Empagliflosiin leevendab diabeedi ja neerutorukeste düsfunktsiooni sümptomeid laienenud neeruga diabeedi rotimudelil (DEK)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Ayaka Domon¹, Kentaro KatayamaID¹, Touko Sato², Yuki Tochigi¹, Hiroyuki Tazaki², Hiroetsu SuzukiID^1*

Abstraktne

Taust: Naatrium-glükoosi kaastransporter 2 (SGLT2) inhibiitoreid kasutatakse laialdaselt hüperglükeemia vähendamiseks. Käesolevas uuringus uuriti SGLT2 inhibiitori empagliflosiini mõju hüperglükeemiale uudses mitte-rasvunud 2. tüüpi diabeedi rotimudelis, millel on suurenenud diabeet.neerud(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >300 mg/dl klassifitseeriti vastavalt mittediabeetilisteks ja diabeetikuteks. Mittediabeetiliste (kontroll) ja diabeetiliste (DM-kont.) rottide rühmi toideti 12 nädalat standardse toiduga, samal ajal kui teisele diabeetiliste (DM-empa) rottide rühmale toideti 12 nädala jooksul standardset toidurooga, mis sisaldas empagliflosiini (300 mg/kg/päevas). . Mõõdeti vere glükoosisisaldust, kehakaalu, glükoositaluvust, toidu ja vee tarbimist, uriini mahtu, plasma ja uriini biokeemilisi parameetreid ning luu mineraalset tihedust ningneerudja pankreast analüüsiti histoloogiliselt. Tulemused: Ravi empagliflosiiniga vähendas diabeetiliste rottide veresuhkru kontsentratsiooni ja toidutarbimist, kuid pärssis adeps-ohjade kadu ja tõi kaasa kehakaalu tõusu. Empagliflosiin nõrgendas polüuuriat ja polüdipsiat, kuid suurendas üldkolesterooli, naatriumi ja üldvalgu kontsentratsiooni plasmas normaalse tasemeni. Empagliflosiin vähendas oluliselt ka valkude ja elektrolüütide eritumist uriiniga ning taastas luu mineraalse tiheduse ning valiini ja isoleutsiini plasmakontsentratsiooni normaalsele tasemele. Veelgi enam, neerutuubulite laienemine janeerudlaienemine ei nõrgenenud DM-empa rühmas. Järeldus: DEK-rottide reaktsioon empagliflosiinile erines teiste diabeetiliste loommudelite omast, mis viitab sellele, et DEK-rottidel on ainulaadsed omadused SGLT2 inhibiitorite mitme bioloogilise toime uurimiseks ja hindamiseks. Need leiud näitasid ka, et empagliflosiin võib parandada süsteemset metabolismi ja parandadaneeru-tuubulite funktsioondiabeetiktingimused.

Cistanche tubulosa takistabneerudhaigus, proovi saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Diabeedi (DM) levimus maailmas kasvab jätkuvalt ning patsientide arv ulatub 2045. aastaks hinnanguliselt 700 miljonini [1]. Ligikaudu 90–95 protsendil neist patsientidest on 2. tüüpi DM, mida iseloomustab insuliini sekretsiooni järkjärguline vähenemine koos insuliiniresistentsusega või ilma [2] ja mis on neeru- ja südame-veresoonkonna haiguste peamine riskitegur [3]. II tüüpi DM on lõppstaadiumis neerupuudulikkuse (ESRD) peamine põhjus, millega kaasneb diabeetiline nefropaatia, mida nimetatakse ka diabeetiliseks.neerudhaigused, põhjustades 20–40 protsendil neist patsientidest [4]. ESRD-ga patsiendid vajavad normaalse seisundi säilitamiseks dialüüsi või neerusiirdamistneerufunktsioon. Need protseduurid seavad ühiskonnale ja üksikisikutele sotsiaalse ja majandusliku koormuse ning mõjutavad patsientide elukvaliteeti [5]. Seetõttu on vaja teha jõupingutusi DM ja diabeetilise nefropaatia ennetamiseks või leevendamiseks [6].

Naatrium-glükoosi kotransporter 2 (SGLT2) inhibiitorid on uudne diabeedivastaste ravimite klass, mis toimivad endogeensest insuliinist sõltumatult [7]. SGLT2 inhibiitorid vähendavad vere glükoosisisaldust, inhibeerides glükoosi reabsorptsiooni proksimaalsetes neerutuubulites [7]. SGLT2 inhibiitoritel on kasulik mõju ka DM-i neeru- ja kardiovaskulaarsetele tüsistustele [8–10], samuti metabolismi parandamine [11], mis kõik on osaliselt sõltumatud nende glükoosisisaldust langetavast toimest. Lisaks parandavad SGLT2 inhibiitorid kroonilise haigusega mitte-DM-patsientide neerufunktsioonineerudhaigused [12]. Siiski on SGLT2 inhibiitorite toime, sealhulgas neerude tagajärjed, patsientidel erinev [13]. Need variatsioonid peegeldavad tõenäoliselt erinevusi paljudes tegurites, sealhulgas geneetiline eelsoodumus, metaboolne seisund, hemodünaamika ja elustiil.

Hiljuti asutasime uudse mitte-rasvumise tüüpi 2 DM roti tüve, millel on suurenenudneerud(DEK) LEA-st. PET-lemmikloomade kongeeniline tüvi. DEK tüves on umbes 50 protsendil meestest diabeet 30 nädala vanuselt. Nendel diabeetilistel rottidel vähenes plasma insuliinikontsentratsioon progresseeruvalt pankrease rakkude kadumise, neeruparenhüümi suurenemise ja neerude märkimisväärse suurenemise tõttu.neerudneerutuubulite laienemisega [14]. DEK-rottidel vähenes ka üldkolesterooli (TCHO), üldvalgu ja albumiini kontsentratsioon plasmas [14]. Need histoloogilised ja metaboolsed tunnused on ainulaadsed DEK-rottidele, eristades seda mudelit teistest diabeedi loommudelitest ja viitavad sellele, et DEK-rotid võivad olla kasulikud diabeedivastaste ravimite farmakoloogiliste mõjude uurimiseks.neerudja ainevahetust. Seetõttu hinnati käesolevas uuringus SGLT2 inhibiitori, empagliflosiini mõju DEK-rottide neerudele ja süsteemsele metabolismile.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >300 mg/dl klassifitseeriti vastavalt mittediabeetilisteks ja diabeetikuteks [14]. Kõiki rotte hoiti tavapärastes tingimustes, sealhulgas 14:10 h valguse ja pimeduse tsüklis, toatemperatuuril 20 ± 2 °C ja suhtelisel õhuniiskusel 50 ± 10 protsenti. Kõik loomkatsed kiitis heaks Nipponi veterinaar- ja bioteaduste ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning need viidi läbi vastavalt Nipponi veterinaar- ja bioteaduste ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhistele.

Male rats with blood glucose concentrations >300 mg/dl vanuses 15–20 nädalat DEK tüves jaotati juhuslikult empagliflosiini dieedi rühma (DM-empa) (n=5) ja standardse dieedi rühma (DM-cont) (n {{6} }) 2–3 nädala jooksul pärast DM väljakujunemist. Isased rotid, kellel ei olnud DM (vere glükoosisisaldus oli 30 nädala vanuselt endiselt madalam kui 300 mg/dl) DEK tüves, määratleti kontrollrühmana (n=12). Kontroll- ja DM-i rühmadel oli ad libitum juurdepääs veele ja standardsele dieedile (CR-LPF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Jaapan) 12 nädala jooksul, samas kui DM-empa rühma rottidel oli ad libitum juurdepääs veele ja standardne dieet pluss empagliflosiin (300 mg/kg; Eli Lilly Jaapan; Kobe, Jaapan). Empagliflosiini annus kavandati eelmiste aruannete põhjal [15, 16]. Iganädalaselt mõõdeti veresuhkru kontsentratsiooni tühja kõhuga, kehakaalu ja toidutarbimist. Kõik rotid surmati 12 nädala pärast ja nendeneerud, koguti pankrease ja vereproovid. Seadsime humaansed lõpp-punktid kõikidele loomadele, kelle kehakaal on langenud 25 protsenti või kellel ilmnesid raskelt haigestumisega seotud sümptomid. Siiski ei olnud selles uuringus ühtegi rotti, kellel oleks nii tõsist kehakaalu langust ja haigusseisundit.

Suukaudne glükoositaluvuse test (OGTT)

Suukaudsed glükoositaluvuse testid (OGTT) viidi läbi järgmisel päeval pärast 12-nädalast raviperioodi, nagu kirjeldatud [14]. Lühidalt öeldes paastus rotte 16 tundi ja neile manustati suukaudselt 2 g/kg kehakaalu kohta (BW). Veri võeti sabaveenist ja glükoosikontsentratsioonid mõõdeti 0, 30, 60, 120, 180 ja 240 minutit pärast glükoosi laadimist. Vereproovid koguti ka jugulaarveenist isofluraananesteesia all, mida kontrollis väikelooma anestesaatoriga (TK-7, Biomachinery, Chiba, Jaapan) 0, 30 ja 60 minutit pärast glükoosi laadimist, segati hepariiniga ja tsentrifuugiti. 15 minutit temperatuuril 4 °C, et saada plasma. Plasma insuliini kontsentratsioone mõõdeti LBIS Rat Insulin ELISA Kit (RTU) (Shibayagi, Gunma, Jaapan) abil.

Neerude parameetrite mõõtmine

12. nädalal hoiti rotte 24 tundi individuaalselt metaboolsetes puurides ning mõõdeti uriini ja joogivee mahtu [14]. Kreatiniini (Cre), uurea lämmastiku (UN), kaltsiumi (Ca), Na-K-Cl ja glükoosi (Glu) kontsentratsioonid uriinis mõõdeti seadmega Dri Chem 3500V (FUJIFILM, Tokyo, Jaapan). Valgu kontsentratsioonid uriinis mõõdeti Protein Assay Rapid Kit Wako II abil (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Tokyo, Jaapan). Caudaalsest õõnesveenist koguti isofluraananesteesia all veri ning UN, albumiini (Alb), üldvalgu (TP), üldkolesterooli (Tcho), Ca ja Na K-Cl kontsentratsioonid plasmas mõõdeti Dri-Chem 3500V abil. Cre kontsentratsiooni plasmas mõõdeti FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (Tokyo, Jaapan) abil. Kreatiniini (Ccre), glükoosi (Cglu), kaltsiumi (Cca), naatriumi (Can), kaaliumi (Ck) ja kloori (Ccl) kliirensid arvutati järgmise valemi abil:

Kliirens (Cx) (ml/min/kg)=[uriini kontsentratsioon (mg/dl või mEq/l) × uriini maht (ml/min)] / plasmakontsentratsioon (mg/dl või mEq/l) / kehakaal (kg).

Glükoosi (FEglu), kaltsiumi (FEca), naatriumi (FEna), kaaliumi (FEk) ja kloori (FEcl) fraktsionaalne eritumine arvutati järgmise valemi abil:

Fraktsiooni eritumine (FEx) ( protsenti )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.

Maksa rasvhapete sidumise (L-FABP) kontsentratsioon uriinis mõõdeti Mouse/Rat FABP1/L-FABP komplekti (R&D Systems, Inc., MN, USA) abil.

Histoloogia, immunofluorestsents ja insuliinipositiivse ala arvutamine

Loomad surmati pärast 12-nädalast raviperioodi naatriumpentobarbitaalnaatriumi üledoosiga. Theneerudja pankreas eemaldati igalt surmatud rotilt ja kaaluti. Koeproovid fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), sisestati standardprotseduure järgides parafiini ja lõigati 1 μm või 4 μm paksusega perioodilise happe-Schiffi (PAS) ja immunofluorestsentsvärvimise jaoks. Neerutuubulite laienemist hinnati vastavalt eelnevalt kirjeldatule [17]. Hinnati kümme juhuslikku mittekattuvat neerukoore ja kõrvutipiirkonna 40 x suurendatud välja. Torukujuline dilatatsioon hinnati skaalal {{10}}–3, kus 0, 1, 2 ja 3 tähistavad 0,<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 saareosa roti kohta, kasutades Image J tarkvara, ja arvutati insuliinipositiivse ala protsent saarekeste pindala kohta.

Reieluu luu densitomeetriline analüüs

Pärast 12-nädalast raviperioodi lõigati neljalt eutanaatitud mitte-DM-kontrollilt, kolmelt DM-i ja kolmelt DM-empa-rotilt reieluud välja ning skaneeriti mikro-CT-süsteemiga (Latheta LCT-100, Aloka, Tokyo, Jaapan). . Luu mineraalne tihedus (BMD, mg/cm3) ja luu mineraalide sisaldus (BMC, mg) arvutati tarkvara Latheta abil.

Plasma aminohapete gaasikromatograafia-massispektromeetria (GC-MS) analüüs

Plasmaproovid saadi 30-nädalastelt kontrollrottidelt ja 27–32 nädala vanustelt DM cont ja DM-empa rottidest pärast 12-nädalast raviperioodi. Plasmaproove töödeldi Phenomenex EZ: kiire AA analüüsikomplektiga (Phenomenex, Torrance, CA), sisestandardina kasutati norvaliini [18]. GC-MS analüüsiks kasutati GCMS-QP2010Plus ja GCMS lahendustarkvara (Shimadzu, Kyoto, Jaapan) [19].

Statistiline analüüs

Keskmise ± standardveana (SE) esitatud tulemusi võrreldi kahes rühmas kaheosaliste õpilaste t-testidega ja mitmes rühmas Tukey-Krameri testidega. P-väärtust < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Tulemused

Diabeediga seotud üldised seisundid

Iganädalased toidutarbimise mõõtmised näitasid, et hinnanguline keskmine päevane toidukogus oli DM-i rühmas veidi suurem kui DM-empa rühmas (36,9 ± 1,5 g vs. 34,3 ± 1.0 g). Empagliflosiini hinnanguline päevane annus DM-empa rühmas oli 23,7±0,7 mg/kg kehakaalu kohta (BW). Empagliflosiin vähendas järsult veresuhkru kontsentratsiooni järgmisel päeval pärast ravi alustamist, 404,6±36,3 mg/dl-lt 143,8±14,6 mg/dl-ni, kusjuures vere glükoosisisaldus DM-empa rühmas oli oluliselt madalam kui DM-i rühmas. -Cont rühm 12-nädalase raviperioodi jooksul (joonis 1A). See DM-empa tase on sarnanenud normaalsele kontrollile tavalise dieediga (147.{{40}}±1,2 mg/dl) [14]. Kehakaal suurenes vanusega järk-järgult DM-empa rühmas, kuid mitte DM-i rühmas (joonis 1B), kusjuures lõplik kehamass 12 nädala pärast oli DM-empa rühmas 444,6 ± 18,0 g ja DM- 372,3 ± 26,4 g. jätkugrupp. Samas vanuses oli kontrollrühma kehakaal ligikaudu 533,4 ± 9,8 g [14]. Kooskõlas kehakaalu tõusuga jäid adepsi ohjad (1,4 ± 0,2 g) DM-empa rühma, kuid mitte DM-cont rühma.

Mõjutatud DEK-rottidel ilmnes varem tõsine glükoositalumatus, insuliini sekretsiooni puudumine vastusena glükoosikoormusele ja rakkude kadu [14]. Uurisime, kas empagliflosiin parandas glükoositaluvust ja insuliini sekretsiooni ning takistas rakkude kadu. Vere glükoosisisaldus pärast 16-tunnist paastumist oli DM-empa rühmas oluliselt madalam kui DMconti rühmas, nagu ka vere glükoosisisaldus 60–240 minutit pärast glükoosi laadimist (joonis 1C). Vere glükoosisisalduse ajaline muutus DM-empa OGTT-s on peaaegu sarnane DEK tüve mittediabeetiliste kontrollrottide omaga [14]. Glükoosi poolt indutseeritud insuliini sekretsiooni ei toimunud aga kummaski rühmas (joonis 1D). Insuliini immunofluorestsentsvärvimine pankrease saarekestes ei näidanud insuliinisignaale DM-cont rühmas või nõrgad ja kontrollrottidel peaaegu 100 protsenti positiivseid signaale, samas kui kolmel rotil täheldati nõrka insuliini signaali, mis moodustas saarekese pindala kohta 24,2 ± 3,5 protsenti. DM-empa rühm (joonis 2).

Ainevahetus- ja neeruparameetrid ning luu densitomeetria

Metaboolsete parameetrite mõõtmised pärast 12-nädalast raviperioodi näitasid, et toidu tarbimine oli DM-empa rühmas oluliselt madalam kui DM-cont rühmas nii suhteliste (joonis 3A) kui ka absoluutsete (S1 joonis fig) väärtuste puhul. Lisaks oli vee tarbimine (joonis 3B, S1 joonis) ja uriini maht (joonis 3C, S1 fig) DM-empa puhul umbes 50 protsenti madalam kui DM-cont rühmas.

12-nädalase raviperioodi lõpus olid plasma Tcho, Cre, Alb, TP ja Na kontsentratsioonid DM-i kontsentratsioonis oluliselt madalamad kui kontrollrühmas, kusjuures enamik neist vähenes DM-i kontsentratsioonis. rühm, mis näitab osalist taastumist DM-empa rühmas. Eelkõige olid plasma Tcho, TP ja Na kontsentratsioonid oluliselt kõrgemad DM-empa kui DM-cont rühmas, kuigi kõik need kontsentratsioonid olid DM-empa rühmas madalamad kui kontrollrühmas. Plasma Albi ja Cre tasemed olid samuti kõrgemad DM-empa kui DM-cont rühmas, kuid need erinevused ei olnud statistiliselt olulised (tabel 1). Glükoosi, UN, Ca, Na, K, Cl ja valgu eritumine uriiniga oli DM-cont grupis oluliselt suurem kui kontrollrühmas, kusjuures enamik neist suurenemistest leevenesid DM-empa rühmas. Glu, UN, Na, K ja Cl eritumine uriiniga oli DM-empa rühmas oluliselt väiksem kui DM-i rühmas, kuigi kõik need eritumised olid DM-empa rühmas oluliselt suuremad kui kontrollrühmas. . Ca ja valgu suurenenud eritumine uriiniga leevenes ka DM-empa rühmas, kusjuures DM-empa ja kontrollrühmade vahel ei olnud olulisi erinevusi (tabel 2). Välja arvatud Ccre, mis kolme rühma vahel oluliselt ei erinenud, olid kõik uuritud kliirensid ja fraktsioonide eritumised DM-i kontsentratsioonis oluliselt suuremad kui kontrollrühmas (tabel 3). Pealegi, välja arvatud Cglu ja FEglu, mis jäid DM-empa rühmas kõrgemaks, leevendus suurem osa DM-cont rühma suurenemisest DM-empa rühmas. Eelkõige olid Cca, Cna ja Ccl DM-empa puhul oluliselt madalamad kui DM-cont rühmas, kuid jäid DM-empa puhul kõrgemaks kui kontrollrühmas (tabel 3).

Reieluu BMD oli DM-cont'is oluliselt madalam kui kontrollrühmas, kusjuures empagliflosiin taastas reieluu BMD DM-empa rühmas (tabel 4). BMC oli DM-empa puhul suurem kui DM-cont rühmas, kuid erinevus ei olnud statistiliselt oluline (tabel 4)

Neerude patoloogia

Mõjutatud DEK-rottidel ilmnes neerude progresseeruv suurenemine koos laienenud tuubulitega [14]. Kuigi empagliflosiiniravi vähendas järsult vere glükoosisisaldust, ei langenud see

neerude kaal, mis oli DM-empa ja DM-cont rühmas sarnane (2,35±0.08 g vs. 2,24 ±0,08 g). Histoloogiline uuring näitas, et nii DM-cont kui ka DM-empa rottidel oli juksimedullaarsete piirkondade neerutuubulites silmatorkav tõsine laienemine (joonis 4A). Empagliflosiin ei nõrgendanud neerutuubulite laienemist (joonised 4B ja 4C). Kooskõlas sellega oli neerutuubulite kahjustuse biomarkeri L-FABP [20] eritumine uriiniga suurem DM-cont ja DM-empa puhul võrreldes kontrolliga ning DM-cont ja DM-empa vahel ei olnud erinevust. 4D ja 4E). Nagu varem teatatud [14], ei esinenud kontrollis, DM-cont ja DM-empa tüüpilisi glomerulaarseid kahjustusi, nagu hüpertroofia (joonis 4F).

Plasma aminohapete GC-MS analüüs

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

Plasma sarkosiin oli DM-i sisaldusega suurem kui kontrollrühmas, kusjuures empagliflosiin suurendas veelgi plasma sarkosiinisisaldust. Seevastu plasma trüptofaan oli DM-i sisaldusega madalam kui kontrollrühmas, kusjuures empagliflosiin vähendas veelgi plasma trüptofaani (tabel 5). Plasma glütsiini tase oli DM-cont- ja kontrollrühmas sarnane, kuid oli DM-empa-s oluliselt kõrgem kui kahes teises rühmas. Glutamiini ja ornitiini kontsentratsioonid olid DM-i kontsentratsioonis oluliselt madalamad kui kontrollrühmas ja empagliflosiinravi neid ei taastanud. Võrreldes kontrollrühmaga oli plasma aminovõihape oluliselt madalam DM-i rühmas, kusjuures empagliflosiin vähendas selle kontsentratsiooni veelgi. Plasma valiini ja isoleutsiini kontsentratsioonid olid DM-i kontsentratsioonis oluliselt kõrgemad kui kontrollrühmas, kusjuures need kontsentratsioonid taastati empagliflosiiniga töötlemisel kontrolltasemele.

Arutelu

SGLT2 inhibiitorid vähendavad vere glükoosisisaldust insuliinist sõltumatul viisil ja neil on renoprotektiivsed toimed II tüüpi DM-ga patsientidel, aga ka mitmetel loommudelitel [8, 12, 21–23]. Enamik loomkatseid SGLT2 inhibiitoritega on läbi viidud 2. tüüpi DM-iga rasvunud loomadel [22, 24–28]. Paljud II tüüpi DM patsiendid, eriti Aasias, ei ole aga rasvunud [29]. SGLT2 inhibiitorite mõju neerukahjustusega või mitterasvunud diabeediga patsientidele jääb ebaselgeks [29, 30]. Käesolevas uuringus uuriti empagliflosiini mõju ainevahetusele, neerufunktsioonile ja histopatoloogiale DEK-rottidel – uudsel mitte-rasvunud diabeetilise roti mudelil, millel on eelsoodumus laienenud neerudele [14]. Võrreldes rasvunud diabeetiliste loommudelitega, iseloomustas diabeetiliste DEK-rottide fenotüüpi plasma insuliinikontsentratsiooni järkjärguline vähenemine pankrease rakkude kadumise, mitte insuliiniresistentsuse tõttu, nii et diabeetiliste DEK-rottide kehamass ja rasv vähenesid. DM progresseerumine. Lisaks ilmnes diabeetilistel DEK-rottidel suurenenud neeruparenhüüm ja neerude märkimisväärne suurenemine koos neerutuubulite laienemisega [14].

SGLT2 inhibiitorid soodustavad rasvade, lihaste ja aminohapete kasutamist energiaallikatena [31–33], vähendades rasvunud inimeste ja loomade rasvamassi ja kehamassi [28, 34, 35]. Rasvmassi vähenemist ja kaalutõusu vähenemist on täheldatud ka rasvunud diabeetilistel närilistel, keda raviti SGLT2 inhibiitoritega [31]. Lisaks ilmnes nii SGLT2 inhibiitoritega ravitud inimestel kui närilistel kompenseeriv hüperfaagia, et säilitada nende energia- ja toitainete tasakaal [27, 32, 36]. Selles uuringus alandas ravi empagliflosiiniga DEK-rottide veresuhkru taset 24 tunni jooksul, kusjuures need madalamad kontsentratsioonid püsisid kogu 12-nädalase raviperioodi vältel, sarnaselt teiste SGLT2 inhibiitorite uuringutega [15, 24]. Erinevalt varasematest leidudest [27, 28, 36] leidsime, et empagliflosiiniga ravi vähendas toidutarbimist ja nõrgendas adeps-ohjade kadu ja kehamassi suurenemise pärssimist. See ootamatu tulemus oli tõenäoliselt seotud energiatasakaalu paranemisega. Algselt oli glükoosi uriiniga eritumine DM-empa puhul oluliselt madalam kui DM-Cont rottidel, kuigi märgatavalt kõrgem Cglu DM empa rühmas tulenes glükoosi reabsorptsiooni täielikust pärssimisest, kusjuures FEglu oli peaaegu 100 protsenti . Seda avastust toetas veelgi DM-empa rühmas uriiniga eritumise oluline vähenemine, mis on valkude katabolismi parameeter, vaatamata normaalsele BUN-tasemele [37]. Lisaks näitasid plasma TP suurenemine ja uriinivalgu vähenemine DM-empa rühmas, et empagliflosiin parandas valgupeetust. Empagliflosiiniga ravitud rottide glükoosi säilimine ja kasutamine ning kataboolsest seisundist assimileerunud seisundisse pöördumine võis olla tingitud vere glükoositaseme edukast kontrollist.

On näidatud, et SGLT2 inhibiitorid suurendavad uriini mahtu, suurendades tubulaarset reabsorptsiooni, mis kompenseerib kehavedelike ja elektrolüütide kadu [21, 25, 38]. Seetõttu suureneb uriini maht kohe pärast SGLT2 inhibiitorravi alustamist, kuid pikaajaline ravi võib vähendada nii uriini mahtu kui ka veetarbimist [38, 39]. Kuigi plasma Cre tase oli DM-cont ja DM-empa puhul oluliselt madalam kui kontrollrühmas, ei erinenud Ccre oluliselt kontroll-, DM-cont- ja DM-empa-rühmades. Seetõttu, kuna DEK-DM rottidel ei olnud ilmseid tõendeid glomerulaarse hüpertroofia kohta [14], võis DM-i korral glomerulaarne hüperfiltratsioon vaevu tekkida või olla kerge. Lisaks võis suurenenud parenhüümiga neer suurendada nefronite arvu, mis näitab, et nii DM-cont kui ka DM-empa suurenenud neer võib olla seotud plasma Cre taseme langusega. Seetõttu võis vähenenud uriini maht DM-empa rühmas olla tingitud vee reabsorptsiooni paranemisest neerutuubulites, mitte glomerulaarfiltratsiooni kiiruse vähenemisest. Üldiselt nõrgenes elektrolüütide suurenenud eritumine uriiniga DM-cont rühmas DM empa rühmas, mis näitab, et elektrolüütide plasmakontsentratsiooni vähenemist DM-cont rühmas nõrgendas ravi empagliflosiiniga neerutuubulite funktsiooni paranemise kaudu. Seda hüpoteesi toetas nende kliirensi järjekindel vähenemine koos vähenenud fraktsioonide eritumisega DM-empa rühmas.

On teatatud, et SGLT2 inhibiitoritel on luudele kahjulik mõju [31, 40]. Kuna osteoporoos on DM-i tavaline tüsistus, võrdlesime kolmes rotirühmas BMD-d ja BMC-d. BMD ja BMC olid DM-cont'is oluliselt madalamad kui kontrollrühmas, kuid need vähenemised olid DM-empa rühmas nõrgenenud. Veelgi enam, nende BMD ja BMC suurenemisega DM-empa rühmas kaasnes Ca uriiniga eritumise vähenemine. Kuna plasma Ca tase on rangelt reguleeritud, ei olnud kontroll-, DM-cont ja DM-empa rühmades plasma Ca tasemetes olulisi erinevusi. Need leiud viitasid sellele, et negatiivset Ca tasakaalu DM-cont rühmas võib kompenseerida a mobiliseerimine luust vereringesse, kusjuures seda seisundit nõrgendab osaliselt Ca paranenud neerutuubulite funktsioon DM-empa rühmas.

Hüpoproteineemia nõrgenemine DM-empa rühmas võis tuleneda proteinuuria paranemisest. Kuigi glomerulaarne hüperfiltratsioon ja hüpertroofia ei ilmnenud selgelt DM-i rühmas, võib vähenenud vere glükoosisisaldus vähendada Albi glomerulaarfiltratsiooni. Lisaks võis valkude ja aminohapete tubulaarse reabsorptsiooni paranemine aidata kaasa plasmavalkude sünteesile maksas. Mõjutatud DEK-rotte iseloomustavad madalad plasma Tcho kontsentratsioonid [14]. Kuna Albi suurenenud tootmisega kaasneb suurenenud Tcho tootmine maksas [41], võib DM-empa rühma kõrgem plasma Tcho tase olla seotud Albi suurenenud maksa tootmisega. Viimane võis tuleneda suurenenud aminohappe- ja energiavarudest, mis on seotud valgupeetuse ja energiatasakaalu paranemisega.

Hargnenud ahelaga aminohapete (BCAA) homöostaasi määrab suuresti BCAA kataboolne aktiivsus kudedes [42], kusjuures BCAA homöostaasi defekte peetakse insuliiniresistentsuse või diabeetilise seisundi indeksiks [43–45]. Meie aminohapete GC-MS analüüs näitas, et valiini ja isoleutsiini plasmakontsentratsioonid DM-empa rottidel olid võrdsed mittediabeetiliste kontrollrottide omadega, mis viitab sellele, et ravi empagliflosiiniga leevendas valkude katabolismi ja diabeetilisi seisundeid. Lisaks täheldasime, et empagliflosiini spetsiifiline plasma glütsiini taseme tõus oli seotud diabeedi paranemisega. Huvitaval kombel on inimese diabeedi korral täheldatud madalat glütsiini taset plasmas [46] ja leiti, et glütsiini manustamine kutsub esile antioksüdatiivse ja renoprotektiivse toime streptotsototsiinist põhjustatud diabeediga rottidel [47]. Seetõttu võib glütsiini kõrgemat taset plasmas seostada oksüdatiivse stressi ja diabeetilise nefropaatia nõrgenemisega diabeedihaigetel ja empagliflosiiniga ravitud katseloomadel. Aminohapete taset plasmas mõjutab nende kasutamine kudedes ja elundites kogu kehas ning see sõltub anaboolsetest ja kataboolsetest tingimustest. Vaja on täiendavaid uuringuid, et teha kindlaks, kuidas nende ja teiste aminohapete taseme muutused on seotud metaboolse seisundiga.

SGLT2 inhibiitorid avaldavad renoprotektiivset toimet, pärssides mitmeid neeruhaigustega seotud protsesse, nagu albuminuuria ja suurenenud neerukaal [15, 24, 48, 49]. Neerutuubulite laienemine ja proteinuuria on diabeediga seotud neerukahjustuse markerid [50]. Siiski ei suutnud empagliflosiin meie rotimudelis pärssida neerutuubulite laienemist ja suurendada L-FABP eritumist uriiniga, kuid parandas oluliselt tubulite funktsiooni. See lahknevus viitas sellele, et empagliflosiiniga seotud tubulite funktsiooni paranemine tulenes väiksematest või sekundaarsetest mõjudest, millega ei kaasnenud orgaanilisi muutusi neerutuubulites. Teise võimalusena, kuna kahjustatud DEK-rottidel säilisid normoglükeemilistes tingimustes tubulaarne laienemine koos vigastuse ja suurenenud neerukaaluga, võisid need muutused olla pigem DEK-rottide diabeediga seotud geneetilised tunnused kui hüperglükeemia sekundaarsed.

Kuigi SGLT2 inhibiitorid on suunatud neerutuubulitele, on vähe teada nende ainete mõju kohta üldistele muutustele neerutuubulite funktsioonis, välja arvatud see, et glomerulaarne hüpertroofia hõlmab naatriumi ja glükoosi tubulaarset ühistransporti [13, 22, 24]. Uuringud SGLT2 inhibiitorite mõju kohta tubulaarsele funktsioonile näitasid, et vee reabsorptsiooni mitte ainult ei pärssinud osmootne diurees, vaid seda suurendas akvaporiini ja uurea transporteri ülesreguleerimine seni määramata mehhanismi abil [21, 25]. Diabeediga patsientide neerutuubulaarseid epiteelirakke ei mõjuta mitte ainult toruvedelikus sisalduva glükoosi osmootne rõhk, vaid liigne glükoos ja naatrium, mis on rakkudesse SGLT2 kaudu omastatud. Hiljuti on oksüdatiivset stressi neerutuubulites peetud oluliseks diabeetilise nefropaatia (DN) progresseerumisel ja ipragliflosiin näitas renoprotektiivset toimet, hoides ära ROS-i ületootmise neerutuubulites [51]. Kuigi mõjutatud DEK-rottidel DN-i tõsist progresseerumist ei leitud, võib oksüdatiivne stress kahjustada tubulaarset funktsiooni. Praegu puudub ühtne konsensus SGLT2 inhibiitorite mõju kohta tubulaarsele funktsioonile, mis viitab vajadusele täiendavate uuringute järele, et selgitada välja mehhanism, mille abil empagliflosiin parandab DEK-rottide tubulaarset funktsiooni.

On leitud, et SGLT2 inhibiitorid säilitavad rakumassi 1. tüüpi DM ja rasvunud 2. tüüpi DM mudelites [52, 53]. Tuvastasime nõrkade insuliinisignaalidega rakud DM-empa rühmas, kuid mitte ühtegi rakku DM-cont rühmas. Siiski näitas OGTT mõõdukat glükoositaluvuse paranemist ilma insuliini sekretsioonita DM-empa rühmas. Kuna empagliflosiini poolväärtusaeg on lühike, umbes 8 tundi, ei olnud pärast 16-tunnist tühja kõhuga täheldatud veresuhkru taseme langus ja glükoositaluvuse paranemine tingitud empagliflosiini jäägi toimest. Seetõttu viitavad need leiud sellele, et empagliflosiini pikaajaline manustamine võib parandada glükoosi metabolismi ja mõõdukalt vähendada vere glükoosisisaldust pärast ühekordset glükoosisisaldust insuliinist sõltumatul viisil.

Kokkuvõttes näitavad käesoleva uuringu tulemused, et empagliflosiin parandab DEK-rottidel süsteemset metabolismi ja neerutuubulite funktsiooni, kuigi nende loomade ainulaadse vastuse empagliflosiinile aluseks olevad üksikasjalikud mehhanismid jäävad ebaselgeks. Need leiud näitavad ka, et DEK-rotid on kasulik mudel SGLT2 inhibiitorite mitme bioloogilise toime uurimiseks ja hindamiseks diabeedi korral.

Viited

1. Rahvusvaheline Diabeedi Föderatsioon. IDF Diabeedi atlas, 9. väljaanne. Brüssel, Belgia 2019.

2. Ameerika Diabeediassotsiatsioon. Diabeedi klassifikatsioon ja diagnoosimine. Jaotis 2. Diabeedi arstiabi standardid-2019. Diabeedihooldus. 2019; 42 (lisa 1): S13–S28.

3. Zheng Y, Ley SH, Hu FB. II tüüpi suhkurtõve ja selle tüsistuste globaalne etioloogia ja epidemioloogia. Nat Rev Endokrinool. 2018; 14(2):88–98.

4. Lin CC, Li CI, Liu CS, Lin WY, Lin CH, Yang SY jt. II tüüpi diabeediga patsientide lõppstaadiumis neeruhaiguse riskiennustusmudeli väljatöötamine ja valideerimine. Sci Rep. 2017; 7(1):10177.

5. Valderra´bano F, Jofre R, Lo´pez-Go´mez JM. Elukvaliteet lõppstaadiumis neeruhaigusega patsientidel. Olen J Kidney Dis. 2001; 38(3):443–64.

6. Saal PM. Diabeetilise nefropaatia progresseerumise ennetamine. Diabeedi spekter. 2006; 19(1): 18–24.

7. Hsia DS, Grove O, Cefalu WT. Naatrium-glükoosi kaastransporteri-2 inhibiitorite värskendus suhkurtõve raviks. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2017; 24(1):73–79.

8. Perkovic V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM jt. Kanagliflosiin ja neerude tagajärjed II tüüpi diabeedi ja nefropaatia korral. N Engl J Med. 2019; 380(24):2295–2306.

9. Sarafidis PA, Tapas A. Empagliflozin, kardiovaskulaarsed tulemused ja suremus 2. tüüpi diabeedi korral. N Engl J Med. 2016; 374(11):1092.

10. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A jt. Dapagliflosiin ja kardiovaskulaarsed tulemused II tüüpi diabeedi korral. N Engl J Med. 2019; 380(4):347–357.

11. Brown E, Rajeev SP, Cuthbertson DJ, Wilding JPH. Naatrium-glükoosi kaastransporteri-2 inhibiitorite toimemehhanismi, metaboolse profiili ja hemodünaamilise toime ülevaade. Diabeet Obes Metab. 2019; 21 Suppl 2:9–18.

12. Heerspink HJL, Stefansson BV, Chertow GM, Correa-Rotter R, Greene T, Hou FF jt. Dapagliflosiini ja kroonilise neeruhaiguse (DAPA-CKD) randomiseeritud kontrollitud uuringu põhjendus ja protokoll ning kõrvaltoimete ennetamine. Nephrol Dial siirdamine. 2020; 35(2):274–282.

13. Bae JH, Park EG, Kim S, Kim SG, Hahn S, Kim NH. Naatrium-glükoosi kaastransporter 2 inhibiitorite mõju neerude tulemustele II tüüpi diabeediga patsientidel: randomiseeritud kontrollitud uuringute süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs. Sci Rep. 2019; 9(1):13009.

14. Domon A, Katayama K, Tochigi Y, Suzuki H. Uudse mitteraseda 2. tüüpi diabeedi roti mudeli iseloomustus laienenud neerudega. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929

15. Vallon V, Gerasimova M, Rose MA, Masuda T, Satriano J, Mayoux E jt. SGLT2 inhibiitor empagliflosiin vähendab neerude kasvu ja albuminuuriat võrdeliselt hüperglükeemiaga ning takistab diabeetiliste Akita hiirte glomerulaarset hüperfiltratsiooni. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306(2): F194–204.

16. Vickers SP, Cheetham SC, Headland KR, Dickinson K, Grempler R, Mayoux E jt. Naatrium-glükoosi kaastransporter-2 inhibiitori empagliflosiini kombinatsioon orlistaadi või sibutramiiniga parandab veelgi rasvunud rottide kehakaalu langust ja glükoosi homöostaasi kohvikutoitudel. Diabeet Metab Syndr Obes. 2014; 7:265–75.

17. Glastras SJ, Chen H, The R, McGrath RT, Chen J, Pollock CA jt. Diabeedi, rasvumise ja sellega seotud neeruhaiguste hiiremudelid. PLoS One. 2016; 11(8):e0162131.

18. Badawy AA, Morgan CJ, Turner JA. Phenomenex EZ:faast™ aminohapete analüüsikomplekti kasutamine plasma trüptofaani ja selle aju omastamise konkurentide kontsentratsioonide kiireks gaaskromatograafiliseks määramiseks. Aminohapped. 2008; 34(4):587–96.

19. Michishita M, Saito N, Nozawa S, Furumoto R, Nakagawa T, Sato T jt. Metaboliitide profileerimine koerte rinnanäärme adenokartsinoomi rakuliinide sfääri moodustavates rakkudes, kasutades gaasikromatograafia-massispektromeetriat. J Vet Med Sci. 2019; 81(9):1238–1248.

20. Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. Urinary fatty acid-binding protein in renal disease. Clin Chim Acta. 2006; 374(1–2):1–7.