida mehhanismi, mille abil FOXO mõjutab krevettide bakteriaalse infektsiooni vastust, tuvastasime kõigepealt FOXO poolt reguleeritud immuunefektorgeenid. Pärast Foxo edukat hävitamist krevettide hemotsüütides ja sooltes koos V. anguillarum'iga või ilma, vähenesid CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ja Alf-E1 ekspressioonitasemed vaigistatud krevettide puhul võrreldes märkimisväärselt. kontrollrühma kuuluvatega (joonised 6A ja 6B). Tulemuste täiendavaks kontrollimiseks tuvastasime pärast Akt-i katkestamist ka nelja AMP ekspressiooni. Tulemused näitasid, et nelja AMP ekspressioon suurenes oluliselt 6 tundi pärast V. anguil larum'i nakatumist võrreldes kontrollrühma omaga (joonised 6C ja 6D). Võrreldes normaalsetes tingimustes ülesreguleeritud AMP-dega (sealhulgas Alf-B1 ja Alf-C1) (joonised 3I ja 3J), reguleeriti V-ga nakatunud krevettides ka AMP-de täiendav geen (CrusI-3, Alf-E1). anguillarum (joonised 6A ja 6B). Meie eelmine uuring näitas, et RELISH soodustas Alf-B1 ja Alf-C1 ekspressiooni krevettides [36]. Need tulemused näitavad, et FOXO võib otseselt reguleerida AMP ekspressiooni, nagu CrusI-3 ja Alf-E1, sõltumata IMD signaaliteest. Hüpoteesi kinnitamiseks viidi läbi ChIP test, et tuvastada, kas FOXO võib seostuda Alf-E1 promootoriga. Saadi Alf-E1 promootorjärjestus (S4 joonis fig) ja ennustati FOXO sidumissaite (joonis 6E). ChIP tulemus näitas, et FOXO võib seostuda Alf-E1 promootoriga (joonis 6F). Need tulemused näitasid, et FOXO osaleb ka antibakteriaalses immuunsuses, reguleerides otseselt AMP-de ekspressiooni krevettides.

Joonis 4. V. anguillarum'i poolt nakatatud krevettide tuuma translokeerunud FOXO. (A, B) FOXO jaotusmustrid bakterite poolt nakatatud krevettide soolerakkude tsütoplasmas (A) ja tuumas (B), analüüsituna Western blot meetodil (A ja B alumised paneelid). Western blot ribad digitaliseeriti ImageJ tarkvara abil, skaneerides ribasid kolmest kordusest. FOXO/-aktiini või FOXO/histooni 3 suhtelised ekspressioonitasemed väljendati keskmisena ± SD ja kontrollkrevettide väärtuseks määrati üks. (C) FOXO tuuma translokatsioon krevettide hemotsüütides 2 tundi pärast V. anguillarumi nakatumine tuvastati fluorestseeruvate immunotsütokeemiliste testide abil. Kontrollina kasutati PBS-i süsti. Skaalariba=20 μm. (C') Paneeli C statistiline analüüs FOXO ja DAPI-ga värvitud tuumade kolokalisatsiooni hemotsüütides analüüsiti WCIF ImageJ tarkvara abil. (D) Bakterite arv Foxo-knockdown krevettide hemolümfis ja soolestikus järgnes V. anguillarum'i süstimisele; Kontrollina kasutati dsGfp süstimist krevettidesse pärast bakteriaalset süstimist. (E) V. anguillarum'iga nakatunud Foxo-RNAi krevettide ellujäämismäär. Kontrollina kasutati dsGfp süstimist.

FOXO soodustab hemotsüütide fagotsütoosi bakterite vastu, soodustades SRC ekspressiooni

Varasemad uuringud on teatanud, et FOXO interakteerub vahetult CXCR2 ja CD11b promootorpiirkondadega, et reguleerida neutrofiilide fagotsütoosi imetajatel [26]. Et testida, kas FOXO on seotud hemotsüütide fagotsütoosiga krevettide antibakteriaalses immuunsuses, uurisime erinevate meetoditega fagotsüütide määra pärast Foxo sekkumist. Pärast Foxo knockdowni olid Foxo-knockdowni rühma fagotsütaarne määr ja fagotsüütiline indeks oluliselt madalamad kui kontrollrühmal (dsGfp) (joonised 7A ja 7A'). Samuti kasutasime voolutsütomeetriat, et kvantifitseerida hemotsüütide fagotsüütide kiirust pärast Foxo vaigistamist. Tulemused näitasid, et ka Foxo-RNAi rühma faagitsütoosi määr langes oluliselt võrreldes dsGfp rühma omaga (joonised 7B ja 7B'). Nende tulemuste edasiseks kinnitamiseks uurisime ka fagotsüütide kiirust pärast Akt-i katkestamist. Tulemused näitasid, et võrreldes kontrollrühma omadega suurenesid fagotsüütimäär ja fagotsüütindeks oluliselt (joonised 7C ja 7C'). Need tulemused näitasid, et FOXO soodustab krevettide hemotsüütide fagotsütoosi. Et uurida, kuidas FOXO suurendab krevettide hemotsüütide fagotsütoosi, tuvastasime krevettide fagotsütoosiga seotud varem teatatud geenide ekspressiooni. On teatatud, et püüduri retseptori klass B (SRB) ja klass C (SRC) on seotud hemotsüütide fagotsütoosiga [38, 39]. Leidsime, et Src, mitte Srb, mRNA ekspressioonitase vähenes oluliselt pärast Foxo vaigistamist hemotsüütides ja sooltes (joonised 7D ja 7E), samas kui Src ekspressioon suurenes märkimisväärselt pärast Akt-i krevettide hävitamist (joonis 7F). Sarnased tulemused saadi valgu tasemel (joonised 7G ja 7G'). Need tulemused näitasid, et FOXO soodustab krevettide patogeenide hemotsüütide fagotsütoosi, soodustades SRC ekspressiooni.

FOXO soodustab RAB5 ja RAB7 ekspressiooni krevettide fagotsütoosi ajal

Varasemad uuringud on näidanud, et väikesed GTPaasid RAB5 ja RAB7 on äsja endotsütoositud vesiikulite varajastesse ja hilistesse endosoomidesse transpordi peamised regulaatorid [40]. RAB5 on esmaste fusioonisündmuste peamine regulaator ja varajaste endosoomide marker [41, 42]. RAB7 on vajalik hilise fagosoomi-lüsosoomi fusiooni jaoks ja see on hiliste endosoomide marker [43]. Et uurida, kas RAB5 ja RAB7 osalevad krevettide patogeeni kliirensis, analüüsisime esmalt Rab5 ja Rab7 ekspressioonimustreid ja leidsime, et kaks väikest GTPaasi olid bakteritega nakatatud krevettides ülesreguleeritud (joonis S5A – S5D). Lisaks analüüsisime Rab5-RNAi ja Rab7-RNAi krevettide ellujäämismäära pärast bakteritega nakatamist ning tulemused näitasid, et Rab5 ja Rab7 knockdown krevettide ellujäämismäär langes kontrollrühmaga võrreldes oluliselt ( S5E ja S5F joonis). Need tulemused näitasid, et RAB5 ja RAB7 mängivad olulisi funktsioone resistentsuses bakteriaalsete patogeenide vastu. Et uurida, kas RAB5 ja RAB7 on seotud FOXO-vahendatud fagotsütoosiga, uurisime Rab5 ja Rab7 mRNA ekspressioonitasemeid pärast Foxo ekspressiooni häirimist krevettides. Tulemused näitasid, et Rab5 ja Rab7 ekspressioonitasemed vähenesid märkimisväärselt hemotsüütides ja sooltes (joonised 8A ja S6A). arvestades, et Rab5 ja Rab7 ekspressioon suurenes märkimisväärselt pärast Akt hävitamist krevettides (joonis 8B). Ülaltoodud tulemuste täiendavaks kinnitamiseks tuvastati ka Foxo või Akt knockdowni krevettide RAB5 ja RAB7 valgutasemed. Võrreldes dsGfp süstimisrühmaga, langesid RAB5 ja RAB7 tasemed oluliselt ka Foxo-knockdowni krevettide hemotsüütides ja sooltes, kuid tõusid oluliselt Akt-knockdown-krevettide puhul 2 tundi pärast V. anguillarum'i stimuleerimist (joonised 8C–8D'; S6B ja S6B'). Need tulemused näitasid, et RAB5 ja RAB7 osalevad krevettide hemotsüütide FOXO-vahendatud faagitsütoosis. Lisaks tuvastasime, et RAB5 ja RAB7 paiknesid krevettide hemotsüütides koos V. anguillarum'iga (joonis 9). Kokkuvõttes näitasid tulemused, et RAB5 ja RAB7 on seotud krevettide FOXO-vahendatud fagotsütoosiga.

Joonis 5. Patogeeniga nakatumine vähendas AKT aktiivsust, mis soodustas FOXO tuuma translokatsiooni krevettide hemotsüütides ja enteraalsetes rakkudes. (A, B) Akt-RNAi efektiivsus krevettide hemotsüütides ja sooltes, määratud qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni (A) ja Western blot analüüsi (B). (C) Akt-knockdown krevettide FOXO kogust tsütoplasmas ja soolte tuumas analüüsiti Western blot analüüsiga. Kontrollina kasutati dsGfp-d. (C') Paneeli (C) statistiline analüüs. Ribade digitaliseerimiseks kasutati ImageJ tarkvara, skaneerides kolmekordseid pilte. (D) FOXO tuuma translokatsioon Akt-knockdown krevettide hemotsüütides tuvastati 2 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist, kasutades fluorestseeruvat immunotsütokeemilist analüüsi. Kontrollina kasutati dsGfp-d. Skaalariba=20 μm. (D') (D) statistiline analüüs. WCIF ImageJ tarkvara kasutati, et analüüsida kaaslokaliseerimist anti-FOXO (roheline) ja DAPI-värvitud tuuma (sinine) fluorestsentsi intensiivsuse suhte järgi hemotsüütides pärast särituse väärtuse fikseerimist. (E, F) Fosforüülitud AKT (p-AKT) sisalduse muutus V. anguillarum'iga nakatatud krevettide hemotsüütides (E) ja sooltes (F). Alumised paneelid on (E) ja (F) digitaliseeritud arvud, mis põhinevad vastavalt Western blot analüüsi ja statistilise analüüsi ribadel.

Cistanche tee

Arutelu

FOXO kui väga oluline transkriptsioonifaktor osaleb paljudes füsioloogilistes ja metaboolsetes funktsioonides [44,45]. Käesolevas uuringus tuvastasime krevettide (M. japonicus) FOXO ja leidsime, et see osaleb hemolümfi ja enteraalse mikrobiota homöostaasi reguleerimises, reguleerides AMP ekspressiooni normaalsetes tingimustes. FOXO võib aktiveerida krevettide bakteriaalse infektsiooni tõttu ja ümber paigutada tuuma, kus see reguleerib otseselt ja kaudselt (IMD raja kaudu) AMP-de ekspressiooni. FOXO reguleeris fagotsütoosiga seotud geenide, nagu SRC ja väikesed GTPaasid, RAB5 ja RAB7, ekspressiooni, et soodustada hemotsüütide fagotsütoosi patogeenide vastu. Seetõttu mängib krevettide FOXO erinevat rolli süsteemsetes ja lokaalsetes (enteersetes) immuunvastustes patogeenide vastu (joonis 10). Võrreldes inimese FOXO-dega on krevettide FOXO-l suhteliselt konserveerunud aminohappejärjestus ja AKT fosforüülimissaidid; krevettide FOXO teine ​​AKT fosforüülimiskoht on aga seriini asemel treoniin. FOXO AKT-fosforüülimine kontrollib FOXO tuuma- ja tsütoplasmaatilist transporti [9]. Selles uuringus leidsime, et AKT on seotud FOXO tuumasisenemise kontrolliga. Pärast V. anguillarum'iga nakatumist vähenes fosforüülitud AKT tase märkimisväärselt, mis näitas, et patogeeniga nakatunud krevettides oli AKT aktiivsus vähenenud, suurendades seega FOXO tuuma retentsiooni või tuuma translokatsiooni ning seejärel indutseerides sihtgeenide ekspressiooni. nagu Relish ja Amp, et seista vastu patogeeniga nakatumise vastu. Varasemad uuringud on leidnud, et FOXO osaleb Drosophila soolestiku mikrofloora homöostaasis, represseerides peptidoglükaani äratundmisvalgu SC2 (IMD raja negatiivne regulaator) ekspressiooni, et aktiveerida AMP ekspressioonirada [14]. RELISH teatati FOXO peamise sihtgeenina hüpoksiataluvuse kontrolli all hoidmisel Drosophilas [46]. Sarnaselt teiste loomadega sisaldab ka krevettide seedetrakt suhteliselt kõrget ja püsivat mikrobiootat. Üha rohkem tõendeid näitab ka seda, et mõnede vees elavate tervete selgrootute, sealhulgas krevettide hemolümf sisaldab stabiilset kogust baktereid [47]. Meie eelmine uuring näitas, et C-tüüpi lektiin osaleb hemolümfi mikrobiota homöostaasi reguleerimises, säilitades AMP-de ekspressiooni [34], kuid me ei tea, millised signaalirajad on seotud AMP ekspressiooni reguleerimisega. Siin näitasid meie tulemused, et FOXO osaleb normaalsetes tingimustes IMD signaalimise kaudu hemolümfi ja enteraalse mikrofloora homöostaasi reguleerimises. Nakatamata krevettide puhul vähendas Foxo hävitamine märkimisväärselt Relishi ekspressiooni ja krevettide ellujäämise määr vähenes märkimisväärselt, isegi ilma bakteriaalse infektsioonita. Samuti leidsime normaalsete krevetirakkude tuumast väikese koguse FOXO-d. Seetõttu arvame, et FOXO osaleb normaalsetes tingimustes hemolümfi ja enteraalse floora homöostaasi reguleerimises, edendades Relishi ekspressiooni ja seejärel suurendades AMP ekspressiooni IMD raja kaudu. Need tulemused näitasid, et FOXO osaleb kohalikus ja süsteemses immuunsuses, et soodustada krevettide hemolümfi ja seedetrakti mikrobiota homöostaasi. Humoraalne immuunsus mängib AMP-de aku tootmise kaudu kriitilist rolli patogeense infektsiooni vastu resistentsuses pöördkiirusega [21,48]. Humoraalne reaktsioon hõlmab AMP-de indutseeritavat sünteesi ja sekretsiooni, mis vabanevad süsteemse vastusena hemolümfi või lokaalse vastusena epidermise pinnale või seedetrakti õõnsusse [19]. AMP ekspressiooni reguleerivad peamiselt Toll/Dif ja IMD/Relishi signaalirajad puuviljakärbestel [49]. Praegu on krevettides tuvastatud mitu AMP-de perekonda, sealhulgas crustins, anti-lipopolüsahharide faktorid (Alfs) ja penaeidiinid [50]. Käesolev uuring näitas, et FOXO võib otseselt või kaudselt (IMD/Relishi signaalimise kaudu) reguleerida AMP-de, sealhulgas CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ja Alf-E1 ekspressiooni. Arvasime, et FOXO vähene aktiveerimine krevettide hemotsüütides ja soolestikus normaalsetes tingimustes võib reguleerida Foxo peamist sihtgeeni, st Relishi, et säilitada in vivo mikrobiota homöostaas. Nakatumise ajal aktiveerivad sissetungivad patogeenid FOXO, millest suurem osa kandub ümber tuuma, kus see reguleerib lisaks Relishile ka rohkem sihtgeene, sealhulgas mõningaid AMP-sid, nagu Alf-E1 ja CrusI-3. Kokkuvõttes osaleb FOXO tervete krevettide hemolümfi ja soolestiku mikrobiota homöostaasi reguleerimises, aktiveerides IMD signaaliülekande põhitasemel hemolümfis ja seedetraktis. Patogeeni infektsioon aktiveerib FOXO, vähendades AKT aktiivsust ja soodustab AMP-de ekspressiooni otseselt ja kaudselt süsteemses immuunsuses ja kohalikus (soole) immuunsuses. Fagotsütoos on retseptorite vahendatud, aktiinist ja ATP-st sõltuv nähtus, mille vallandab osakeste või patogeenide seondumine spetsiifiliste tsütomembraani retseptoritega ja mis kujutab endast olulist immuunprotsessi, mille kaudu peremeesorganism saab end patogeenide eest kaitsta [24]. Väikesed GTPaasid, nagu RAB5 ja RAB7, osalevad fagotsütoosi jätkuvas membraani ümberkujundamises ja vesiikulite liikumises. Meie eelmine uuring teatas, et püüduri retseptorid SRB ja SRC osalevad krevettide retseptoritena hemotsüütide fagotsütoosis [38, 39]. Käesolevas uuringus leidsime, et pärast Foxo katkestamist vähenes Src ekspressioon märkimisväärselt ja hemotsüütide fagotsütoosi määr vähenes märkimisväärselt, mis viitab sellele, et Src on FOXO sihtgeen ja et FOXO osaleb patogeensete bakterite SRC-vahendatud fagotsütoosis. FOXO võib samuti soodustada kahe väikese GTPaasi, RAB5 ja RAB7, ekspressiooni. Need väikesed GTPaasid osalevad varajaste ja hiliste fagosoomide järjestikuses transpordis ja on nende peamised määrajad [51]. Fagosoomid migreeruvad raku perifeeriast rakusisesesse piirkonda, kus RAB5 asendub transpordi ajal RAB7-ga ja lõppkaup transporditakse lagunemiseks lüsosoomi [52,53]. Samuti leidsime, et RAB5 ja RAB7 võivad koos lokaliseeruda hemotsüütides olevate patogeenidega, mis näitas, et patogeenid fagotsüteeriti krevettide hemotsüütide poolt, läbides varajasi ja hilisi fagosoome, enne kui need lõpuks lüsosoomides lagunesid. Seetõttu osaleb FOXO rakulises immuunvastuses, soodustades hemotsüütide fagotsütoosi. Kokkuvõtteks näitavad meie tulemused, et FOXO ei osale mitte ainult normaalsetes tingimustes mikrobiota homöostaasi reguleerimises, vaid ka nakatunud krevettide patogeensete bakterite kliirensis, soodustades AMP-de ekspressiooni ja hemotsüütide fagotsütoosi.

Joonis 6. FOXO täidab oma antibakteriaalset rolli krevettides, reguleerides AMP-de ekspressiooni. (A, B) Amps ekspressioon Foxo-knockdown krevettide hemotsüütides (A) ja sooltes (B), määratud qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni; Kontrollina kasutati dsGfp süstimist krevettidesse. Andmeid analüüsiti statistiliselt, kasutades Mann-Whiteny U testi. (C, D) Amps ekspressiooni Akt knockdown krevettide hemotsüütides (C) ja soolestikus (D) analüüsiti qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni; Kontrollina kasutati dsGfp süstimist krevettidesse. Olulisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil. (E) Alf-E1 promootori FOXO ennustatud seondumiskohtade skemaatiline diagramm. (F) ChIP ja RT-PCR kasutati FOXO seondumise tuvastamiseks Alf-E1 promootorjärjestusega, kasutades praimereid (Alf-E1-F ja Alf-E1-R, tabel 1). RT-PCR-i kasutati ka Alf-E1 kodeeriva piirkonna amplifitseerimiseks RT-PCR praimeritega (Alf-E1-RT-F ja Alf-E1-RT-R. Tabel 1), kasutades ChIP-i saadi DNA matriitsina. Kontrollina kasutati IgG antikeha ja sihtriba kinnitamiseks kasutati normaalset genoomse DNA amplifitseeritud fragmenti.

Joonis 7. FOXO suurendab krevettide patogeenide hemotsüütide fagotsütoosi, soodustades SRC ekspressiooni. (A) V. anguillarum'i hemootsüütide fagotsütoos, mida täheldati fluorestsents-immunotsütokeemilise testiga fluorestsentsmikroskoobi all. V. anguillarum märgistati FITC-ga (roheline) ja rakutuumad värviti DAPI-ga (sinine). Punane nool näitab fagotsüütilisi hemotsüüte. Skaalariba=20 μm. (A') Foxo-knockdown krevettide fagotsüütilise määra ja fagotsüütilise indeksi statistiline analüüs. Kontrollina kasutati dsGfp süstimisrühma. Igas katses loendati fluorestsentsmikroskoobi all viissada hemotsüüti. Andmeid analüüsiti statistiliselt Studenti t-testi abil. (B) Hemotsüütide bakteriaalne fagotsütoos, mida analüüsiti voolutsütomeetria abil. Baktereid sisaldavad fagotsütoositud hemotsüüdid (R2) eraldati fagotsütoosimata hemotsüütidest (R3) hemotsüütides leiduvate märgistatud bakterite fluorestsentssignaali alusel, kasutades tarkvara IDEAS Application v6.{8}}. (B') Hemotsüütide fagotsütaarne määr voolutsütomeetria andmete põhjal. Iga analüüsi jaoks loendati kolm tuhat hemotsüüti ja viidi läbi kolm kordust. Kontrollina kasutati dsGfp rühma. (C) V. anguillarum'i hemotsüüdi fagotsütoosi Akt knockdown krevettide puhul jälgige fluorestsentsmikroskoobi all. Skaalariba=10 μm. (C') Fagotsütaarse kiiruse ja fagotsüütilise indeksi statistiline analüüs, mis põhineb paneeli (C) andmetel. (D) Srb ja Src mRNA ekspressioonitase Foxo knockdown krevettide hemotsüütides, analüüsitud qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef{11}} geomeetrilist keskmist ekspressiooni. Kontrollina kasutati dsGfp süstimist. (E) Srb ja Src mRNA ekspressioon Foxo-RNAi krevettide soolestikus analüüsitud qPCR abil, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (F) Src mRNA ekspressioon Akt-RNAi krevettide hemotsüütides, analüüsitud qPCR-ga, kasutades endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef{17}} geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (G) SRC valgu tase Foxo-RNAi või Akt-RNAi krevettide hemotsüütides, analüüsituna Western blot analüüsi abil. Kontrollina kasutati dsGfp süsti. (G') Paneeli (G) kolme korduse andmetel põhinev statistiline analüüs.

materjalid ja meetodid

Eetikaavaldus

Kõik loomkatsed viidi läbi kooskõlas Hiina riiklike direktiividega (GB 14922.2–2011 ja GB 14925–2010). Uuringus kasutatud küülikute katsed antikehade valmistamiseks viidi läbi vastavalt Shandongi ülikooli maateaduste kooli (SYDWLL-2021-54) loomade hooldamise ja heaolu komitee poolt heaks kiidetud protokollidele. Meie uuringus krevettide kasutamise eeskirjade kohane heakskiit ei olnud vajalik, kuna meie uuringus kasutati piiratud arvu tavalisi krevette, mida laiem kogukond sageli tarbib.

Loomad

Terved krevetid (Marsupenaeus japonicus), igaüks kaaluga umbes 6–10 g, saadi Hiina Shandongi provintsi Qingdao veetoodete turult. Enne katset kultiveeriti krevette vähemalt 1 päev krevetikultuurisüsteemis gaseeritud mereveega temperatuuril 23–25 ˚C, et kohaneda uue keskkonnaga.

Joonis 8. RAB5 ja RAB7 on seotud krevettide hemotsüütide FOXO-vahendatud fagotsütoosiga. (A, B) qPCR-i kasutati Rab5 ja Rab7 mRNA ekspressioonitasemete analüüsimiseks Foxo-knockdown krevettide (A) ja Akt-knockdown krevettide (B) hemotsüütides koos bakteriaalse infektsiooniga ja ilma. qPCR kasutas endogeensete kontrollgeenidena -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist ekspressiooni. (C) RAB5 ja RAB7 valgutasemed Foxo-knockdown krevettide hemotsüütides 2 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist määrati Western blot meetodil. (C') Paneeli (C) kolme korduse andmetel põhinev statistiline analüüs. (D) RAB5 ja RAB7 valgu tasemed Akt-knockdown krevettide hemotsüütides 2 tundi pärast V. anguillarum'iga nakatumist määrati Western blot analüüsiga. (D') Statistiline analüüs, mis põhineb paneeli (D) kolme korduse andmetel.

Bioinformaatiline analüüs

Foxo täispikk cDNA järjestus saadi M. japonicus'e (BGI, Shenzhen, Hiina) hemotsüütide ja soolestiku transkriptsioonitoomide sekveneerimisest. Foxo avatud lugemisraami (ORF) amplifitseeriti, kasutades järjestuse kinnitamiseks praimerite paari (Foxo-EX-F ja Foxo-EX-R; tabel 1). Vastav cDNA transleeriti kontseptuaalselt, et saada tuletatud valgujärjestus, kasutades tööriista ExPASy-Translation (//cn.expasy.org/). Sarnasuse analüüs viidi läbi kasutades BLAST-i (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) ja domeeniarhitektuuri ennustamine viidi läbi SMART-i (http://smart.emblheidelberg.de) abil. Erinevate liikide FOXO-de fülogeneetiline puu konstrueeriti MEGA 6.0 programmi [54] abil.

Joonis 9. RAB5 ja RAB7 paiknevad koos V. anguillarum'iga. RAB5 ja RAB7 kooslokaliseerimine FITC-ga märgistatud-V. anguillarum krevettide hemotsüütides, analüüsituna fluorestseeruva immunotsütokeemilise testiga. Bakterid märgistati FITC-ga (roheline) ja süstiti krevettidesse. Hemotsüüdid koguti viielt krevetilt 30 minutit ja 1 tund pärast bakteri süstimist ja inkubeeriti anti-RAB5 või anti-RAB7 antikehadega. Sekundaarne antikeha oli küülikuvastane IgG Alexa-546 (punane). Tuumad värviti DAPI-ga (sinine). Kaaslokaliseerimine hemotsüütides on näidatud valgete nooltega. Skaalariba=10 μm.

Joonis 10. Skemaatiline esitus FOXO osalemisest krevettide lokaalses ja süsteemses kaasasündinud immuunsuses. (A) Nakatamata tingimustes säilitab FOXO hemolümfi ja soolestiku mikrobiota homöostaasi, edendades Relishi ja seejärel AMP ekspressiooni. ( B ) Nakatunud tingimustes vähendab patogeeni nakatumine AKT fosforüülimist, mille tulemuseks on FOXO sisalduse suurenemine tuumas. FOXO soodustab otseselt Relishi ja AMP-de ekspressiooni, et kõrvaldada invasiivsed patogeenid; teisest küljest soodustab FOXO patogeenide fagotsütoosi SRC-vahendatud fagotsütoosi raja kaudu.

Bakteritega nakatumine ja proovide kogumine

Vibrio anguillarum (ATCC 43305), mis on saadud Shandongi ülikooli merekolledžist (Wei hai, Hiina) ja on nüüdseks säilinud meie laboris. V. anguillarum'i kultiveeriti üleöö temperatuuril 37 ˚C LB söötmes ja uuesti kultiveeriti 4 tundi 1:100 inokulatsiooniga teisel päeval. Logaritmilises kasvufaasis olevad bakterid koguti tsentrifuugimisega 5000 x g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C ja pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl ja 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4). V. anguillarum resuspendeeriti fosfaatpuhverdatud soolalahuses krevettide nakatamiseks. Ligikaudu 2 × 107 kolooniat moodustavat ühikut (CFU) / krevetid süstiti mikrosüstla abil iga kreveti kõhtu. Kontrollrühmale süstiti sama kogus PBS-i. Hemotsüüdid, süda, hepatopankreas, lõpused, magu ja sooled koguti RNA ja valkude ekstraheerimiseks vähemalt kolmelt krevetilt. Hemotsüütide kogumiseks ekstraheeriti hemolümf ventraalsest siinusest 0,8 ml antikoagulandipuhvriga (10% naatriumtsitraat) eellaaditud süstlaga ja seejärel tsentrifuugiti kiiresti 700 × g juures 8 minutit 4 °C juures hemotsüütide eraldamiseks.

RNA ja valgu ekstraheerimine ning cDNA süntees

Kogu RNA ekstraheeriti krevettide hemotsüütidest ja erinevatest organitest, kasutades TRIzoli (ET101, Transgen, Peking, Hiina). Erinevate elundite valgud ekstraheeriti radioimmunosadestamise testi (RIPA) lüüsipuhvriga (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Hiina). Esimese ahela cDNA süntees viidi läbi, kasutades cDNA sünteesikomplekti (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), järgides tootja juhiseid.

Tabel 1. Selles uuringus kasutatud praimerite järjestused.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), järgides tootja juhiseid.

Rekombinantne ekspressioon ja antikehade valmistamine

Foxo cDNA järjestust amplifitseeriti pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) abil, kasutades praimereid Foxo-EX-F ja Foxo-EX-R (tabel 1). Puhastatud PCR produktid lõigati seejärel restriktsiooniensüümidega ja ligeeriti plasmiidi pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). ja konstrueeritud plasmiidid transformeeriti Escher ichia coli Rosseta (DE3) rakkudesse. Valgu ekspressioon indutseeriti 1 mM isopropüül- - D-tio-galaktopüranosiidiga temperatuuril 37 ˚C. Rekombinantsed valgud allutati afiinsuskromatograafiale, kasutades glutatiooni (GST) vaiku (C600031, BBI, Shanghai, Hiina), järgides tootja juhiseid. Küüliku FOXO-vastased antiseerumid valmistati vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile [55].

Lääne blotting

Erinevatest elunditest või hemotsüütidest ekstraheeritud valgud eraldati 10% naatriumdodetsüülsulfaadi polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE) abil. SDS-PAGE geelides olevad valgud kanti tselluloosnitraatmembraanile, kasutades ülekandepuhvrit (25 mM Tris-HCl, 20 mM glütsiini, 0,037% mM SDS ja 20% etanooli). ja inkubeeriti 5% kooritud piimas või 3% veise seerumi albumiinis (BSA) Tris-puhverdatud soolalahuses (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) 1 tund toatemperatuuril õrnalt loksutades. Seejärel inkubeeriti membraane primaarse antiseerumiga: Anti-FOXO lahjenduses 1:100, anti-RAB5 1:25, anti-Rab7 1:25, anti-beeta-aktiini (ACTB) 1:250 (valmistatud meie laboris ); Histooni -3 polüklonaalsed antikehad (A2348, ABclonal, Wuhan, Hiina, 1:2500); anti-fosforüülitud (p)-AKT polüklonaalsed antikehad (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Hiina, 1:500) ja loksutatakse õrnalt üle öö temperatuuril 4 °C. Pärast kolmekordset pesemist TBST-ga (TBS-ile lisati 0,1% Tween-20) inkubeeriti membraane sekundaarse antikehaga (ZB2308 ZSGB-Bio, Peking, Hiina, 1:5,000) või ( ZB2301 ZSGB-Bio, Peking, Hiina, 1:5, 000) 3 tundi toatemperatuuril õrnalt loksutades. Immunoreaktiivsed valguribad töötati välja nitrotetrasooliumsinise kloriidi (A610379, BBI) ja P-toluidiini soola (A610072, BBI) lahuse abil pimedates tingimustes või täiustatud kemoluminestsentsi (ECL) abil. -aktiini või histooni-3 kasutati viitenas.

Bakterite poolt nakatatud krevettide kudede jaotus ja ekspressioonimustrid

Foxo/FOXO kudede jaotumist hemotsüütides, südames, lõpustes, rögas, maos ja sooltes analüüsiti, kasutades RT-PCR-i praimeritega Foxo-F ja Foxo-R (tabel 1) ning Western blot analüüsi FOXO-vastaste antikehadega. vastavalt. PCR protseduur koosnes esialgsest inkubeerimisest 94 °C juures 3 minutit; millele järgneb 35 tsüklit temperatuuril 94 ˚C 30 s, 50 ˚C 30 s ja 72 ˚C 30 s; seejärel 72˚C 10 minutit. PCR-produkte analüüsiti agaroosgeelelektroforeesiga (1,5% agaroosi). Sisekontrollina kasutati -aktiini geeni (-aktiini-F ja -aktiin-R; tabel 1). Foxo/FOXO ekspressioonimustreid aja jooksul RNA ja valgu tasemel V. anguillarum'iga nakatatud krevettide puhul analüüsiti, kasutades kvantitatiivset reaalajas PCR-i (qPCR) termotsükleris (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Saksamaa) ja vastavalt west ern blotting. qPCR protseduur hõlmas: 95˚C 10 min; 40 tsüklit temperatuuril 95 ˚C 10 s ja 60 ˚C 50 s; ja seejärel sulamisperiood 65 ˚C kuni 95 ˚C. Foxo ekspressiooniprofailid valmistati 2-ΔΔCT meetodil [56], kasutades normaliseerimiseks kahe sisemise kontrollgeeni -aktiini ja Ef-1 geomeetrilist keskmist. Praimeripaari efektiivsust qPCR-is analüüsiti MIQE meetodil [57], kasutades cDNA segu 10--kordset logaritmilist lahjendust, et saada lineaarne standardkõver.

Tuuma- ja tsütoplasmaatiliste valkude eraldamine

Soolekude lõigati krevettidelt lahti ja pesti kolm korda PBS-is. Valgu ekstraheerimine viidi läbi tuuma- ja tsütoplasmaatilise valgu ekstraheerimise komplekti (R0050, Solarbio, Peking, Hiina) abil, järgides tootja juhiseid. Valgu ekstraheerimiseks kasutati vähemalt kolme krevetti, et kõrvaldada individuaalsed erinevused.

RNA interferentsi test

Geeni funktsiooni analüüsimiseks viisime läbi RNA interferentsi (RNAi) analüüsid. Mitu praimerite paari, mis sisaldavad T7 promootori järjestust (Foxo-RI-F ja Foxo-RI-R; Rab5-RI-F ja Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F ja Rab7 -RI-R; Akt-RI-F ja Akt-RI-R. Tabel 1) kavandati dsRNA sünteesi matriitsi amplifitseerimiseks. Kasutades T7 RNA polümeraasi (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja cDNA matriitsi, sünteesisime dsRNA fragmendid. Kaheahelaline roheline fluorestseeruv valk dsGfp RNA toimis kontrollina, mida amplifitseeriti, kasutades dsGfp sünteesi praimeritena Gfp-RI-F ja Gfp-RI-R (tabel 1). Seejärel süstiti dsRNA fragmendid (50 ug/igaüks) mikrosüstlaga M. japonicuse kõhu segmenti ja 12 tundi hiljem tehti teine ​​süst, kasutades sama annust. RNA interferentsi efektiivsust analüüsiti, kasutades kvantitatiivset reaalajas pöördtranskriptsiooni PCR-i (qRT-PCR, mis sisaldab RNA pöördtranskriptsiooni cDNA moodustamiseks, mida seejärel kasutati matriitsina qPCR testis) või Western blot analüüsi 24 tundi pärast teist süstimist. -aktiini kasutati sisemise võrdlusalusena.

Viited

1. Calnan DR, Brunet A. FoxO kood. Onkogeen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS jt. DNA parandamise rada, mida stimuleerib kahvlipea transkriptsioonifaktor FOXO3a läbi Gadd45 valgu. Teadus. 2002; 296 (5567): 530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Elagu FOXO: FOXO valkude rolli selgitamine vananemises ja pikaealisuses. Vananev rakk. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. FOXO valkude kolmekihiline kontroll-fosforüülimine, atsetüülimine ja ubikvitineerimine. Lahtri tsükkel. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. FoxO transkriptsioonifaktorite reguleerimine atsetüülimise ja proteiin-valgu interaktsioonide abil. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO transkriptsioonifaktorid: nende kliiniline tähtsus ja regulatsioon. Biomed Res Int. 2014; 2014: 1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J jt. Geenid, mis toimivad DAF-ist allavoolu{1}}, et mõjutada Caenorhabditis elegans'i eluiga. Loodus. 2003; 424(6946):277–284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insuliin/IGF-1R, SIRT1 ja FOXO-teed – intrigeeriv interaktsiooniplatvorm luude ja osteosarkoomi jaoks. Eesmine Endokrinool (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS jt. Akt soodustab rakkude ellujäämist, fosforüülides ja inhibeerides kahvlipea transkriptsioonifaktorit. Kamber. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA jt. Skp2 inhibeerib FOX01 kasvaja supressioonis ubikvitiini poolt vahendatud lagunemise kaudu. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649–1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA jt. Kahvlipea transkriptsioonifaktor DAF-16 edastab C. elegansis insuliinitaolisi metaboolseid ja pikaealisuse signaale. Loodus. 1997; 389 (6654): 994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinal FoxO signaling is required to sur vive oralinfektsioon in Drosophila. Limaskestade immunool. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO reguleerib RNA häireid Drosophilas ja kaitseb RNA viirusnakkuse eest. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 soodustab soolestiku immuunsüsteemi homöostaasi, et piirata kommensal düsbioosi ja pikendada eluiga. Kamber. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P jt. Kaasasündinud immuunhomöostaasi FOXO-sõltuv reguleerimine. Loodus. 2010; 463 (7279): 369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M jt. FOXO transkriptsioonifaktorid reguleerivad kaasasündinud immuunmehhanisme hingamisteede epiteelirakkudes. J Immunol. 2013; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. Limaskesta immuunsus ja FOXO1 transkriptsioonifaktorid. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Antimikroobsed peptiidid: selgrootutest selgroogseteni. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.{8}}.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Drosophila melanogasteri immuunsus – mikroobide äratundmisest kogu organismi füsioloogiani. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Drosophila kaasasündinud immuunsus: evolutsiooniline perspektiiv. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Drosophila immuunsus: rajad ja mustrid. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Hiljutised edusammud krevettide kaasasündinud immuunsuse uuringutes Hiinas. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. C-tüüpi lektiini spiraaldomeeni sidumine kuplita retseptoriga aktiveerib krevettide immuunvastuses bakteriaalsele infektsioonile otseselt JAK/STAT raja. PLoS patog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Fagotsütoos: immunobioloogiline protsess. Immuunsus. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ jt. FoxO1-vahendatud autofagia on vajalik NK-rakkude arenguks ja kaasasündinud immuunsuseks. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J jt. FOXO1 reguleerib bakterite poolt indutseeritud neutrofiilide aktiivsust. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. C-tüüpi lektiin seondub beeta-Integriiniga, et soodustada selgrootute hemotsüütilise fagotsütoosi teket. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Krevettide enesekaitse õpetamine infektsioonide vastu võitlemiseks. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Krevettide patogeenide ajalooline tekkimine, mõju ja praegune staatus Aasias. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Krevettide viirusevastane kaitse: kaasasündinud immuunsusest viirusnakkuseni. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. FOXO transkriptsioonifaktorite regulatsiooni aluseks olevad struktuuri/funktsiooni seosed. Onkogeen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.