Farnesüültransferaasi inhibiitor LNK{0}} nõrgendab aksonaalset düstroofiat ja vähendab amüloidpatoloogiat hiirtel, 3. osa

Tulemused

Vähenenud amüloidnaastude koormus ja tau hüperfosforüülimine LNK-754-ga krooniliselt ravitud 5XFAD hiirte ajus

LNK-754 ja lonafarniib on väikese molekuliga FTI-d, mida on varem inimestel vähi kliinilistes uuringutes testitud ja mis teadaolevalt läbivad hematoentsefaalbarjääri [8, 9, 41, 42]. -sünukleiini [8] ja tau inklusioone [9] vähendavad vastavalt LNK-754 ja lonafarniib, kuid neid ei ole veel hinnatud AD amüloidfenotüübi suhtes. Selles uuringus uurisime nende mõju amüloidpatoloogiale 5XFAD hiiremudelis. 5XFAD hiirtel tekivad A ladestused alates 2 kuu vanusest [36, 37] ja düstroofseid neuriite täheldatakse amüloidi ladestumise varases staadiumis [39, 43].

Hematoentsefaalbarjäär ja immuunsus on inimkeha kaks väga olulist osa ning need on omavahel lahutamatult seotud. Hematoentsefaalbarjäär on kaitsebarjäär aju ja vere vahel, mis kaitseb aju väljast tulevate kahjulike ainete eest. Immuunsus on inimkeha oluline mehhanism haigustele vastu seista. Niisiis, milline on konkreetne seos vere-aju barjääri ja immuunsuse vahel?

Esiteks võib hematoentsefaalbarjäär takistada mõnede kahjulike bakterite ja viiruste sisenemist ajju, kaitstes seeläbi aju kahjustuste eest. Lisaks suudab hematoentsefaalbarjäär kontrollida ka teatud ainete läbilaskvust, võimaldades neil ajju siseneda vaid piiratud ulatuses. See on närvisüsteemi tervise kaitsmiseks kriitilise tähtsusega, kuna ajju sisenev liiga palju teatud sisemisi aineid võib põhjustada närvirakkude kahjustusi.

Samas võib immuunsus mängida rolli ka aju kaitsmisel. Inimkeha immuunsüsteem suudab ära tunda patogeenid ja kahjulikud ained ning seejärel toota vastavaid antikehi, et seista vastu nende sissetungile, kaitstes seeläbi organismi haiguste eest. Kui aga teatud patogeenid või ained läbivad hematoentsefaalbarjääri ja satuvad ajju, reageerib immuunsüsteem kiiresti ja toodab antikehi nende ründamiseks ja kõrvaldamiseks.

Seetõttu on hematoentsefaalbarjääril ja immuunsusel inimese tervise hoidmisel väga oluline roll. Hematoentsefaalbarjäär takistab kahjulike ainete sattumist ajju, immuunsus aga eemaldab patogeenid ja muud kahjulikud ained, mis läbivad hematoentsefaalbarjääri ja satuvad ajju. Need kaks töötavad koos, et tagada aju tervislik toimimine.

Kokkuvõtteks võib öelda, et hematoentsefaalbarjäär ja immuunsus teevad oma vastavate mehhanismide kaudu koostööd, et mängida inimeste tervises olulist rolli. Peaksime keskenduma nende tervise kaitsmisele, et tagada keha üldine tervis. On näha, et me peame oma mälu parandama. Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Hakkliha tõhusus tuleneb paljudest selles sisalduvatest toimeainetest, sealhulgas hapetest, polüsahhariididest, flavonoididest jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Mälu parandamiseks klõpsake teadmise lisandeid

Seetõttu, et langeda kokku amüloidpatoloogia arenguga 5XFAD hiirtel, ravisime hiiri krooniliselt 3 kuud vehiikuliga LNK-754 ja lonafarniibiga, alates 2 kuu vanusest. LNK-754 ja lonafarniib lahustati 0,5% naatriumkarboksümetüültselluloosi vehiikulis ja ip süstiti iga päev annusega 1 mg/kg [8, 44].

Esmalt püüdsime määrata kroonilise LNK-754 ja lonafarniibiga ravi mõju A naastukoormusele 5XFAD hiirtel immunofluorestsentsmikroskoopia abil A 42 jaoks, mis tuvastab nii difuusse kui ka agregeeritud amüloidi ja tiasiinpunase (TR), mis tuvastab ainult fibrillaarse naastu. südamikud (joon. 1A; joon. S1). Leidsime LNK754--ga töödeldud hiirte kortikaalsetes ajupiirkondades kaetud ala olulise vähenemise võrreldes kandjaga töödeldud kontrollidega (joonis 1B). Hippokampuses oli LNK{8}}-ga ravitud hiirte kaetud ala oluliselt vähenenud võrreldes lonafarniibiga ravitud hiirtega ning LNK{10}}-ga ravitud hiirte arv vähenes võrreldes vehiikliga ravitud hiirtega (joonis 1). 1C).

Lonafarniibiga ravitud hiirte 42-kraadine kaetud ala ei erinenud oluliselt kandjaga töödeldud hiirtest ei ajukoores ega hipokampuses (joonis 1A, B). LNK-754-ravi tõttu vähenes naastude suurus kortikaalsetes ja hipokampuse ajupiirkondades võrreldes kandjaraviga; see erinevus oli statistiliselt oluline hipokampuses (joonis 1D, E; joonis S2A, B). Olulist erinevust naastude suuruses lonafarniibi ja LNK{7}}-ravi vahel täheldati ka hipokampuses (joonis 1D, E; joonis S2A, B).

Naastu suurus ei muutunud lonafarniibiga ravitud hiirtel võrreldes kandjaga töödeldud hiirtega kortikaalsetes või hipokampuse ajupiirkondades (joonis 1D, E; joonis S2A, B). Naastude külvamine kvantifitseeriti, analüüsides naastude arvu TR-värvimisega. Naastude arv vähenes oluliselt LNK-754 ajukoores, kuid mitte hipokampuses, võrreldes kandjaga töödeldud hiirtega (joonis S2C, D). Naastukoormuse vähenemist kinnitati A42 mõõtmisega ELISA abil PBS-is ja guanidiinis lahustuvates hemiajuhomogenaatides (joonis 1F, G). Sarnaselt meie immunofluorestsentsmikroskoopia tulemustele ilmnes lonafarniibiga ravitud hiirtel guanidiini ja PBS-i fraktsioonide A 42 vähenemise suundumus, samas kui LNK-754-raviga saavutati oluliselt madalam A 42 tase guanidiini fraktsioonides (joonis 1). 1. F, G).

Kuna 5XFAD hiiremudelis on teatatud soopõhistest mõjudest APP püsiseisundi tasemete ja naastude koormuse kohta [45, 46], teostasime isas- ja emashiirtel immunoblotanalüüsid eraldi, mida raviti vehiikuliga, LNK-754 või lonafarnibiga. transgeense APP ekspressiooni jaoks (joonis S3A). Transgeensete APP tasemeid mõõdeti immunoblotiga APP 6E10 antikehaga, mis tunneb ära ainult inimese APP, ja see ei muutunud isas- ja emasloomadel, keda raviti LNK-754, lonafarniibi või kandjaga (joonis S3B-D). Teine AD määrav tunnus on hüperfosforüülitud tau inklusioonide olemasolu ajus ja koos naastude ladestumisega on endogeenne hiire tau hüperfosforüülitud 5XFAD hiirtel [47, 48].

Et teha kindlaks, kas tau hüperfosforüülimist mõjutas FTI-ravi amüloidhiire mudelis, viidi läbi immunoblotanalüüs fosfo-tau jaoks seriinil 404 (joonis 1H; joonis S3E), epitoobile, mis teadaolevalt on hüperfosforüülitud AD ajus ja 5XFAD hiirtes [ 47, 49]. Siin leidsime lonafarniibi ja LNK{9}}-ga ravitud hiirte ajus vähenenud fosfo-tau ser404 tasemed (joonis 1I), samas kui tau kogutase jäi muutumatuks (joonis 1J; joonis S3F). Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et amüloidnaastude koormus ja patogeense tau fosforüülimine vähenevad 5XFAD hiiremudelis FTI-dega farmakoloogilise ravi tõttu, kuigi ravi LNK-754 oli tunduvalt tugevam kui lonafarniibiga.

Krooniline ravi LNK-754-ga pärsib valgu farnesüülimist 5XFAD hiirte ajus

Kinnitamaks, et FTaasi sihtimine LNK{0}} ja lonafarniibiga ip süstimise teel inhibeeris valgu farnesüülimist 5XFAD hiirte ajus, hindasime erinevaid FTaasi substraate ja FTaasi inhibeerimise allavoolu markereid 5XFAD hiirte hemiaju homogenaatides, keda raviti krooniliselt vehiikuliga LNK. -754 või lonafarniib immunoblotanalüüsiga. Esmalt analüüsisime prelamiini A, mis akumuleerub FTaasi inhibeerimisel [50]. LNK-754-ga ravitud hiirte ajus täheldati prelamiini A sisalduse suurenemist võrreldes kandjaga, samas kui lonafarniibiga ravitud hiirtel muutusi ei toimunud (joonis S4A, D). Järgmisena vaatlesime HDJ-2, chaperone valku, mille liikuvus muutub pärast FTI-ravi ülespoole ja mida kasutatakse laialdaselt FTaasi inhibeerimise markerina [50]. Kooskõlas prelamiiniga A esines LNK-754-ravitud hiirtel HDJ{10}} aeglasemalt migreeruv vorm, kuid mitte lonafarniibiga ravitud hiirtel (joonis S4B, E). LNK754 hiirtel leiti HDJ-2 aeglasemalt rändavate liikide märkimisväärne suurenemine võrreldes kandja või lonafarniibiga töödeldud hiirtega (joonis S4E).

Lisaks aktiveerib farnesüülimine Ras-i, nii et mõõdeti ka selle allavoolu efektormolekuli ERK1 (P44/P42) fosforüülimist (joonis S4C). Kui HDJ-2 ja prelamiini A ei muutunud lonafarniibravi ajal, täheldati pERK1 vähenemise suundumust (joonis S4F). pERK1 vähenes ka LNK-754-ga ravitud hiirtel (joonis S4F). Meie tulemused näitavad, et 1 mg/kg LNK-754 inhibeeris ajus FTaasi, kuid lonafarniib oli vähem efektiivne. See võib olla tingitud lonafarniibi madalamast tõhususest ja IC50-st, nagu on näidatud varem [41, 51], või võib-olla vähenenud aju kokkupuutest.

LAMP1 akumulatsiooni vähenemine düstroofilistes neuriitides LNK-754 krooniliselt ravitud 5XFAD hiirtel

Tervetes neuronites viiakse lüsosomaalsed komponendid endosoomidesse ja autofaagilistesse organellidesse distaalsetes neuriitides, mis hapestuvad ja küpsevad tagasisuunalise liikumise käigus neuronaalse sooma suunas [52, 53]. Amüloidnaastud häirivad seda protsessi, mille tulemuseks on düstroofsed neuriidid, mis haaravad kinni düsfunktsionaalsed autofagilised ja endolüsosomaalsed organellid.

Düstroofsed neuriidid blokeerivad BACE1 aksonaalset transporti, põhjustades düstroofsete neuriitide A põlvkonna ja rakuvälise naastu ladestumist [16–18]. On teada, et FTI-d suurendavad lüsosomaalset funktsiooni ja mikrotuubulite stabiilsust, nii et edasiseks uurimiseks, kuidas FTI-d vähendavad naastude koormust, keskendusime konkreetselt düstroofsetele neuriitidele 5XFAD hiirtel.

Düstroofsete neuriitide kuhjumise kvantifitseerimiseks naastude ümber hindasime lüsosoomiga seotud membraanivalku 1 (LAMP1), mis on heterogeensete endolüsosomaalsete ja autofaagiliste organellide marker. Vehiikli, LNK-754 ja lonafarniibiga töödeldud 5XFAD hiirte hipokampuse ja kortikaalsed ajukoed värviti koos LAMP1 ja A 42 suhtes ning viidi läbi konfokaalne immunofluorestsentsmikroskoopia (joonis 2A, B).
Düstroofsete neuriitide spetsiifiliseks analüüsimiseks määrati lävi, et kõrvaldada LAMP1 fluorestsentssignaalid tervete neuriitide ja somade vesiikulitest. LAMP1-ga kaetud pindala vähenes oluliselt LNK-754-ga ravitud hiirte kortikaalsetes ja hipokampuse ajupiirkondades (joonis 2C, D), samas kui lonafarniibiga ravitud hiirtel ei täheldatud erinevusi võrreldes vehiikuliga ravitud hiirtega (joonis 2C, D). . Amüloidnaastude ladestumine käivitab düstroofiate arengu lähedalasuvates neuriitides, peamiselt aksonites ja presünaptilistes terminalides.

Vastavalt sellele on LNK-754 ja lonafarniibi toime düstroofsetele neuriitidele kooskõlas nende mõjuga naastukoormusele (joonis 1). Täiendav analüüs FTI-ravi mõju kohta düstroofsetele neuriitidele viidi läbi, kvantifitseerides LAMP1 kaetud ala ja A 42 piirkonna suhte, et teha kindlaks, kas FTI-d piiravad düstroofia suurust naastude ümber. LAMP1:A 42 suhte vähenemist täheldati LNK-754-ga ravitud hiirtel võrreldes vehiikliga hiirtega ning ravi LNK-754 ja lonafarniibiga olid oluliselt erinevad (joonised 2E, F), mis näitab, et LNK -754 hiired, kellel on vähem düstroofseid neuriite.
LAMP1 kõrgenenud tase leiti kas LNK-754 või lonafarniibiga ravitud hiirte hemiaju homogenaatides (joonis S5A, B), mis on kooskõlas varasemate uuringutega, mis näitavad, et lonafarniib ja LNK-754 suurendavad autolüsosoomide arvu ja lüsosomaalsete membraanide valkude ja hüdrolaaside tase [8, 9]. Kooskõlas LAMP1 immunoblotanalüüsi tulemustega (joonis S5A, B) suurenes LAMP1 kogu immunovärvimise keskmine fluorestsentsi intensiivsus oluliselt LNK-754 ja lonafarniibiga töödeldud hiirte ajus, võrreldes vehiikuliga töödeldud hiirtega (joonis fig. S5C, D).

Erinevalt LAMP1 fluorestsentsi kogutasemest ei muutunud keskmine LAMP1 fluorestsentsi intensiivsus düstroofsete neuriitide puhul kandja, LNK-754 ja lonafarniibiga töödeldud hiirte vahel (joonis S5E, F). LNK-754-ga ravitud hiirte ajukoores oli LAMP1 fluorestsentsi intensiivsus düstroofiate ja naastude korral tugevas korrelatsioonis, samas kui LAMP1 intensiivsuse düstroofia ja naastu koormuse vahel ei leitud lonafarniibi või kandjaga töödeldud hiirtel (joonis 2G, H), mis paljastab seose düstroofse neuriitide LAMP1 akumulatsiooni ja naastude vahel LNK-754 hiirtel. Hipokampuses täheldati suundumust korrelatsiooni poole düstroofiate LAMP1 intensiivsuse ja naastude koormuse vahel. Üheskoos näitavad meie tulemused, et ravi LNK-754 suurendab LAMP1 kogutaset, kuid nõrgendab LAMP1 patoloogilist kuhjumist düstroofilistes neuriitides, mis tavaliselt esinevad 5XFAD hiirtel.

Vähenenud BACE1 akumuleerumine düstroofilistes neuriitides LNK-754 krooniliselt ravitud 5XFAD hiirtel

LAMP1 leidub endolüsosomaalsete organellide membraanidel, mis on suunatud aksonaalse BACE1 lagunemisele küpsetele lüsosoomidele. Seetõttu võivad FTI-d pärssida A-generatsiooni ja ekstratsellulaarse naastu ladestumist, vähendades aksonaalse düstroofia moodustumist ja BACE1 akumuleerumist naastude ümber. Selle hüpoteesi toetuseks oli düstroofse neuriitide LAMP1 tase ja naastude koormus LNK-754 hiirte kortikaalsetes ajupiirkondades tugevas korrelatsioonis.

Meie LAMP1 immunovärvimise analüüs näitas, et võrreldes kandja- või lonafarniibraviga seostati LNK-754-ga ravitud 5XFAD-hiirte naastud vähema düstroofsete neuriitidega (joonis 2). Et teha kindlaks, kas BACE1 tase düstroofsetes neuriitides langes sarnaselt naastu kohta, teostasime lisaks LAMP1-le ja A 42-le ka BACE1, LNK-754 ja lonafarniibiga ravitud hiirte kortikaalsete ja hipokampuse ajukudede konfokaalse immunofluorestsentsmikroskoopia. (Joon. 3A, B).

Siin vähenes BACE1-ga kaetud ala oluliselt LNK-754-ga ravitud hiirte kortikaalsetes ajupiirkondades ja lonafarniibiga ravitud hiirtel täheldati suundumust (joonis 3C). Hippokampuse düstroofsete neuriitide BACE1-ga kaetud ala analüüsi takistas BACE1 kõrge ekspressioonitase CA3 hipokampuse samblakiudude raja presünaptilistes otstes [17]. Lisaks analüüsisime, kas düstroofsete neuriitide puhul lokaliseeriti vähem BACE1 endolüsosoomidesse, mõõtes Pearsoni korrelatsioonikoefitsienti BACE1 ja LAMP1 jaoks düstroofia korral. LNK{14}}-ga töödeldud hiirtel leiti BACE1 ja LAMP1 kaaslokaliseerumise märkimisväärne vähenemine naastu kohta ajukoore piirkondades võrreldes kandjaga raviga (joonis 3D).

Hipokampuses leiti LNK-754 BACE1 ja LAMP1 kooslokaliseerumise märkimisväärne vähenemine naastu kohta võrreldes lonafarniibiga ning LNK-754-ravi puhul täheldati langustrendi võrreldes vehiikuliga (joonis 1). 3E). Need tulemused on kooskõlas meie leidudega naastude koormuse ja LAMP1-ga kaetud ala kohta ning toetavad veelgi ideed, et LNK-754-ravi nõrgendas düstroofsete neuriitide moodustumist, vähendades kahjustatud endolüsosomaalsete organellide kogunemist, mis on suunatud BACE1 lagunemisele.

Akuutne ravi LNK-754-ga vähendab hilist endosoomi ja lüsosoomi akumulatsiooni düstroofilistes neuriitides 5XFAD hiirte elusaju viiludes

Järgmisena testisime LNK{0}} ja lonafarniibi ägedat mõju düstroofsetele neuriitidele, teostades elusate ajukudede konfokaalset kujutist. Selles katses süstiti 5-kuustele 5XFAD hiirtele iga päev 3 nädala jooksul vehiikulit, LNK-d-754 või lonafarniibi. Värvisime kudesid LysoTracker-Greeniga (LT), sondiga, mida tavaliselt kasutatakse elusrakkudes hapendatud hiliste endosoomide ja lüsosoomide jälgimiseks ja selektiivseks tuvastamiseks [53]. LT ja tiasiinpunase värvumise muster oli kooskõlas meie immunovärvimise tulemustega düstroofsete neuriitide markerite kohta 5XFAD hiirtel (joonis 2A, B; joonis 3A, B); LT-positiivsed hilised endosoomid ja lüsosoomid olid tugevalt kontsentreeritud düstroofsetes neuriitides, mis olid tihedalt seotud amüloidnaastudega elusates ajukoes (joonis 4A).

Akuutne 3-nädalane 5-kuuste 5XFAD hiirte ravi LNK-754 või lonafarniibiga ei olnud naastu suuruse vähendamiseks piisav (joonis 4B), kuigi ravi LNK-754 põhjustas LT:TR suhte oluline vähenemine naastu ja düstroofse neuriidi suuruse kohta (joonis 4C, D). Huvitav on see, et erinevalt meie leidudest LAMP1 või BACE1 kohta vähendas äge lonafarniibravi ka düstroofia suurust ja LT:TR suhet naastu kohta (joonis 4C, D). Düstroofsete neuriitide suurus ja naastude suurus korreleerusid tugevalt LNK-754-ga ravitud 5XFAD hiirtel (joonis 4F) ning olulist korrelatsiooni täheldati ka lonafarniibiga ravitud hiirtel (joonis 4G). Vehiikliga töödeldud hiirtel korrelatsiooni ei esinenud (joonis 4E). Meie tulemused kinnitavad, et LNK-754 vähendas aksonite düstroofiat ja viitab sellele, et FTI-d võivad nõrgendada endosoomide ja lüsosoomide hilist akumulatsiooni naastude ümber isegi pärast ulatuslikku naastude ladestumist ja aksonite degeneratsiooni.

Õppimis- ja mälupuudulikkuse paranemine hAPP/PS1 hiirtel pärast lühiajalist ravi LNK-754-ga

LNK-754 hoidis ära LAMP1, BACE1 ja LT kuhjumise düstroofilistes neuriitides 5XFAD hiirtel, mis viitab sellele, et ravi LNK-754 kaitseb A-ga seotud sünaptilise düsfunktsiooni eest. Et hinnata, kas LNK-754-ravil oli kasulik mõju kognitiivsele funktsioonile, hindasime hAPP/PS1 AD hiiremudelis suukaudse LNK-754-ravi lühiajalist efektiivsust ruumilisele õppimisele ja mälule [40] . Morrise veelabürindi (MWM) hinnangul paranes hAPP/PS1 hiirte ruumimälu pärast 12-päevast suukaudset ravi LNK-754-ga.

Varjatud platvormi treeningute käigus õppisid LNK{0}}-ga ravitud hAPP/PS1 hiired platvormi leidma kiiremini kui sõidukiga töödeldud hAPP/PS1 hiired, mille tulemuseks oli õppimiskõver, mis erineb oluliselt sõidukiga töödeldud hAPP-i omast. /PS1 kontrollhiired (joonis 5A). Vehiikliga töödeldud hAPP/PS1 hiirtel kulus platvormi asukoha leidmiseks oluliselt rohkem aega võrreldes vehiikuliga töödeldud metsiktüüpi kontrollidega treeningkatsete 4. ja 7. päeval, samas kui LNK-754-ga ravitud hAPP/ vahel olulisi erinevusi ei leitud. PS1 hiired ja kandjaga töödeldud metsiktüüpi hiired (joonised 5A-C).

Sondikatse ajal näitasid LNK{0}}ravitud hAPP/PS1 loomad sihtkvadrandis veedetud aega (joonis 5D) ja platvormide ületamise sagedust (joonis 5E), mis on võrreldav sõidukiga ravitud metsiktüüpi loomadega. . A 42 taset mõõdeti ELISA abil ja need ei muutunud lahustuvates ja lahustumatutes ajuhomogenaatides, mis pärinevad vehiikuliga või LNK{8}}-ga töödeldud hAPP/PS1 hiirtest (joonis 5F, G), mis viitab sellele, et paranenud mälu ja ruumiõpe ei olnud LNK{11}}-ga ravitud hAPP/PS1 hiirte amüloidikoormuse vähenemise tulemus.

For more information:1950477648nn@gmail.com