Neuronaalse lämmastikoksiidi süntaasi ja reniini ekspressioon noorte koerte düsplastilistes neerudes

ABSTRAKTNE:

Reniin ja neuronaalne lämmastikoksiidi süntaas neerudes kontrollivad reniin-angiotensiini ja tubuloglomerulaarseid tagasisidesüsteeme. Käesolevas uuringus uuriti reniini ja neuronaalse lämmastikoksiidi süntaasi ekspressioonidüsplastilised neerudkolmest noorest koerast. Reniini-immunoreaktiivsus, mis esineb jukstaglomerulaarsetes ja tubulaarsetes rakkudesdüsplastilised neerud, ei erinenud noorte koerte normaalsete neerude omast. Normaalsete neerude makula densa rakud näitasid neuronaalset lämmastikoksiidi süntaasi immunoreaktiivsust, kuid düsplastiliste neerude rakud ei näidanud ilmseid signaale. See tähelepanek võib olla korrelatsioonis patoloogiliste mehhanismideganeerupuudulikkusnoortel koertel.

MÄRKSÕNAD: krooniline neeruhaigus, düsplastiline neer, immunohistokeemia, neuronaalne lämmastikoksiidi süntaas, reniin

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche neerufunktsiooni parandamiseks

Neerupuudulikkusesineb aeg-ajalt noortel koertel. Sellistel juhtudel näitab histoloogiline uuring sagelidüsplastiline neerkahjustused. Kuid patofüsioloogilised mehhanismid, mis esinevaddüsplastilised neerudkoerte kohta jääb selgusetuks. Hiljuti demonstreerisime tsüklooksügenaasi (COX)-2 nõrgenemistkroonilised neeruhaigusednoortel koerteldüsplastilised neerudkasutades immunohistokeemilist analüüsi [19].

COX-2 on indutseeritav põletikuline ensüüm, mis on oluline neerude normaalseks arenguks loote ja vastsündinu staadiumis [12, 15]. Pärast sündi ekspresseerub COX-2 konstitutiivselt neerudes ja koondub jämedate tõusvate jäsemete makula densa (MD) piiratud piirkonda [1, 4, 22]. MD on spetsialiseerunud piirkond, mis asub glomeruluse vaskulaarse pooluse kõrval. See kontrollib reniini sekretsiooni ja tubuloglomerulaarse tagasiside (TGF) süsteemi. MD-rakkudes ekspresseeritud COX-2 reguleerib neid mehhanisme [6, 8]. Lisaks COX-2-le on TGF-süsteemi peamiseks regulaatoriks teadaolevalt neuronaalne lämmastikoksiidi süntaas (nNOS), mida ekspresseeritakse ka MD-rakkudes [3, 18]. Need kaks molekuli, mida MD-s koos ekspresseeritakse, interakteeruvad teadaolevalt üksteisega [2, 5, 9]. Käesolevas uuringus uurisime reniini ja nNOS-i ekspressioonidüsplastilised neerudimmunohistokeemia abil, et teha kindlaks, kas COX{0}} nõrgeneminedüsplastilised neerudindutseerib noortel koertel reniin-angiotensiini süsteemi ja TGF süsteemi häireid.

Formaliiniga fikseeritud parafiiniplokiddüsplastilised neerudnoorte koerte (n{{{{10}}}}), normaalsed neerud noortel koertel (n=3) ja normaalsed neerud täiskasvanud koertel (n=4) samad, mida kasutati meie eelmises uuringus, kus kliinilist ajalugu ja koepreparaati on eelnevalt kirjeldatud [19]. Uuringu kiitis heaks Jaapani Kagoshima ülikooli loomkatsete komitee (VM15020). Valmistati lõigud paksusega 3-µm ning reniini ja nNOS-i immunohistokeemiline analüüs viidi läbi vastavalt järgmistele protokollidele: (1) deparafineerimine; (2) nNOS-i antigeeni otsimine mikrolaineahjus kuumutamisel 10 mM tsitraatpuhvris (pH 6,0); (3) inkubeerimine 3% H202-ga 30 minutit; (4) 30 minuti jooksul blokeerimine 3-protsendilise veise seerumi albumiiniga (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) reniini või 0,25-protsendilise kaseiiniga (Sigma-Aldrich) nNOS-i jaoks, lahjendatud fosfaatpuhverdatud soolalahusega; (5) inkubeerimine üleöö 4 kraadi juures küüliku antirekombinantse reniini polüklonaalse antiseerumi 1:3,000 lahjendusega (tarnib dr. Murakami, Tsukuba ülikool, Jaapan) või 1:3,{{31} }} küüliku anti-nNOS polüklonaalse antiseerumi (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) lahjendus blokeerivas lahuses; (6) inkubeerimine 30 minutit toatemperatuuril peroksidaas-polümeeriga konjugeeritud universaalse antikehaga (hiire immunoglobuliini (Ig) G ja küülikuvastane IgG; lihtne plekk MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokyo, Jaapan) ; ja (7) immunosignaali tuvastamine, kasutades 3,3'-diaminobensidiini süsteemi (3,3'-diaminobensidiini puhvertablett; Merck, Darmstadt, Saksamaa). Negatiivse kontrolli sektsioonide jaoks kasutati primaarse antikeha asemel normaalset küüliku IgG-d (Lab Vision, Fremont, CA, USA).

Reniini immunoreaktiivsuse randomiseeritud morfomeetriline analüüs viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile [20]. Lühidalt, reniiniindeks määratleti reniini positiivsete arterioolide koguarvu ja glomerulite koguarvu suhtena ja väljendati 100 glomeruli kohta. Rühmade vahelisi erinevusi analüüsiti Bonferroni mitmekordse võrdluse meetodil SPSS versiooniga 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Histopatoloogiline diagnoos tehti koerte neerudüsplaasia mikroskoopiliste kriteeriumide järgi Picut ja Lewis [14]. Kõigi kolme juhtumi histoloogilised sektsioonid näitasid asünkroonset diferentseerumist, mis näitab loote / ebaküpsete glomerulitega kahjustuste olemasolu. Küpsetes neerukudedes täheldati erineva raskusastmega sekundaarseid muutusi, nagu torukujuline kahjustus, interstitsiaalne fibroos ja sklerootilised glomerulid.

Aastaldüsplastilised neerud, täheldati reniini-immunoreaktiivsuse signaale jukstaglomerulaarsetes rakkudes (JGC) (joonis 1A) ja torukujulised rakud paiknesid distaalsetes nefronites (joonis 1B). Mõnes glomerulites näitasid mõned rakud reniini-positiivseid signaale veresoonte pooluste lähedal (joonis 1A). Noortes kontrollneerudes tuvastati reniini signaale ka nii JGC-des kui ka distaalsetes tuubulites, sealhulgas MD-rakkudes. Täiskasvanute kontrollneerudes piirdusid reniin-positiivsed signaalid JGC-dega. Statistiliselt ei näidanud reniini-positiivsete piirkondade arv düsplastilistes neerudes olulisi erinevusi noorte ja täiskasvanud neerude omadest.

On teada, et reniini tootmise stimuleerimine mängib COX{0}} signaaliülekandes rolli ja varasemad uuringud on näidanud, et plasma reniini aktiivsus ja kontsentratsioon vähenesid pärast COX-2 inhibiitori manustamist või COX-i väljalülitamist. -2 geen [10, 11]. Nagudüsplastilised neerudKäesolevas uuringus uuritud uuringud ei näidanud neerude COX-2 [19] ekspressiooni, algselt kahtlustati reniini immunosignaalide vähenemist JGC-des kui võimalikku füsioloogilist kõrvalekallet düsplastilistes neerudes. Kuid käesolev immunohistokeemiline analüüs ei suutnud seda hüpoteesi kinnitada ja JGC-des reniini ilmset vähenemist ei soovitatud. Kuigi torukujulise reniini füsioloogilist rolli ei ole varem selgitatud, võib naatriumi neerude käitlemine olla torukujulise reniini võimalik roll, kuna reniini ekspressiooni tugevnemine indutseeriti distaalses nefronis pärast madala soolasisaldusega dieediga toitmist rottidel. [16] ja käesolevas uuringus uuritud koerte düsplastilised neerud võisid seda torukujulist funktsiooni säilitada.

COX-2 on oluline ka TGF-süsteemi reguleerimisel, mis on oluline glomerulaarfiltratsiooni kiiruse säilitamiseks. Uuring rottidega, milles kasutati mikropunktsiooni meetodit, näitas TGF-i vastuse pärssimist pärast ravi COX-2 inhibiitoriga [2]. TGF vastus sissedüsplastilised neerudvõib neerude COX{0}} ekspressiooni puudumise tõttu nõrgeneda. Siiski ei ole varem teatatud vastavatest leidudest. Neerudes ekspresseeritakse nNOS-i MD-rakkudes ja see aitab reguleerida TGF-süsteemi [18].

Käesolevas nNOS-i analüüsis ei tuvastatud kõigi juhtumite MD-piirkondades nähtavaid signaale (joonis 2). Seda nNOS-i vähenemist peeti etiopatogeenseks sündmuseksdüsplastilised neerudmitte omandatud pärastneerupuudulikkusjuhtumitest. Tegelikult näitas meie eelmine uuring, milles kasutati II tüüpi diabeedi mudelina OLETF-i (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) rotte, et diabeetilise nefropaatia hilisemas staadiumis oli nNOS üleekspresseeritud MD-s ja selle tubulaarsetes rakkudes [21]. TGF-süsteemi reguleerimisel on nNOS-i funktsioon sarnane ja interakteerub COX-i -2-ga. Mõned uuringud on näidanud, et nNOS paikneb signaaliülekande rajast ülesvoolu ja stimuleerib COX-2 ekspressiooni [5, 9]. Teisest küljest on teised uuringud näidanud vastupidist, et COX-2 paikneb tollasest NOS-ist ülesvoolu [2, 13]. Sõltumata signaaliraja erinevusest võib nNOS-immunosignaalide puudumine MD-rakkudes vallandada neerude COX-2 ekspressiooni allareguleerimise.düsplastilised neerud.

Mõned tuubulid näitasid kahel juhul positiivseid signaale nNOS-i jaoks. Ülejäänud juhul näitasid paljud laienenud ja lamenenud tuubulid, tõenäoliselt distaalses nefronis, selgeid positiivseid signaale (joonis 3). Sel juhul silmapaistvate nNOS-positiivsete tuubulitega

neerukudede areng oli kõige ebaküpsem. Noorte ja täiskasvanud normaalsetes neerudes täheldati nNOS-positiivseid signaale jämedates tõusvates jäsemetes, eriti MD-rakkudes (joonis 4). NNOS-i jaotus muutub neerude arengu käigus. Sigade arenevates neerudes levib nNOS laialdaselt ja seda täheldatakse jämeda tõusva jäseme osades, mis viivad makula densasse [17]. Rottidel täheldatakse nNOS-i esinemist arenevas distaalses tuubulis juba S-kujulises kehas alates nefrogeneesi varasematest etappidest [7]. Kuigi nNOS-i jaotumist koerte arenevates neerudes ei ole varem uuritud, on võimalik, et silmatorkavad nNOS-i signaalid tuubulites võivad olla tunnistuseks väga ebaküpsetest tuubulitest koertes.düsplastiline neermitte kahjustatud küpsed tuubulid.

Kokkuvõtteks võib öelda, et reniini ja nNOS-i ekspressioondüsplastilised neerudkolmest noorest koerast uuriti käesolevas uuringus immunohistokeemiliselt. See näitas nNOS-i halvenemist MD-rakkudes pideva reniini ekspressiooniga. nNOS-i ekspressiooni vähenemine MD-rakkudes võib nõrgendada neerude TGF-süsteemi ja see võib olla üks selle aluseks olevaid patoloogilisi mehhanisme.neerupuudulikkusnoortel koerteldüsplastilised neerud.

VÕIMALIKUD HUVIDE KONFLIKTID

Autoritel pole midagi avalikustada.

TUNNUSTUS

Osa sellest tööst toetas Jaapani teaduse edendamise ühingu teadusuuringute abiraha (grandi number 19K06385)

Autor

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4) ja Osamu YAMATO1)

1) Veterinaarkliiniku kliinilise patoloogia labor, Kagoshima ülikooli veterinaarmeditsiini ühendteaduskond, Kagoshima 890-0065, Jaapan

2) Kagoshima ülikooli veterinaarõppehaigla, Kagoshima ülikooli veterinaarmeditsiini ühendteaduskond, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Jaapan

3) Veterinaarhistopatoloogia labor, Kagoshima ülikooli veterinaarmeditsiini ühendteaduskond, Kagoshima 890-0065, Jaapan

4) Veterinaaranatoomia labor, Iwate'i ülikooli põllumajandusteaduskond, Morioka 020-8550, Jaapan

VIITED

1. Adegboyega, PA ja Ololade, O. 2004. Tsüklooksügenaasi -2 immunohistokeemiline ekspressioon normaalsetes neerudes. Rakendus Immunohistokeemia. Mol. Morphol. 12: 71–74. [Medline] [CrossRef]

2. Araujo, M. ja Welch, WJ 2009. Tsüklooksügenaas 2 inhibeerimine pärsib tubuloglomerulaarset tagasisidet: tromboksaani retseptorite ja lämmastikoksiidi rollid. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 296: F790–F794. [Medline] [CrossRef]

3. Blantz, RC, Deng, A., Lortie, M., Munger, K., Vallon, V., Gabbai, FB ja Thomson, SC 2002. Lämmastikoksiidi kompleksne roll glomerulaarse ultrafiltratsiooni reguleerimisel. Kidney Int. 61: 782–785. [Medline] [CrossRef]

4. Câmpean, V., Theilig, F., Paliege, A., Breyer, M. ja Bachmann, S. 2003. Võtmeensüümid neeruprostaglandiinide sünteesiks: kohaspetsiifiline ekspressioon näriliste neerudes (rott, hiir). Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 285: F19–F32. [Medline] [CrossRef]

5. Cheng, HF, Zhang, MZ ja Harris, RC 2006. Lämmastikoksiid stimuleerib tsüklooksügenaasi-2 kultiveeritud CTAL-rakkudes ap38-sõltuva raja kaudu. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 290: F1391–F1397. [Medline] [CrossRef]

6. Deng, A., Wead, LM ja Blantz, RC 2004. Tubuloglomerulaarse tagasiside ajaline kohandamine: COX-i mõjud-2. Kidney Int. 66: 2348–2353.[Medline] [CrossRef]

7. Fischer, E., Schnermann, J., Briggs, JP, Kriz, W., Ronco, PM ja Bachmann, S. 1995. Ontogeny of NO synthase and renin in juxtaglomerular apparatus of rot neerud. Olen. J. Physiol. 268: F1164–F1176. [Medline]

8. Hao, CM ja Breyer, MD 2008. Prostaglandiinide füsioloogiline regulatsioon neerus. Annu. Rev. Physiol. 70: 357–377. [Medline] [CrossRef]

9. Ichihara, A., Imig, JD, Inscho, EW ja Navar, LG 1998. Tsüklooksügenaas -2 osaleb tubulaarvoolust sõltuvas aferentses arterioolitoonis: interaktsioon neuronaalse NOS-iga. Olen. J. Physiol. 275: F605–F612. [Medline]

10. Kim, SM, Chen, L., Mizel, D., Huang, YG, Briggs, JP ja Schnermann, J. 2007. Madal plasma reniinisisaldus ja vähenenud reniini sekretoorsed vastused ägedatele stiimulitele teadliku COX-2-defitsiidi korral hiired. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 292: F415 F422. [Medline] [CrossRef]

11. Matzdorf, C., Kurtz, A. ja Höcherl, K. 2007. COX-2 aktiivsus määrab reniini ekspressiooni taseme, kuid on hädavajalik reniini ekspressiooni ägedaks ülesreguleerimiseks roti neerudes. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 292: F1782–F1790. [Medline] [CrossRef]

12. Norwood, VF, Morham, SG ja Smithies, O. 2000. Neeru düsplaasia sünnijärgne areng ja progresseerumine tsüklooksügenaasi-2 nullhiirtel. Kidney Int. 58: 2291–2300. [Medline] [CrossRef]

13. Paliege, A., Mizel, D., Medina, C., Pasumarthy, A., Huang, YG, Bachmann, S., Briggs, JP, Schnermann, JB ja Yang, T. 2004. Inhibition of nNOS ekspressiooni makula densa COX{2}}tuletatud prostaglandiin E2. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 287: F152–F159. [Medline] [CrossRef]

14. Picut, CA ja Lewis, RM 1987. Koerte neerudüsplaasia mikroskoopilised tunnused. Vet. Pathol. 24: 156–163. [Medline] [CrossRef]

15. Seta, F., Chung, AD, Turner, PV, Mewburn, JD, Yu, Y ja Funk, CD 2009. COX-2 knockdown hiirte neeru- ja kardiovaskulaarne iseloomustus. Olen. J. Physiol. Regul. Täisarv. Comp. Physiol. 296: R1751–R1760. [Medline] [CrossRef]

16. Shao, W., Seth, DM, Prieto, MC, Kobori, H. ja Navar, LG 2013. Reniini-angiotensiini süsteemi aktiveerimine madala soolasisaldusega dieediga ei suurenda intratubulaarset angiotensinogeeni ja angiotensiin II rottidel. Olen. J. Physiol. Neerufüsiool. 304: F505 F514. [Medline] [CrossRef]

17. Solhaug, MJ, Ballèvre, LD, Guignard, JP, Granger, JP ja Adelman, RD 1996. Lämmastikoksiid arenevas neerus. Pediatr. Nephrol. 10: 529–539. [Medline] [CrossRef]

18. Wilcox, CS 1998. Macula densa NOS roll tubuloglomerulaarses tagasisides. Curr. Arvamus. Nephrol. Hüpertensioon. 7: 443–449. [Medline] [CrossRef]

19. Yabuki, A., Miyazaki, A., Ichii, O., Kohyama, M., Sawa, M. ja Yamato, O. 2016. Tsüklooksügenaasi -2 madal ekspressioon kroonilise neeruhaiguse korral noortel koertel. Res. Vet. Sci. 109: 71–73. [Medline] [CrossRef]

20. Yabuki, A., Suzuki, S., Matsumoto, M., Taniguchi, K. ja Nishinakagawa, H. 2002. Lihtne meetod Ren-1 reniini spetsiifiliseks tuvastamiseks. Kidney Int. 62: 2294–2299. [Medline] [CrossRef]

21. Yabuki, A., Tahara, T., Taniguchi, K., Matsumoto, M. ja Suzuki, S. 2006. Neuronaalne lämmastikoksiidi süntaas ja tsüklooksügenaas-2 2. tüüpi diabeetiliste OLETF-rottide diabeetilises nefropaatias. Exp. Anim. 55: 17–25 [CrossRef]. [Medline]

22. Zhang, MZ, Wang, JL, Cheng, HF, Harris, RC ja McKanna, JA 1997. Tsüklooksügenaas -2 roti nefroni arengus. Olen. J. Physiol.

23: F994–F1002. [Medline]