Ajukoe ülalt-alla proteoomika täiustamine FAIMS-iga, 4. osa

Samuti tuvastasime arvukalt fragmente, mis pärinevad tauproteiini mittekanoonilistest splaissinguisovormidest, mis teadaolevalt ekspresseeruvad inimese ajus.83 Lühidalt, tau isovormid on määratletud N-terminaalsete insertide arvuga, mis on tingitud eksoni 2 ja/või 3 alternatiivsest splaissimisest (viidatud kui 0N, 1N ja 2N) ja mikrotuubulitega seonduvate korduste arv, mis on tingitud eksoni 10 alternatiivsest splaissimisest (nimetatakse kui 3R või 4R).84

Tau valk on neuronaalsetes rakkudes oluline valk, millel on väga oluline roll närvirakkude normaalse struktuuri ja funktsiooni säilitamisel. Uuringud on näidanud, et tau valk on tihedalt seotud mäluga ja selle ebanormaalne ekspressioon võib viia kognitiivsete funktsioonide languseni ja isegi kognitiivsete häireteni.

Teadlased on palju uurinud tau-valgu seost mäluga. Uuringute kohaselt võib tau-valk aidata reguleerida närvikiudude stabiilsust, soodustades seeläbi infoedastust ja mälu teket närvirakkude vahel. Kui tau valk on aga ebanormaalne, näiteks valkude akumuleerumine, põhjustab see närvikiudude purunemise ja suure hulga neuronaalsete rakkude surma, mis mõjutab mälu kujunemist ja säilimist ning põhjustab isegi mäluhäireid. Seetõttu on tau-valgu normaalse ekspressiooni ja funktsiooni säilitamine mälu tervise säilitamiseks väga oluline.

Hiljutised uuringud on samuti leidnud, et mõnedes toitudes ja jookides sisalduvad toitained on kasulikud ka tau-valgu normaalse funktsiooni säilitamiseks. Näiteks võivad antioksüdandid, oomega{0}} rasvhapped ning kofeiinirikkad köögiviljad ja puuviljad aidata reguleerida tau-valgu ekspressiooni ja funktsiooni, mis aitab parandada mälu ja kognitiivseid funktsioone.

Seetõttu peaksime tau-valgu normaalse ekspressiooni ja funktsiooni säilitamiseks pöörama tähelepanu heade eluharjumuste säilitamisele, toitumise kontrollimisele, stressi vähendamisele jne. Samal ajal võib heade õppimisharjumuste säilitamine ja mõõdukas treenimine aidata kaasa teabe edastamisele ja mälu kujunemisele närvirakkude vahel. Usun, et seni, kuni pöörame tähelepanu tervislike eluviiside säilitamisele, saame olla terve mälu ja nautida elu paremini. See näitab, et peame oma mälu parandama. Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche'i efektiivsus tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Klõpsake nuppu Tea 10 viisi mälu parandamiseks

Samuti väärib märkimist, et tau endogeensed fragmendid on tavaline leid inimese ajukoes ja tserebrospinaalvedelikus ning tau diferentsiaalne fragmentatsioon võib mängida rolli AD progresseerumisel.85,86

Täheldasime mitmeid fragmente, mis suutsid üheselt eristada {{0}}N ja 1N tau (joonised 10A, S7 ja S8). Asjaolu, et me täheldame 0N (86 PrSM) ja 1N (91 PrSM) puhul kõrgeid spektraalloendeid, kuid ei jälgi 2N puhul ühtegi PrSM-i, on kooskõlas eelmise kvantitatiivse immunoblotanalüüsiga, mis leidis, et 0N ja 1N on domineerivad vormid ja moodustavad ~ 91% tau koguarvust, samas kui 2N moodustab ainult ~9%.87

Mikrotuubulitega seonduvate korduste ühemõttelise määramise kohta täheldasime spektreid, mida sai määrata nii 3R-le (joonised 10A ja S9) kui ka 4R tau-le (joonised 10A ja S10).

Kokkuhoidlik järeldus võimaldas meil järeldada, et braintau esindab enamasti 1N3R (Tau-B) segu, millele järgneb 0N4R (Tau-D) splaissvariant, mis on kooskõlas varasemate tähelepanekutega.87,88

Kuigi teistel splaissingu isovormidel olid ka ainulaadsed fragmendid, oli spektraalsete vastete väike arv (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Üllataval kombel on domineerivate R-domeeni sisaldavate fragmentide N-otsad jätk domineerivate N-domeeni sisaldavate fragmentide C-otsadest ehk teisisõnu näivad need olevat seotud fragmendid, mis on tekkinud võimaliku proteolüütilise lõhustumise sündmuse tagajärjel (viidatud kui sait nr 1 joonisel 10A). Veelgi enam, domeeni 3Rand 4R sisaldavate proteovormide C-otsad jagavad sama lõhustamissaiti (joonisel 10A viidatud saidile #2), kuigi järjestused ise on eksoni 10 splaissingu variatsiooni tõttu erinevad.

Veelgi üllatavam on see, et kõik need lõhustamiskohad asuvad kolmes hästi kirjeldatud heksapeptiidi motiivis.89–95 Joonisel 10B on näidatud kõik unikaalsed fragmendid, mille tuvastasime meie andmekogumitest ja mida saab kaardistada 1N3R tau isovormiga, samuti lõhustamise asukohta. saidid.

Lõhustumiskoht #1 asub tau teises proliinirikkas piirkonnas, mis jagab KVAVVR heksapeptiidi järjestuse ja on üks tugevamaid mikrotuubulite sidumissaite (joonis 10B). ja VQIINK, mis on näidanud, et need soodustavad tau agregatsiooni (joonis 10B).92–95

Huvitav on see, et paljud fragmendid, nagu on näidatud joonisel fig 10B, algavad või lõpevad nende kahe lõhustumiskoha läheduses. Kõik need heksapeptiidi motiivid moodustavad teadaolevalt struktuuri, sageli juuksenõelte kujul, mis on mitmesuguste neurodegeneratiivsete haigustega seotud agregatsiooni aluseks. 89, 93, 96 Huvitaval kombel toovad need tähelepanekud esile võimaluse, et tau isovormide vahel on ühine proteolüütiline lagunemisrada, mis on mis on võimelised häirima nende koondamise ja külvamise piirkondi.25,85,86

Lõpuks leidsime A jaoks arvukalt spektraalseid vasteid, mida sai jälgida ainult FAIMS-i abil.

Neid A-proteovorme, mis vajavad hüdrofoobsete ja agregatsioonile kalduvate omaduste tõttu taastumise parandamiseks tavaliselt spetsiaalseid fraktsioneerimise või käitlemise tehnikaid, 9, 16, 97, 98 täheldati FAIMS-i abil puutumatuna vahemikus –40 kuni –50 CV.

See hõlmab kanoonilisi A 1–42 ja A 1–40 (vastavalt joonis 11A, B), aga ka mitmeid N-otsa kärbitud vorme (täpsemalt A 2–42 ja A 4–42, joonis 11C, D).

Väärib märkimist, et erinevate N- ja C-terminaalsete lõhustustega A-proteovorme on alt-üles analüüsides trüptiliste saaduste äärmise hüdrofoobsuse tõttu teadaolevalt raske tuvastada, mis toob esile puutumatu valgu analüüsi eelise.

Usume, et FAIMS-TDP metoodika pakub tugevat viisi nende A-proteovormide puutumatu identifitseerimise saavutamiseks, võimaldades olemasolevate N- ja C-terminaalsete lõhustumisproduktide erinevate kombinatsioonide hõlpsat määramist.

JÄRELDUSED

Oleme kirjeldanud, kuidas väga keeruka proovi sisaldavate valkude nano-LC pöördfaasiline eraldamine laias massivahemikus saab kasu FAIMS-i kaudu toimuvast gaasifaasi fraktsioneerimisest ülalt-alla massispektromeetria kontekstis.

Näidati, et FAIMS mõjutab proteovormide ülekannet suuruse ja/või laengu järgi, vähendades MS1 keerukust ja võimaldades proteoomi suuremat katvuse sügavust.

FAIMS ühe CV-ga (−50) võimaldas tuvastada keskmiselt 1833 ± 17 unikaalset proteovormi, mis on enam kui kaks korda rohkem kui ilma FAIMS-ita (754 ± 35). FAIMS-i lisamine ei põhjustanud kvantifitseerimise reprodutseeritavuse halvenemist ja jäi 20% RSD lähedale, mis on võrreldav sildivaba alt-üles lähenemisviisiga.

Täheldati, et FAIMS-i CV vähenemine suurendas seadmesse edastatavate iooniliikide molekulmassi (mediaan MW ~5 kDa juures –50 CV vs ~15 kDa juures –20 CV) ning samuti täheldati, et CV modulatsioon mõjutas ioonide ülekannet. proteovormi laengu oleku mähis diferentsiaalselt.

Samuti määratlesime optimaalsed CV-de kombinatsioonid, mis võiksid anda proteovormide / geenide või proteoomijärjestuse suurima teoreetilise maksimumi. Võrreldes kolme "No FAIMS" andmekogumiga võib väline CV aste –50, –40 ja –30 V rohkem kui kahekordistada ainulaadsete proteovormide, unikaalsete geenide ja proteoomijärjestuse katvuse arvu.

Samuti väärib märkimist, et meie töö uuris ainult suhteliselt väikest CV vahemikku, mis meie arvates sobis meie TDP lähenemisviisiga keeruka valimi abil kõige paremini. Kuna FAIMS-i saab hõlpsasti kohandada teiste meetoditega, võivad madala eraldusvõimega MS1 analüüsid Orbitrap analüsaatoritega parandada suuremate proteovormide tuvastamist meie testitud CV vahemikus, aga ka väljaspool -20 V, kus tõenäoliselt täheldatakse suuremaid proteovorme.

Samuti võib ette kujutada, et tulevased massianalüsaatorid, mis parandavad suuremate proteovormide omandamist ja ühilduvad FAIMS-iga, võivad saada kasu alla -20 CV-de uurimisest, mis ulatub positiivsesse pingevahemikku.

Meie TDP töövoog võimaldas meil tuvastada ja iseloomustada ainulaadseid proteovorme, mis pärinevad geenidest, millel on teadaolev roll neurodegeneratiivsetes haigustes.

See hõlmas sünukleiini rauda siduva domeeni lähedal esineva tundmatu massinihke koostise määramist, mida kasutati potentsiaalsete rauda siduvate domeenide asukoha kindlaksmääramiseks ka - ja sünukleiinis. Samuti leiti, et PARK7 on modifitseeritud suktsinüülrühmaga selle aktiivse saidi Cys jäägil.

Suutsime üheselt eristada tau fragmendid, mis vastavad 0N, 1N, 3R ja 4R splaissinguvariandi isovormidele individuaalselt ja kirjeldada uusi proteolüütilisi lõhustamiskohti, mis paiknesid mitmes agregatsiooni külvava heksapeptiderekordi sees või läheduses.

Lõpuks võimaldas FAIMS tuvastada mitut puutumatut A-proteovormi, sealhulgas agregatsioonile kalduvat A 1–42, ilma et oleks vaja keerukaid fraktsioneerimis- või puhastusmeetodeid.

Kokkuvõttes usume, et FAIMS-i lisamine TDP avastamiseks annab tugeva ja reprodutseeritava meetodi tuvastamiseks ja iseloomustamiseks saadaoleva proteoomi suurendamiseks.

Täiendav materjal

Lisamaterjali leiate PubMed Centrali veebiversioonist.

TUNNUSTUS

Autorid soovivad tänada Tao Liud ja Richard Smithi nende nõuannete ja kasulike arutelude eest.

Seda tööd toetasid U01 AG061356 (PLDJ) ja R01 AG015819 (DAB). Osa uuringutest viidi läbi, kasutades EMSL-i (grid.436923.9), DOE Office of Science'i kasutajarajatist, mida toetab Biological and Environmental Research programm. Joonisel 1 olevad graafilised abstraktsed ja pildivarad loodi saidi Biorender.com abil.

VIITED

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Puusepp DO; Carvalho F;Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE;Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaja EV; GuptaR; Hachinski V; Hagose TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hein SI; Irvani SSN; Jha RP;Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T;Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S;Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR;Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Tiigi CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A;Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahara MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Trans BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketasubramania N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Alzheimeri tõve ja muude dementsuse ülemaailmne, piirkondlik ja riiklik koormus, 1990–2016: süstemaatiline analüüs ülemaailmse haiguskoormuse uuringu jaoks 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [Avaldatud: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amüloidi prekursorvalk (APP) ja beeta A4 amüloid Alzheimeri tõve etioloogias: prekursor-produkti seosed neuronaalse funktsiooni häiretes. Ajupatool. 1991, 1, 241–251. [Avaldatud: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimeri tõbi: amüloidkaskaadi hüpotees. Teadus 1992, 256, 184–185. [Avaldatud: 1566067]

(4). Goedert M. Tau valk ja Alzheimeri tõve neurofibrillaarne patoloogia. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [Avaldatud: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau ja neurodegeneratiivne haigus: senine lugu. Nat. Rev Neurol.2016, 12, 15–27. [Avaldatud: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Amüloidi hüpoteesi kolm mõõdet: aeg, ruum ja "tiivamehed". Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [Avaldatud: 26007213]

(7). Takeda S. Tau levik kui dementsuse diagnostiline ja terapeutiline sihtmärk: potentsiaalid ja vastamata küsimused. Esiosa. Neurosci. 2019, 13, 1274. [Avaldatud: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Top-down proteoomika tervises ja haigustes: väljakutsed ja võimalused.Proteomics 2014, 14, 1195–1210. [Avaldatud: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Autorid ei deklareeri konkureerivat rahalist huvi. MI; Popov IA; Nikolaev ET Abeta peptiidide mitmekesisuse massispektromeetriline analüüs: AD biomarkerite avastamise raskused ja tulevikuperspektiivid. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [Avaldatud: 30253669]

(10). Grasso G. Massispektromeetria on mitmetahuline relv, mida kasutatakse võitluses Alzheimeri tõve vastu: amüloid-beeta-peptiidid ja muud. Massispekter. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andrejev VP; Petyuk VA; Õllepruul HM; Karpievitš YV; Xie F; Clarke J; Laager D; Smith RD;Lieberman AP; Albin RL; Navaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Märgistuseta kvantitatiivne LC-MSproteoomika Alzheimeri tõve ja normaalselt vananenud inimese aju kohta. J. Proteome Res. 2012, 11 3053–3067. [Avaldatud: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Käigukast M; Wang PG; lõug LS; Li L. Integreeritud proteoomika ja võrguanalüüs tuvastavad Alzheimeri tõve valgukeskused ja võrgumuutused. ActaNeuropatool. Commun. 2018, 6, 19. [Avaldatud: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com