Immunoglobuliin G ekspressioon inimese proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG jt

Abstraktne. Proksimaalnetorukujulineepiteelirakud (PTEC-id) neil on kaasasündinud immuunomadused ja nad toodavad põletikueelseid tegureid, kemokiine ja komplemendi komponente, mis juhivad epiteeli-mesenhümaalset üleminekut (EMT). Meie varasemad uuringud näitasid, et inimese mesangiaalsed rakud ja podotsüüdid olid võimelised sünteesima ja sekreteerima vastavalt immunoglobuliini (Ig) A ja IgG. Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata Ig-de ekspressiooni PTEC-des. Esiteks tuvastati IgG tsütoplasmas, rakumembraanis ja luumenisPTEC-idnormaalses neerukoores pooltimmunohistokeemia. Teiseks tuvastati üksikutes PTEC-des Ig geeni transkriptsioon ja V (D) J rekombinatsioon pesastatud PCR ja Sangeri sekveneerimisega. Kolmandaks tuvastati immortaliseeritud PTEC liinis (HK-2) selgelt Ig, Igκ ja Igλ immunovärvimise ja Western blot analüüsiga, milles kasutati RP215 (antikeha, mis seondub peamiselt mitte-B-rakkudest pärineva IgG-ga). Lisaks tuvastati HK-2 rakkudes Ig, Igκ ja Igλ geenide transkriptid, konservatiivne V(D)J rekombinatsioon Ig varieeruvas piirkonnas, rekombinatsiooni aktiveeriv geen 1/2 ja aktivatsioonist põhjustatud tsütidiini deaminaas. Need andmed viitasid sellele, et PTEC-d võivad ekspresseerida IgG-d sarnaselt B-rakkudega. Lisaks reguleeris TGF-1 IgG ekspressiooni ja see võib olla seotud EMT-ga.

Märksõnad:proksimaalnetorukujulineepiteelirakud, üherakulised, HK-2, IgG, epiteeli-mesenhümaalne üleminek

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Proksimaalnetorukujulineepiteelirakud (PTEC-id) on kõige levinum rakutüüpneerudja neil on oluline roll neerude parandamisel ja/või krooniliste neeruhaiguste progresseerumisel. PTEC-d avaldavad immunoloogilisi funktsioone, ekspresseerides mitmeid Toll-sarnaseid retseptoreid (TLR), nagu TLR 1, 2, 3, 4 ja 9 (1,2), ja molekule, mis on seotud antigeeni esitleva raku funktsiooniga, sealhulgas MHCII, CD74, CD80 ja CD86 (3). Need PTEC-de kaasasündinud immuunomadused võimaldavad neil toimida immuunvastustena paljudele stiimulitele, mille tulemuseks on bioaktiivsete vahendajate, sealhulgas põletikueelsete tsütokiinide, kemokiinide ja komplemendi komponentide tootmine ja vabanemine, mis põhjustavad interstitsiaalset põletikku ja fibroosi (4). PTEC-d ekspresseerivad ka vastsündinute Fc retseptoreid ja säilitavad immunoglobuliini (Ig)G spetsiifilise pH-sõltuva seondumise ja transtsütoosi võime (5). Meie teadmiste kohaselt jääb siiski teadmata, kas PTEC-d ekspresseerivad Ig-sid.

Varem püstitati hüpotees, et Ig-sid toodavad ainult küpsed B-rakud ja plasmarakud ning et Ig-d toimivad erinevate patogeenide äratundmiseks ja neutraliseerimiseks antikehadena. Kuid see teooria on viimastel aastakümnetel kahtluse alla seatud, kuna üha rohkem tõendeid on näidanud, et Ig-e, sealhulgas IgA, IgG ja IgM, võivad toota ja sekreteerida mitte-B-rakud, näiteks inimese epiteeli vähirakud (6, 7) ja normaalsetes mitte-B-rakkudes (8, 9), aga ka immuunprivilegeeritud kohtades, nagu silmad (10), keskneuronid (11, 12), platsenta (13) ning munandid ja munandimanus (14)

Sarnaselt B-rakkudest pärinevatele Ig-dele (B-Ig-dele) on ka mitte-B-Ig-d Ig geeni transkriptsiooni ja ümberkorraldamise produktid ning neil on klassikalised V(D)J rekombinatsioonimustrid koos nukleotiidide lisamisega ühenduskohtades ja somaatiliste hüpermutatsioonidega (7, 11,14). Erinevalt B-Ig-dest näitavad mitte-B-Ig-d piiratud V(D)J-rekombinatsioonimustreid ja väiksemat mitmekesisust (7). Funktsionaalselt ei avalda mitte-B-Ig-d mitte ainult loomulikku antikehade aktiivsust nahas ja limaskestas (8), vaid võivad toimida ka kasvufaktoritena, soodustades rakkude proliferatsiooni ja adhesiooni, ning võimendada vähi teket ja metastaase, seondudes integriinidega ( 15-17). Näiteks RP215 tuvastatud vähi IgG täidab oma onkogeenset funktsiooni, interakteerudes integriini 6 4 kompleksiga ja aktiveerides FAK-i ja Src-radasid (15).

Meie eelmine uuring näitas, et mesangiaalsed rakud (18) ja podotsüüdid (19) võivad sünteesida ja sekreteerida IgA-d ja IgG-d ning osaleda rakkude kasvus ja rakkude adhesioonis in vitro . Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata Ig-de ekspressioonitasemeid PTEC-des ja uurida selle potentsiaalset rolli epiteeli-mesenhümaalses üleminekus (EMT).

Tistanche mõju: kasulik neerudele

materjalid ja meetodid

Rakukultuur ja ravi.Immortaliseeritud PTEC liin HK-2 osteti ettevõttest American Type Culture Collection. HK-2 rakke kultiveeriti DMEM/F12-s, millele oli lisatud 100 U/ml penitsilliini, 0,1 mg/ml streptomütsiini (kõik Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ja 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS; Austraalia päritolu; Biological Industries USA, Inc.) temperatuuril 37 ˚C atmosfääris, mis sisaldab 95 protsenti õhku ja 5 protsenti CO2. Et vältida Ig sekkumist FBS-is, asendati sööde 24–48 tundi enne rakkude kogumist seerumivaba söötmega. HK-2 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (2, 5 ja 10 ng/ml) TGF-1 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA).

Üksik PTEC eraldamine ja cDNA süntees.Inimese neeruproov makroskoopiliselt normaalsest kortikaalsest koest saadi patsiendilt (mees, 31-aastane), kellele tehti neerukartsinoomi tõttu nefrektoomia ilma ilmse neerufunktsiooni häireta. Üherakuline suspensioon valmistati neerukoore seedimisel 1 mg/ml kollagenaas I-ga (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) temperatuuril 37 ˚C 2 0 min. PTEC-d sorteeriti, kasutades fükoerütriiniga (PE) konjugeeritud anti-CD10 (kat. nr 312203) ja allofükotsüaniiniga (APC) konjugeeritud anti-CD13 (kat. nr 301705; mõlemad BioLegend, Inc.) fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise teel. BD FACSAria II eritellimuste süsteem), nagu eelnevalt kirjeldatud (20). Mittespetsiifilise värvimise välistamiseks kasutati vastavaid isotüübi kontrollantikehi (kat. nr 400111 ja 400119; mõlemad BioLegend, Inc.). Topeltpositiivselt märgistatud elusrakud eraldati PTEC-dena. Üks PTEC valiti käsitsi ümberpööratud valgusmikroskoobi all, kasutades kapillaarpipetti, ja viidi seejärel 0,2 ml õhukese seinaga PCR-tuubi, mis sisaldas lüüsipuhvrit (21). Üksik PTEC RNA ekstraheerimine ja cDNA süntees viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetoditele (21). Ig geeni transkriptsiooni ja ümberkorraldamise tuvastamiseks kasutati kokku viit üksikut PTEC-d.

PCR amplifikatsioon.Kogu RNA ekstraheeriti HK-2 rakkudest, perifeerse vere mononukleaarsetest rakkudest [PBMC-d, eraldati 31-aastaselt tervelt naissoost doonorilt, kasutades Ficolli (kat. nr 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] ja neerukoore (samast patsiendilt, mida kasutati üksikus PTEC-isolatsioonis), kasutades TRIzol® reaktiivi (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ning RNA kontsentratsiooni hinnati NanoDrop spektrofotomeetriga (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Seejärel pöördtranskribeeriti 2 µg kogu RNA-d cDNA-ks, kasutades RevertAid First Strand cDNA sünteesikomplekti (kat. nr K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR viidi läbi, kasutades praimereid, mis olid suunatud Ig, Igκ, Igλ ja aktivatsiooni-indutseeritud tsütidiindeaminaasi (AID) konstantsetele piirkondadele. Pesastatud PCR viidi läbi, et amplifitseerida Ig varieeruvat piirkonda, madala tihedusega lipoproteiini retseptoriga seotud valgu 2 (LRP2) ning rekombinatsiooni aktiveerivat geeni (RAG)1 ja RAG2. PCR produktid eraldati elektroforeesiga 1,0% agaroosgeelil ja visualiseeriti kasutades GelRed (kat. nr 41003; Biotium, Inc.). Selles uuringus kasutatud AID, RAG1/2 praimerid ja Ig, Igκ, Igλ konstantsed piirkonnad viitavad Jing et al (19) kasutatud praimeritele. Ig varieeruva piirkonna praimerid viitavad praimeritele, mida on kasutanud van Dongen et al (22). Teised PCR-is kasutatud praimerid on loetletud tabelis SI. Termotsükli tingimused on loetletud tabelis SII.

Sangeri sekveneerimine ja sekveneerimisandmete analüüsid.Üksikutest PTEC-dest, HK-2 rakkudest ja PBMC-dest saadud Ig varieeruva piirkonna PCR-produktid klooniti pGEM-T Easy Vector System I-sse (kat. nr A1360; Promega Corporation), mis transformeeriti. TOP10 kompetentsetesse rakkudesse (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Lühidalt, 5 µl ligeerimisprodukte lisati 30 µl TOP10 kompetentsetele rakkudele, inkubeeriti jääl 30 minutit, kuumšokeeriti temperatuuril 42 ˚C 90 sekundit ja inkubeeriti jääl 5 minutit. Seejärel lisati 500 µl LB-d ja jäeti 40 minutiks seisma 37 °C juures, enne kui osa bakteriaalsest vedelikust inokuleeriti Petri tassidele, mis olid kaetud 0,1 mmol/l IPTG ja 20 µg/ml X-Gal-iga. Nõusid pöörati üleöö temperatuuril 37 ˚C. Kokku valiti juhuslikult 5–16 valget kolooniat proovi kohta ja järjestati, kasutades ABI 3730XL Genetic Analyzerit (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Ümberkorraldatud V(D)J järjestusi võrreldi põhilise kohaliku joonduse otsingutööriistaga (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/), et tuvastada kõige paremini sobivad idutee geenisegmendid ja ristmikud pärast praimeri kärpimist. .

Western blot analüüs.HK-2 rakud lüüsiti TSD lüüsipuhvris [1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5, 50 mM DTT]), mis sisaldas proteaasi inhibiitori kokteili (Applygen Technologies Inc.), töödeldi ultraheliga jäävees 1 minut ( töötades 5 sekundit ja puhates 15 sekundit; 3 korda) ja lüüsides 30 minutit toatemperatuuril. Pärast tsentrifuugimist 12, 000 xg 10 minutit temperatuuril 4 °C määrati rakulüsaadi valgukontsentratsioon BCA komplekti (Applygen Technologies Inc.) abil. Seejärel lisati lüsaadile 5X redutseeriv laadimispuhver, keedeti 100 °C juures 10 minutit ja proove kasutati kohe Western blot analüüsiks. Seerum, mida kasutati Ig positiivse kontrollina, eraldati tervelt doonorilt (sama doonor, mida kasutati PBMC-des) tsentrifuugimisega 2103 xg juures 10 minutit toatemperatuuril.

Tistanche mõju: kasulik neerudele

Western blot viidi läbi standardsete protseduuride kohaselt. Lühidalt, 3{{40}} µg valke eraldati SDS-PAGE abil 10% geelidel ja kanti üle nitrotselluloosmembraanile. Seejärel blokeeriti membraan toatemperatuuril 5% lõssis 1 tund ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C primaarsete antikehadega, sealhulgas küüliku inimesevastase Ig-ga (kat. nr ab109489; 1:1, {{8} }), küüliku anti-inimese Ig 4 (kat. nr ab109493; 1:1, 000), anti-Igκ (kat. nr ab124727; 1:10, 000), anti-Ig 4 Igλ (kat. nr ab124719; 1:20,000), küüliku inimesevastane aktiin (kat. nr ab8227; 1:2, 000) (kõik ettevõttelt Abcam) ja RP215 monoklonaalne antikeha (mAb) (annetanud professor Xiaoyan Qiu, Pekingi ülikool, Peking, Hiina; 1:1, 000), mis tuvastas spetsiifiliselt süsivesikutega seotud epitoobi mitte-B-Ig-l. Seejärel inkubeeriti membraani kitse küülikuvastaste (kat. nr 926-32211) või hiirevastaste (kat. nr 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW sekundaarsete antikehadega (mõlemad 1:10, 000); mõlemad LI-COR Biosciences) toatemperatuuril 1 tund. Signaali tuvastamiseks kasutati Odyssey Imaging süsteemi ja Odyssey V3.0 tarkvara (mõlemad LI-COR Biosciences). Poolkvantifitseerimiseks kasutati ImageJ tarkvara (versioon 1.8.0; National Institutes of Health).

IgG puhastamine ja massispektromeetria.Pärast HK-2 rakkude kultiveerimist DMEM/F12-s ilma FBS-ita 48 tundi koguti kultuuri supernatant pärast tsentrifuugimist 2,103 xg juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Rakkude supernatant puhastati afiinsuskromatograafiaga, kasutades protein G Sepharose'i, vastavalt tootja juhistele (kat. nr 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eluent ultrafiltriti, et asendada elueerimispuhver (0,1 M glütsiin; pH 2,4) PBS-ga. Puhastatud valgud eraldati SDS-PAGE abil 10-protsendilistel geelidel, tuvastati Western blot meetodil ja analüüsiti täiendavalt massispektromeetria abil, mille viis läbi Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Immunofluorestsents.HK-2 rakke kultiveeriti katteklaasidel, mis fikseeriti külmas lahjendamata atsetoonis 5 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti slaide kaks korda PBS-is ja blokeeriti 5% FBS/PBS-ga toatemperatuuril 20 minutit, seejärel inkubeeriti neid primaarsete antikehadega temperatuuril 4 °C üleöö. Antikehad olid samad, mida kasutati Western blot analüüsis: küüliku anti-inimese Ig (1:150), anti-inimese Igκ (1:250), anti-inimese Igλ (1:250) ja RP215 mAb (1:200). ); Negatiivse kontrollina kasutati PBS-i. Pärast PBS-s pesemist inkubeeriti slaide fluorestseiini isotiotsüanaadiga märgistatud kitse küülikuvastaste (kat. nr A11008) või kitse hiirevastaste (kat. nr A11001) IgG antikehadega (1:1, 000); Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) toatemperatuuril 1 tund. Tuumad värviti DAPI-ga. Pildid jäädvustati Leica DFC300 FX fluorestsentsmikroskoobiga (Leica Microsystems GmbH).

Immunohistokeemiline värvimine.Paravähktõve neerukoored koguti neljalt neerukartsinoomiga meespatsiendilt (vanus 38–49 aastat). Normaalsed paravähilised neerukoored pärast nefrektoomiat fikseeriti 10 protsendi formaliiniga 48 tunniks toatemperatuuril ja sisestati seejärel parafiini. Parafiiniga manustatud inimese neeruproovid lõigati 3 µm lõikudeks ning deparafineeriti ja rehüdreeriti läbi erinevate etanoolikontsentratsioonide seeria. Antigeeni otsimine viidi läbi keetmisega 0.05 M Tris-EDTA-s (pH 9,0) kiirkeetjas 3 minutit. Seejärel inkubeeriti sektsioone 3-protsendilise H2O2 lahusega 10 minutit toatemperatuuril, et kõrvaldada endogeenne peroksidaas, ja inkubeeriti normaalse kitse seerumiga (kat. nr ZLI-9022, ZSGB-BIO, Hiina) 30 minutit toatemperatuuril, et blokeerida mittespetsiifilised. antikehade sidumissaidid toatemperatuuril. Seejärel viidi läbi kaudne immunohistokeemiline värvimine primaarsete antikehadega temperatuuril 4 ˚C üleöö, sealhulgas RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), küüliku anti-inimese Ig (1:2, 000), anti-inimese Ig. Igκ (1:1,000), inimesevastane Igλ (1:1,000) (samad antikehad, mida kasutatakse Western blot analüüsis). Primaarsete antikehadeta sektsioone kasutati negatiivsete kontrollidena. Seejärel inkubeeriti slaide toatemperatuuril 30 minutit lahjendamata mädarõika peroksidaasiga märgistatud sekundaarsete antikehadega (kat. nr PV-6001 ja PV-6002; mõlemad OriGene Technologies, Inc.). Seondunud antikehad tuvastati diaminobensidiini abil. Lõpuks värviti objektiklaasid hematoksüliiniga. Pildid jäädvustati valgusmikroskoobiga (200-kordne suurendus). Statistiline analüüs. Andmed on esitatud kui keskmised ± standardhälve ja neid analüüsiti SPSS 20.0 for Windows (IBM Corp.) abil. Kõiki katseid korrati 3 korda. Erinevusi mitme rühma vahel analüüsiti ühesuunalise ANOVA ja Tukey posthoc testi abil. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tistanche mõju: kasulik neerudele

Tulemused

IgG ekspressioon neerukoore neerutuubulaarsetes epiteelirakkudes.Normaalseid neerukoore, mis koguti doonoritelt, kellele tehti neerurakk-kartsinoomi tõttu nefrektoomia, kasutati IgG ekspressiooni määramiseks neerutuubulite epiteelirakkudes immunohistokeemia abil, kasutades inimese Ig, Igκ, Igλ ja RP215 vastaseid antikehi (peamiselt antikehi). seondub mitte-B-IgG-ga). IgG raskete ja kergete ahelate positiivset värvumist ei tuvastatud mitte ainult PTEC-des, vaid ka distaalsetes keerdunud tuubulite epiteelirakkudes, kas tsütoplasmas, rakumembraanis või tubulaarses luumenis (joonis 1).

IgG transkriptsioon ja V(D)J rekombinatsioon üksikutes PTEC-des. Et vältida jääkvere, seondumise ja IgG transtsütoosi segamist PTEC-de poolt neerukoores ning saada otseseid tõendeid IgG ekspressiooni kohta PTEC-des, sorteeriti üksikud PTEC-d inimese neerukoorest, kasutades CD10 ja CD13 kaasmärgistamist voolu teel. tsütomeetria (20). Nagu on näidatud joonisel 2A, moodustasid CD10/CD13 topeltpositiivsed PTEC-d proovis 4,1 protsenti elujõulistest rakkudest. Eraldatud PTEC-d kinnitati täiendavalt spetsiifilise markergeeni LRP2 abil ja CD19 kõrvaldas B-rakkude saastumise. Ig muutuva piirkonna transkripte amplifitseeriti viies üksikus PTEC-s pesastatud PCR abil (joonis 2B ja C). Sangeri sekveneerimise tulemused näitasid, et PTEC-del ilmnes IgG raske ahela funktsionaalne ja konservatiivne VDJ rekombinatsioon (tabel I), mis näitab, et IgG ekspressioon võib esineda PTEC-des.

IgG raske ja kerge ahela ekspressioon HK-2 rakkudes. Kuna IgG valgu ekspressiooni oli raske tuvastada ühes PTEC-s ja saada piisavalt PTEC-sid Western blot analüüsiks, valiti IgG valgu ekspressiooni täiendavaks kinnitamiseks HK-2 rakuliin, mis koosneb immortaliseeritud PTEC-dest. Immunofluorestsentsanalüüs näitas Ig, Igκ ja Igλ positiivset värvumist tsütoplasmas ning RP215 tugevamat positiivset värvumist valdavalt tsütoplasmas ja rakumembraanis (joonis 3A).

Seejärel tuvastati IgG raskete ja kergete ahelate ekspressioon HK-2 rakkudes Western blot analüüsiga redutseerivates tingimustes. FBS-i häirete kõrvaldamiseks söötmes blotiti FBS-i sisaldav sööde vastavate antikehadega ja värviti negatiivseks. Kaubanduslik IgG-antikeha suutis tuvastada seerumist pärinevat IgG-d, kuid mitte HK-2-st pärinevat IgG-d. Seevastu RP215 suudab tuvastada HK-2-st pärinevat IgG-d, kuid mitte seerumi IgG-d. Nii kaubanduslik IgG antikeha kui ka RP215 suutsid tuvastada Ig 55 kDa juures. HK-2 rakkudes tuvastati Ig 4 (36 kDa) riba, mis on kooskõlas prognoositud molekulmassiga. Lisaks täheldati rakulüsaatides Igκ (25 kDa) ja Igλ (50 kDa, dimeer) ekspressioone (joonis 3B). Seejärel puhastati raku supernatandis IgG valgu G-ga, kinnitati Western blot analüüsiga ja sekveneeriti massispektromeetriaga, mis näitas, et 55-kDa riba sisaldas Igκ ahela ja Ig raske ahela varieeruva piirkonna fragmente, teatas National Center for Biotehnoloogia teabe (NCBI) andmebaas (joonis 3C-E). Need andmed viitasid sellele, et HK-2 rakud tootsid ja sekreteerisid IgG valku.

IgG raskete ja kergete ahelate transkriptsioon ja V(D)J rekombinatsioon HK-2 rakkudes. Ig geeni transkriptsioon ja funktsionaalne V(D)J rekombinatsioon on Ig ekspressiooni eeltingimus. IgG ekspressiooni kinnitamiseks HK-2 rakkudes hinnati Ig, Igκ ja Igλ transkripte, võimendades HK-2 rakkude konstantseid ja varieeruvaid piirkondi (joonis 4A ja B). Konstantsete PCR-produktide järjestamisel ilmnes kõrge homoloogia NCBI andmebaasis avaldatud järjestusega. T-A kloonimine ja Sangeri sekveneerimine näitasid, et HK-2 rakkude Ig näitas konservatiivset V(D)J rekombinatsiooni VH4-4/D2-8/JH5-ga. Seevastu PBMC-des täheldati V (D) J rekombinatsiooni mitmekesisust, mis kõrvaldas praimeri nihke (tabel II). Sarnaselt B-rakkudega näitas HK-2-st tuletatud IgG tüüpilist produktiivset V(D)J rekombinatsiooni V-D ja D-J ristmikel (joonis 4C). Lisaks tuvastati somaatilised hüpermutatsioonid HK-2-st tuletatud Ig-s (vahemikus 6,8–8,4 protsenti) 7 leviala motiiviga 15-st (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T), millel on mutatsioonid.

Lisaks tuvastati HK-2 rakkudes AID transkriptid (somaatilise hüpermutatsiooni ja klassivahetuse rekombinatsiooni oluline element B-rakkudes) ning RAG1 ja RAG2 [vajalikud V(D)J rekombinatsiooniks] (joonis 4B), mis näitab, et Ig sünteesi aluseks olev mehhanism HK-2 rakkudes võib olla sarnane B-rakkude omaga.

TGF-1 reguleerib üles IgG ekspressiooni HK-2 rakkudes. HK-2 rakke stimuleeriti erinevate TGF-1 kontsentratsioonidega 48 tundi. Immunofluorestsentsvärvimine näitas, et tsütoplasmaatiline IgG näitas kontrollrühmaga võrreldes tugevamat positiivset värvumist (joonis 5A). Western blotting kinnitas, et TGF-1 reguleeris oluliselt IgG-d (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Tistanche mõju: kasulik neerudele

Arutelu

Käesolev uuring näitas, et PTEC-d ekspresseerisid IgG-d geeni transkriptsiooni ja funktsionaalse konservatiivse V (D) J rekombinatsiooniga, mis oli sarnane mitte-B-IgG-ga. TGF-1 suurendas IgG ekspressiooni HK2 rakkudes.

Et uurida, kas PTEC-d ekspresseerisid IgG-d, tuvastati IgG esmalt PTEC-de tsütoplasmas, rakumembraanis ja valendikutes inimese normaalses neerukoores immunohistokeemia abil; tulemused näitasid, et PTEC-d tootsid ja sekreteerisid IgG-d. See on vastupidine meie tavapärasele patoloogilisele uuringule, kus PTEC-des ilmset IgG-d ei tuvastatud. Selle põhjuseks võib olla väga nõrk PTEC värvumine, mis oli tuvastamiseks liiga madal, eriti immuunsüsteemiga seotud glomerulaarhaiguste korral, mille puhul Ig-d on glomerulites tugevalt positiivsed ja PTEC värvumine võib tahtmatult, kuid kunstlikult kaduda. IgG transtsütoos vereringest PTEC-de poolt Fc retseptori kaudu oli osaliselt välistatud, kuna rakumembraanis ja tsütoplasmas täheldati IgG selget värvimist RP215 poolt. Need leiud viitasid sellele, et PTEC-st tuletatud IgG sarnanes teiste mitte-B-IgG-ga ja neil võib olla unikaalseid glükosüülitud epitoope, mida saab spetsiifiliselt ära tunda RP215, mitte kaubandusliku IgG-vastase antikehaga (15). Avastust, et ainult osa tubulaarsetest epiteelirakkudest ekspresseerib IgG-d, võib seletada dünaamilise ekspressiooniga erinevates rakutsüklites, mis sarnanes mesangiaalrakkudest pärineva IgA ekspressioonimustriga (18). IgG koosvärvimine torukujuliste markeritega (nagu akvaporiin 1 ja akvaporiin 3) oleks kasulik edasistes uuringutes, et parandada käesoleva uuringu tulemusi.

Üherakuline RNA sekveneerimine võib selgelt näidata konkreetse geeni transkriptsiooni antud rakus. Ig-ahela ja V(D)J rekombinatsiooni transkriptid tuvastati üksikutes PTEC-des. Kuigi kasutati ainult viit üksikut PTEC-d, oli protsess range, kuna neerukoor koguti kasvajast kaugel ja iga rakk sorteeriti voolutsütomeetria abil kahe PTEC-spetsiifilise markergeeniga, mida kinnitati kolmanda spetsiifilise markergeeni (LRP2) abil. ja B-rakkude saastumine kõrvaldati. Tulemused näitasid, et PTEC-d ei esine mitte ainult IgG geeni transkriptidega, vaid ka klassikaline V(D)J rekombinatsioon varieeruvas piirkonnas B-rakkudena, näiteks produktiivne V(D)J rekombinatsioon V-D ja D-J-ga. ristmikud (joonis 4), mis näitab, et PTEC-d võivad toota IgG-d. Lisaks näitas konservatiivsem V (D) J rekombinatsioon, et PTEC-d esinevad IgG geeni transkriptidega ja V (D) J rekombinatsiooniga, mis on sarnased teiste mitte-B rakkudega.

Immortaliseeritud PTEC-liini HK-2 on lihtne suurtes kogustes kasvatada. Käesolev uuring kinnitas IgG valgu ekspressiooni kultiveeritud HK-2 rakkudes; IgG tuvastati HK-2 rakkudes nii immunofluorestsentsi kui ka Western blot analüüsiga. Ig 4, Ig alamklass, tuvastati samuti riba suurusel, mis oli kooskõlas prognoositud molekulmassiga. Massispektromeetria näitas, et valgu G-ga raku supernatandist puhastatud valk sisaldas Ig raske ahela varieeruva piirkonna ja Igκ ahela fragmente, andes tõendeid IgG sekretsiooni kohta PTEC-de poolt. IgG transkriptsioon HK-2 rakkudes toetas veelgi IgG ekspressiooni PTEC-des ja konservatiivne V(D)J rekombinatsioon IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5-ga HK-2 rakkudes toetas veelgi IgG esinemist HK-2 rakkudes. teistele mitte-B-rakkudele.

Käesolevas uuringus uuriti ka IgG tootmise aluseks olevat mehhanismi PTEC-des, uurides RAG1, RAG2 ja AID transkriptsiooni HK-2 rakkudes. Selgus, et RAG1, RAG2 ja AID transkribeeriti HK-2 rakkudes. Lisaks on RAG1, RAG2 või AID transkripte varem tuvastatud paljudes teistes mitte-B-rakkudes, nagu podotsüütides (19) ja mitmetes vähirakuliinides (23). Need tulemused näitasid, et mitte-B-rakkudel, sealhulgas PTEC-del, võib olla B-rakkudega sarnane Ig sünteesi mehhanism. Siiski vajab edasist uurimist, kas AID ja/või RAG1/2 on PTEC-st tuletatud IgG jaoks vajalikud geenid. Lisaks on folliikulite abistaja CD4 T-rakud olulised, et reguleerida idukeskuse B-rakkude diferentseerumist plasmarakkudeks ja toetada Ig-de tootmist (24). Meie avaldamata andmed näitasid, et mitte-B-Ig-d tuvastati endiselt T- ja B-rakkude puudulikkusega NOD-SCID hiirtel, mis näitab, et mitte-B-Ig-d ei sõltunud täielikult T-abistajarakkudest. Kas PTEC-de jaoks on IgG ekspresseerimiseks vaja T-abistajarakke, on vaja täiendavaid uuringuid.

TGF-1 omab Ig tootmisel võtmerolli immunomoduleerivalt. Näiteks indutseeris TGF-1 IgA klassi vahetust ja sekretsiooni stimuleeritud B-rakkudes hiire põrnas (25) ja inimese mandlite B-rakkudes (26). McIntyre jt (27) näitasid, et TGF-1 stimuleeris selektiivselt IgG2b sekretsiooni lipopolüsahhariidiga aktiveeritud B-rakkude poolt, tõenäoliselt indutseerides IgM-i IgG2b-klassi ülemineku. Duan jt (28) näitasid, et TGF-1 suurendas IgA ekspressiooni, suurendades transkriptsioonifaktorit Ets-1 epiteelivähirakkudes. Käesolev uuring näitas, et TGF-1 suurendas IgG ekspressiooni HK-2 rakkudes. Arvestades, et HK-2 rakkudes tuvastati ainult IgG, püstitati hüpotees, et TGF-1 indutseeris IgG ekspressiooni sõltumata Ig klassi vahetamisest. TGF-1 IgG tootmise regulatiivne mehhanism nõuab täiendavat uurimist.

PTEC-d täidavad EMT kaudu olulist rolli tubulaarses interstitsiaalses fibroosis ja TGF-1 toimib peamise profibrootilise vahendajana. Käesolevas uuringus suurendas TGF-1 lisamine kultiveeritud HK-2 rakkudele IgG ekspressiooni, mis näitab, et HK-2-st tuletatud IgG võib olla positiivselt seotud EMT-ga. Varasemad uuringud on teatanud, et vähk-IgG seostati metastaasidega ja soodustas EMT-d, vähendades sülje adenoidse tsüstilise kartsinoomi (29) ja kopsuvähi (30) E-kadheriini taset. Tasub uurida, kas PTEC-st tuletatud IgG võib mängida rolli neerutuubulite EMT ja interstitsiaalse fibroosi korral selliste haigusseisundite korral nagu isheemia/reperfusioonikahjustus võikrooniline neeruhaigus.

Kokkuvõtteks võib öelda, et meie teadmiste kohaselt oli käesolev uuring esimene, mis näitas, et PTEC-d võivad ekspresseerida ja sekreteerida IgG-d ning TGF-1 võib IgG ekspressiooni HK-2 rakkudes ülesreguleerida. PTEC-st tuletatud IgG potentsiaalne roll tubulointerstitsiaalses fibroosis nõuab siiski täiendavat uurimist.

Tistanche mõju: kasulik neerudele

Rahastamine

Seda uuringut toetasid Hiina riikliku loodusteaduste fondi (stipendiuminumbrid 82070736, 91642109 ja 81870488), Hainani loodusteaduste fondi (grandi nr 819QN355), Hainani meditsiiniülikooli teadusuuringute kasvatamise sihtasutuse (grandi nr. HYPY201926) ja riikliku loodusteaduste fondi peamise uurimisprogrammi põhitoetusprojektid (grandi nr 91642206).

Andmete ja materjalide kättesaadavus

Käesoleva uuringu käigus kasutatud ja/või analüüsitud andmestikud on mõistliku taotluse korral kättesaadavad vastavalt autorilt.

Autorite kaastööd

Nagu vastavad autorid, mõtlesid YW ja XQ uuringu välja ja kavandasid. ZD osales uurimistöö kavandamises, tegi histoloogilisi ja üherakulisi katseid, valmistas proove massispektromeetria jaoks, analüüsis andmeid ja kirjutas käsikirja. ZJ osales uurimistöö kavandamises, enamikus katsetes IgG ekspressiooni kohta HK-2 rakkudes ja asjakohastes andmete analüüsis. YG, JM, HD ja YL viisid läbi osalised rakuliini katsed. ZC ja YP valisid üherakulisteks katseteks sobivad juhtumid vastavalt kliinilistele omadustele. HY ja ZS osalesid üherakulistes katsetes. SW osales immunohistokeemilises värvimises, analüüsis kudede värvimise andmeid ning koostas ja muutis käsikirja. YW, ZD ja ZJ kinnitasid kõigi algandmete autentsust. Kõik autorid vaatasid käsikirja üle ja parandasid andmeid. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.

Eetiline kinnitus ja nõusolek osaleda

Käesolev uuring vastas Helsingi deklaratsiooni põhimõtetele ning selle kiitis heaks Pekingi ülikooli kolmanda haigla meditsiinieetika komitee (kinnitus nr S2020121) ja viidi läbi vastavalt protokollile. Kõik doonorid annetasid vabatahtlikult neerukoore ja andsid enne neerukoore uuringusse annetamist kirjaliku teadliku nõusoleku. Kõik meetodid viidi läbi vastavalt asjakohastele juhistele ja eeskirjadele. Need proovid muudeti rangelt anonüümseks. Inimese seerum ja PBMC-d, mida käesolevas uuringus kasutati positiivse kontrollina Western blot analüüsis või pöördtranskriptsiooni-PCR-is, saadi terve vabatahtliku verest, kes andis proovide võtmiseks kirjaliku teadliku nõusoleku.

Tistanche mõju: kasulik neerudele

Viited

1. Schlondorff DO: Ülevaade progresseeruva neeruhaiguse patofüsioloogiat soodustavatest teguritest. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Toll-sarnased retseptorid, immunoproteasoomid ja regulatoorsed T-rakud Henoch-Schonleini purpura ja primaarse IgA nefropaatiaga lastel. Pediatr Nephrol 29: 1545–1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G ja Neumann K: neerude proksimaalsed tubulaarsed epiteelirakud avaldavad immunomoduleerivat funktsiooni, käivitades põletikulise CD4 pluss T-raku vastuseid. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL ja Lan HY: Neerutuubulite vigastus: kroonilise neeruhaiguse edasiviiv jõud. Kidney Int 93: 568–579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C ja Tomino Y: immunoglobuliin G FcRn-vahendatud transtsütoos inimese neeru proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Inimese epiteeli vähid eritavad tundmatu spetsiifilisusega immunoglobuliini g, et soodustada kasvajarakkude kasvu ja ellujäämist. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Immunoglobuliini geeni transkriptidel on inimese epiteeli vähirakkudes erinevad VHDJH rekombinatsiooni omadused. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG-d ja IgA-d, millel on võimalik mikroobse sidumisaktiivsus, ekspresseerivad normaalsed inimese naha epidermaalsed rakud. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X ja Wang B: Immunoglobuliin M, hiirte müokardirakkude uudne molekul. Int J Biochem Cell Biol. 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W ja Gu J: Immunoglobuliin G ja selle retseptorite ekspressioon ja jaotumine immuunsüsteemiga privilegeeritud kohas: silm. Cell Mol Life Sci 68: 2481–2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J ja Qiu XY: immunoglobuliini geeni ekspressioon klassikalise V-(D)-J ümberkorraldusega hiire aju neuronites. Int J Biochem Cell Biol. 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C ja Gu J: Immunoglobuliin G ja selle retseptorite ekspressioon ja jaotumine inimese närvisüsteemis. Int J Biochem Cell Biol. 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W ja Gu J: immunoglobuliini G kaks ultrastruktuurilist jaotusmustrit inimese platsentas ja funktsionaalsed tagajärjed. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P ja Qiu X: immunoglobuliini geeni ekspressioon klassikalise V-(D)-J ümberkorraldusega hiire munandis ja munandimanuses. J Histochem Cytochem 57: 339–349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Kopsu lamerakk-kartsinoomi rakud ekspresseerivad mittekanooniliselt glükosüülitud IgG-d, mis aktiveerib integriin-FAK signaaliülekande. Cancer Lett 430: 148–159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q ja Zhao Y: vähist pärineva glükosüülitud immunoglobuliini G kõrge ekspressioon ennustab pankrease duktaalse adenokartsinoomi halba prognoosi. J Cancer 11: 2213–2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q ja Zhao YP: vähist saadud immunoglobuliin G: uudne marker kõrvalkilpnäärme kartsinoomi diferentsiaaldiagnostikaks ja retsidiivide ennustamiseks. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461–467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X ja Wang Y: Immunoglobuliini A ekspressioon inimese mesangiaalrakkudes ja selle mõju raku apoptoosile ja adhesioonile. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X ja Wang Y: Immunoglobuliini G ekspressioon inimese podotsüütides ja selle roll rakkude elujõulisuses ja adhesioonis. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Primaarse proksimaalse tubulaarse epiteelirakkude mudeli isoleerimine ja iseloomustamine inimese neerust CD10/CD13 topeltmärgistamise abil. PLoS One 8: e66750, 2013.