ELOVL2 soodustab vähi progresseerumist, inhibeerides rakkude apoptoosi neerurakulise kartsinoomi korral
Mar 20, 2022
Abstraktne. Neerudrakukartsinoom (RCC) on agressiivne urogenitaalsüsteemi pahaloomuline kasvaja, mida on seostatud halva prognoosiga, eriti metastaasidega patsientidel. Selle peamised alatüübid on selgerakuline RCC (ccRCC), papillaarne PCC (pRCC) ja kromofoobne RCC (chRCC). intratsellulaarsete lipiidipiiskade (LD) olemasolu peetakse ccRCC tunnuseks. Muutunud lipiidide metabolismi tähtsust ccRCC-s on laialdaselt tunnustatud. Väga pika ahelaga rasvhapete (ELOVL) pikenemine katalüüsib rasvhapete (FA) pikenemist, moduleerides lipiidide koostist ja on vajalik normaalsete kehafunktsioonide jaoks. Elongaaside kaasamine RCC-sse jääb siiski ebaselgeks. Käesolevas uuringus uuriti ELOVL2 ekspressiooni ccRCC-s; eelkõige täheldati primaarsetes kasvajates seitsme ELOVLisosüümi kõrget taset. Märkimisväärne on see, et kõrgenenud ELOVL2 ekspressioonitasemeid täheldati ccRCC-s, samuti pRCC-s ja chRCC-s. Lisaks seostati ELOVL2 kõrgemat taset märkimisväärselt ccRCC ja pRCC-ga patsientide halva prognoosi esinemissageduse suurenemisega. CRISPR/Cas{5}}vahendatud ELOVL2 katkestamine põhjustas pika ahelaga polüküllastumata FA-de pikenemise pärssimise ja suurendas LD tootmistneeru-vähirakud. Veelgi enam, ELOVL2 ablatsioon põhjustas rakkude proliferatsiooni pärssimise apoptoosi indutseerimise kaudu in vitro ja kasvaja kasvu nõrgenemise in vivo. Üldiselt annab käesolev uuring uue ülevaate kasvaja proliferatsioonimehhanismidest, mis hõlmavad lipiidide metabolismi, ja viitab sellele, et ELOVL2 võib olla atraktiivne uus sihtmärk RCC-ravi jaoks.
Märksõnad:neerurakuline kartsinoom, lipiidide tilk, rakkude proliferatsioon, neerud, neerud
Sissejuhatus
Neerurakk-kartsinoom (RCC) on sageli esinev ja surmav pahaloomuline kasvaja, mis moodustab umbes 2 protsenti kõigist vähijuhtudest ja sellega seotud surmajuhtumitest kogu maailmas (1), mille peamised alatüübid on selgerakuline RCC (ccRCC), papillaarne PCC (pRCC) ja kromofoob. RCC (RCC). Kõigist RCC alatüüpidest on ccRCC kõige levinum histoloogiline ilming ja selle patogeneesi iseloomustab hüpoksiast indutseeritavate tegurite (HIF) konstitutiivne aktiveerimine von Hippel-Lindau (VHL) kasvaja supressorgeeni funktsiooni kaotuse tõttu. (1). Veresoonte endoteeli kasvufaktori (VEGF) või imetajate rapamütsiini (mTOR) signaalide ja immuunkontrollpunkti inhibiitorite metastaatilise haiguse vastu on välja töötatud mitmesuguseid sihipäraseid ravimeetodeid. Siiski on haiguse progresseerumine enamikul patsientidest vältimatu (1, 2).
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
ccRCC tunnuseks on intratsellulaarsete lipiidipiiskade (LD-de) rohkus, mis koosnevad neutraalsest lipiidisüdamikust, mis sisaldab triglütseriide (TG-sid) ja kolesterooli estreid (CE-sid), mida ümbritseb fosfolipiidide monokiht (3). LD-d on dünaamilised organellid, mis vastutavad lipiidide omastamise eest. ja säilitamiseks ning neid kasutatakse homöostaasi säilitamiseks, energiatootmise hõlbustamiseks ja kaitseks erinevat tüüpi stressi eest või membraani biogeneesi säilitamiseks kasvajarakkude kiire kasvu ajal mitut tüüpi vähi korral (4). Tegelikult on varasemad uuringud näidanud, et LD-d aitavad kaasa ccRCC-le. progresseerumine (5,6).
On teatatud, et rasvhapped (FA), mis moodustavad lipiidide põhikomponendi, toimivad substraatidena energia salvestamisel, membraani sünteesil ja signaalmolekulide tootmisel. Pikendamine ja desaturatsioon on pika ahelaga FA-de (LC-FA) de Novo sünteesi kesksed etapid, kusjuures FA funktsiooni ja metaboolse saatuse määravad tegurid (7). Stearoüül-CoA desaturaas 1 (SCD1), mis on rasvatsüüldesaturaasi perekonda, on põhjalikult uuritud ccRCC-s (6.8.9). On näidatud, et suurenenud SCD1 ekspressioon toetab elujõulisust, samas kui SCD1 väikese molekuli inhibiitor (A939572) on näidatud, et see pärsib rakkude proliferatsiooni ccRCC-s (8.9). Enamgi veel. Yang jt (10) näitasid, et sterooli regulatoorseid elemente siduv valk 1 (SREBP1) soodustas lipiidide desaturatsiooni FA-happe desat-uraas 1 (FADSI) kaudu enne NF-xB signaaliülekande aktiveerimist, et soodustada rakkude proliferatsiooni ccRCC-s. Siiski on elongaaside võimalikud rollid RCC-s ebaselged.
On teatatud, et imetajatel katalüüsib algseid ja kiirust kontrollivaid FA kondensatsioonireaktsioone elongaasi ensüümide perekond, mida nimetatakse väga pika ahelaga FA-de (ELOVL) pikenemiseks. Praeguseks on tuvastatud seitse ELOVL-i liiget, mille saab üldiselt jagada küllastunud ja monoküllastumata FA-de (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 ja ELOVL7) või polüküllastumata FA-de (PUFA-de; ELOVL2, ELOVL4 ja ELOVL5) jaoks spetsiifilisteks. Lucarelli jt (9) näitasid PUFA-de märkimisväärset kuhjumist ning ELOVL2 ja ELOVL5 suurenenud ekspressiooni ccRCC-s. Tuleb märkida, et on näidatud, et süsteemne dokosaheksaeenhape (DHA) toodetakse endogeenselt ja kontrollib de novo lipogeneesi, reguleerides samal ajal lipiidide säilitamist sterooli regulatoorseid elemente siduva transkriptsioonifaktori 1 (SREBPF1) sõltumatul viisil, kuna see on tingitud ELOVL2 ablatsioonist. hiired (11). Lisaks on näidatud, et ELOVL2 üleekspressioon soodustab LD akumuleerumist, suurendades FA omastamist nii preadipotsüütide rakuliini 3T3-LI kui ka F442A rakkudes (12). Varasemad in vitro uuringud vähirakkude jaoks eksogeenselt manustatud DHA-ga. on näidanud, et DHA avaldab vähirakkudele kasvajavastast, põletikuvastast ja apoptootilist toimet (13-15). Siiski on ELOVL2 võimalik roll ccRCC progresseerumisel lipiidide metabolismi moduleerimise kaudu suuresti uurimata.
Käesolevas uuringus uuriti ELOVL2 inccRCCprogressiooni rolli primaarse ccRCC ja normaalse transkriptsioonilise profiiliga.neerudproovid, mis näitab, et ELOVL2 on ccRCC-s üleekspresseeritud ja on ELOVL isosüümide hulgas üleesindatud. Pange tähele, et ELOVL2 ekspresseeriti üle ka ccRCC-s, aga ka pRCC-s ja RCC-s, mis on märkimisväärselt seotud CCR CCR pRCC-ga patsientide halva prognoosiga. Lisaks näidati, et ELOVL2 inhibeerimine mõjutab lipiidide metabolismi ja pärsib rakkude proliferatsiooni apoptoosi soodustamise kaudu, vähemalt osaliselt endoplasmaatilise retikulumi (ER) homöostaasi häirimise kaudu.neeruvähkrakud. Käesoleva uuringu tulemused näitasid, et ELOVL2 võib olla potentsiaalne uudne terapeutiline sihtmärk RCC raviks.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
materjalid ja meetodid
Rakuliinid ja kultuurid. 293T (RCB2202) ja OS-RC-2 (RCB0735) rakuliinid osteti ettevõttest RIKEN BioResource Center, samas kui 786-O ja ACHN rakuliinid osteti ATCC-st; SK-RC-52 rakud olid lahke kingitus DrJ.G.Oldilt (Memorial Sloan Kettering Cancer Center). RPTEC rakuliin, mis on saadud inimese epiteelirakkudestneeru-proksimaalne tuubul, osteti ettevõttelt Lonza Group, Ltd. (CC-2553). ACHN, 786-O, SK-RC-52 ja OS-RC-2 rakke kultiveeriti RPMI-1640 söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS), temperatuuril 37 ˚C 5-protsendilise niisutatud CO2 atmosfääris. 293T rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS) 37 °C juures 5 protsenti niisutatud CO2 atmosfääris. RPTEC rakke kultiveeritineeru-epiteeli kasvukeskkond (REGM™) Bulletkit™ (CC-3190; Lonza Bioscience) temperatuuril 37 °C 5% niisutatud CO2 atmosfääris.
Patsiendid ja ccRCC proovid. RCC kuded ja külgnevad normaalsedneerudkoed 46 patsiendilt, kellele tehti radikaalne või osaline nefrektoomia, saadi Tsukuba Ülikooli haiglast aastatel 2006–2015 vastavalt Tsukuba ülikooli eetikakomitee poolt heaks kiidetud protokollidele (kinnitus nr H28-104). Kõik patsiendid andsid enne operatsiooni läbimist kirjaliku teadliku nõusoleku. Kasvaja staadiumid määrati vastavalt Rahvusvahelise Vähikontrolli Liidu TNM-i staadiumile (16). Patoloogilised hinded klassifitseeriti neljaastmelise Fuhrmani hindamissüsteemi järgi (17). Kõik patsiendi omadused on kokku võetud tabelis SI RNA ekstraheerimine ja cDNA süntees. Külmutatud kudedest ekstraheeriti kogu RNA janeeru-vähirakud, kasutades TRIzol® reagenti (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Pärast RNA puhastamist pöördtranskribeeriti RNA cDNA-ks, kasutades suure võimsusega cDNA pöördtranskriptsiooni komplekti (kat. nr 4368814; Thermo Fisher Scientific, Inc.) vastavalt tootja juhistele.
Pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (RT-qPCR). Geeniekspressioonitasemed kvantifitseeriti, kasutades 7500 Fast Real-Time PCR masinat koos Fast SYBR-Green Master Mixiga (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Tsüklitingimused olid järgmised: esialgne hoidmine temperatuuril 95 °C 20 sekundit, 40 tsüklit temperatuuril 95 °C 3 sekundit ja 60 °C 30 sekundit, millele järgnes sulamiskõver vahemikus 95 °C 15 sekundit kuni 60 °C. C 1 min. Sisekontrollina kasutati hüpoksantiinfosforibosüültransferaasi 1 (HPRT1). Kõik praimeri järjestused on loetletud tabelis SII. Apoptoosiga seotud geenide hindamiseks proapoptootiliste geenide, Bcl-2-ga seotud X-valgu (BAX), Bcl-2 homoloogse antagonisti/tapja (BAK), forbool-12-müristaat-13- suhtelised ekspressioonitasemed. Analüüsiti atsetaadiga indutseeritud valku 1 (PMAIP1/NOXA) ja p53 ülesreguleeritud apoptoosi modulaatorit (BBC3/PUMA) ning anti-apoptootilise geeni BCL2 ja indutseeritud müeloidse leukeemia rakkude diferentseerumisvalgu geeni (MCL1). Suhtelised geeniekspressiooni tasemed määrati 2-ΔΔCq meetodi abil (18).
Western blot analüüs. Western blot analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (19). Rakud lüüsiti lüüsipuhvris (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS ja proteaasi inhibiitor) ja töödeldi jääl ultraheliga. Lüsaate tsentrifuugiti kiirusel 1,000 xg 20 minutit temperatuuril 4 °C ja supernatandid koguti proovidena. Proovide valgu kvantifitseerimine viidi läbi Quick Start Bradford Protein assay abil (kat. nr 5000202JA; Bio-Rad Laboratories, Inc.). Proovidele viidi läbi 10% SDS-PAGE ja eraldatud tooted kanti seejärel PVDF membraanidele.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Membraanid blokeeriti ECL Prime blokeeriva ainega (kat. nr RPN418V; Cytiva) 60 minutit toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti membraane üleöö 4 °C juures järgmiste antikehadega: seriini/treoniini proteiini kinaas/endoribonukleaasi inositooli vajav ensüüm 1 (anti-IRE1 ; 1:200; #3294, Cell Signaling Technology, Inc.), anti-fosforüülitud IRE1 (anti-p-IRE1 ; 1:200; NB100-2323, Novus Biologicals, LCC), anti-C/EBP homoloogne valk (anti-CHOP; 1:200; MA1-250, Thermo Fisher Scientific, Inc .). Küüliku- või hiirevastase immunoglobuliini G HRP-ga seotud terve eesli Ab (kat. nr NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) kasutati sekundaarsete antikehadena vahekorras 1:10, 000. Western blotid visualiseeriti ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) abil, kasutades Fujifilm LAS-4000 kujutist ja LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). -aktiini kasutati sisekontrollina (1:10 000, kat. nr A5316; Sigma-Aldrich).
Geeniekspressiooni bioinformaatika analüüs. Vähi genoomi atlase (TCGA) andmebaasis RCC-ga patsientidelt kogutud primaarsete kasvajate kliinilised ja RNA-sekveneerimise (RNA-seq) andmed laaditi alla Genomic Data Commonsi (GDC) andmeportaalist (20). Kokku uuriti 1005 (880 haiget ja 125 kontrollproovi), sealhulgas 530 haiget ja 71 kontrollproovi.neeru neerudselgerakulise kartsinoomi kohort (KIRC; ccRCC), 286 haiget ja 31 tervet emakakaela proovineeru neerudpapillaarrakulise kartsinoomi kohort (KIRP; pRCC) ja 64 haiget ja 23 tervet proovi neerukromofoobide kohordi (KICH; chRCC) jaoks. ELOVL2 geeniekspressiooni urogenitaalvähi proovides analüüsiti normaalsete ja kasvajakudede geeniekspressiooni andmebaasi (GENT2) abil. Geeniekspressiooni andmed laaditi alla U133 Plus 2 (GPL570) platvormi geeniekspressiooni omnibussi (GEO) avalikust hoidlast (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).
Plasmiidid ja lentiviiruse transduktsioon. Varasemates uuringutes kirjeldatud ELOVL2 (22, 23) väikesed juuksenõela RNA-d (shRNA-d) subklooniti lentiviiruse vektorisse pLKO.1 (plasmiid #8453; Addgene, Inc.). ShRNA vektori konstrueerimisel kasutatud oligonukleotiidjärjestused on loetletud tabelis SIII. Lentiviirused genereeriti 293T rakkudes nelja plasmiidi trans-transfekteerimisega, sealhulgas lentiviiruse vektor (pLKO-shControl või pLKO-shELOVL2), pMDLg/pRRE (plasmiid #12251; Addgene, Inc.), pRSV-Rev (plasmiid #12253). Addgene, Inc.) ja pMD2.G (plasmiid #12259; Addgene, Inc.), kasutades Lipofectamine 2000® transfektsioonireagenti (Thermo Fisher Scientific, Inc.). 48 tundi pärast transfektsiooni koguti viirust sisaldavad supernatandid ja filtreeriti nakatumiseks läbi 0,45 µm filtri. Viiruse transduktsioonide jaoks inkubeeriti pLKO-shControl või pLKO-shELOVL2 lentiviiruseid 786-O, ACHN ja SK-RC-52 rakkudega üleöö temperatuuril 37 ˚C niisutatud rakukultuuri inkubaatoris. Rakud valiti puromütsiini juuresolekul 24 tundi pärast nakatumist. Subkloonide stabiliseerimiseks kultiveeriti rakke puromütsiiniga söötmes 1 kuu temperatuuril 37 ˚C niisutatud rakukultuuri inkubaatoris ning ellujäänud kogumeid kasutati ekspressiooni- ja proliferatsioonianalüüsideks.
Üleekspressioonikatseteks transfekteeriti OSRC-2 rakud pCMV6 tühja vektoriga (plasmiid #PS100001; Origene Technologies, Inc.) või pCMV6-ELOVL2-ga (plasmiid #RC209232; Origene Technologies, Inc.) temperatuuril 37 ˚C niisutatud rakukultuuris. inkubaatoris, kasutades Lipofectamine 3000® transfektsioonireaktiivi (Thermo Fisher Scientific, Inc.), vastavalt tootja juhistele. Rakke kasutati näidatud testides 48 tundi pärast transfektsiooni. CRISPR/Cas9 disain ja kloonimine. Plasmiid pX330-U6-kimäärne_BB-CBh-hSpCas9 (pX330) oli Feng Zhangi (Addgene, Inc.; plasmiid #42230) kingitus (24). ELOVL2 CRISPR-i ühejuhised (sg) järjestused olid spetsiaalselt suunatud ELOVL2 eksonile 2 (sgELOVL2 #1) ja eksonile 3 (sgELOVL2 #2 ja #3), kasutades CRISPRi disainitööriista (GE Healthcare Dharmacon, Inc.;‑discovery.com/gene-editing/crispr-cas9/crispr-design-tool/) enne pX330-sse kloonimist. CRISPR-i juhisjärjestus ühe juhiku juhtimiseks (sgControl) töötati varem välja (25). Üksikjuht-RNA-de (sgRNA-de) oligonukleotiidjärjestused on loetletud tabelis SIII
Seejärel külvati ACHN-rakud 6-augulistele plaatidele (1,4x1{7}}5 rakku süvendi kohta) ja kaastransfekteeriti 2 tundi hiljem 2 µg pX330-ekspresseeritud sgRNA-de ja 0,2 µg pCI-neo vektoriga (Promega Corporation; kat. nr E1841) temperatuuril 37 ˚C niisutatud rakukultuuri inkubaatoris, kasutades FuGENE HD-d (Promega Corporation; kat. nr E2312). 24 tundi pärast transfektsiooni rakendati 400 µg/ml G418 7–10 päevaks ja rakkudel lasti 2 või 3 päeva taastuda. Kui rakud olid lähenemas liitumisele, külvati need hõredalt 10 cm tassidesse. 2 või 3 nädala pärast eraldati märgatavad kolooniad, kasutades kloonimiskettaid (MilliporeSigma; kat. nr Z374431-100EA). Üksikuid kloone laiendati ja hinnati sihtpiirkonna Sangeri sekveneerimise teel väljalangemise olekut.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Rakkude proliferatsiooni testid. Rakkude proliferatsiooni hinnati MTT-testi abil rakuloenduskomplektiga 8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt öeldes külvati rakud 96 süvendiga plaatidele ja 72 tunni pärast lisati 10 µl WST-8. OD460 mõõdeti pärast 1-tunnist inkubeerimist 37 °C juures. Subkutaanne ksenotransplantatsioon. BALB/c nude (nu/nu) emased hiired (n=12; 6–8 nädala vanused) osteti ettevõttest Charles River Laboratories, Inc.. Hiiri hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes 12-aastases kohas. h valguse/pimeduse tsükkel, kus on ad libitum juurdepääs toidule ja veele. Subkutaansete ksenotransplantaadi testide jaoks süstiti 100 µl PBS-s suspendeeritud 1x107 rakku subkutaanselt paremasse külge, kasutades 24G nõela ja kasvaja mahtu mõõdeti kord nädalas. Kasvaja maht arvutati valemiga: mm3=pikkus x laius x kõrgus x 0,52 (26). 90 päeva pärast kõik loomad surmati ja ksenotransplantaadi kasvajad lõigati välja. Loomad tuimastati 2-protsendilise isofluraaniga enne emakakaela dislokatsiooniga surmamist
Ksenotransplantaadi kasvajate formaliiniga fikseeritud ja parafiiniga manustatud (FFPE) proovid lõigati enne deparafiniseerimist ja rehüdratsiooni 4 µm paksusteks osadeks. Antigeeni otsimiseks töödeldi sektsioone mikrolaineahjus 21 minutit sidrunhappepuhvris. Pärast antigeeni otsimise protseduuri blokeeriti endogeense peroksidaasi aktiivsus 3% H2O2-ga 25 minutiks ja slaide inkubeeriti Ki-67 antikehaga (1:200; Dako; Agilent Technologies, Inc.; M7240) temperatuuril 4 °C üleöö. Immunohistokeemiline reaktsioon visualiseeriti, kasutades sekundaarset antikeha Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc, kat. nr 424151), kasutades kromogeenina diaminobensidiini. Kõik loomkatsed kiitis heaks Tsukuba ülikooli loomkatsete komitee ja kõik katsed viidi läbi vastavalt Tsukuba ülikooli loomkatsete eeskirjadele (kinnitus nr 20-370). Apoptoosi testid. Apoptoosi hinnati, kasutades Caspase-Glo® 3/7 analüüsisüsteemi (Promega Corporation; kat. nr G8090), anneksiin-V-FLUOS värvimiskomplekti (Roche Diagnostics; kat. nr 11858777001) ja JC-1 mitokondriaalse membraani potentsiaali. Analüüsikomplekt (Cayman Chemical Company; kat. nr 10009172), vastavalt tootja juhistele.
LD-de värvimine. Rakud külvati klaasist katteklaasidele 60mm tassidesse ja kultiveeriti oleiinhapet (200 µM) sisaldava söötmega temperatuuril 37 ˚C üle öö 5% CO 2 inkubaatoris. Seejärel sööde aspireeriti ja rakke pesti kaks korda PBS-ga enne fikseerimist 4% formaldehüüdiga (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 5 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-ga ja inkubeeriti 0,5 µM Lipi-Greeniga (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) 30 minutit pimedas temperatuuril 37 °C. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-ga ja katteklaasid paigaldati alusklaasidele, kasutades VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium koos DAPI-ga (Vector Laboratories, Inc.; kat. nr H-1200). Värvitud rakkude pildid saadi BZ-X710 fluorestsentsmikroskoobiga (Keyence Corporation). Elusrakke inkubeeriti 0,5 µM Lipi-Greeniga Hanksi tasakaalustatud soolalahuses (HBSS) 30 minutit, seejärel pesti kaks korda HBSS-s, resuspendeeriti 1 mM EDTA/PBS-s (pH 8,0) 0,5 protsendilise BSA-ga ja lasti läbi rakusõela. . Rakke analüüsiti Galliose voolutsütomeetril (Beckman-Coulter, Inc.) ja andmeid analüüsiti FlowJo v10 tarkvara (FlowJo LLC) abil.
ER-jälgija värvimine. ACHN-rakud (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2-1 ja ACHN/sgELOVL2-2) külvati klaasist katteklaasidele 6{{20}}-mm tassidesse ja kultiveeriti 37˚C juures 48 tundi. 5% CO2 inkubaator. Seejärel sööde aspireeriti ja rakke pesti kaks korda HBSS-iga enne fikseerimist 4% formaldehüüdiga (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 5 minutit toatemperatuuril. Seejärel pesti rakke kaks korda HBSS-ga ja inkubeeriti 500 nM ER Tracker Rediga (Thermo Fisher Scientific, Inc.; kat. nr E34250) 2 tundi pimedas temperatuuril 37 °C. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-ga ja katteklaasid paigaldati klaasalustele. Värvitud rakkude pildid saadi BZ-X710 fluorestsentsmikroskoobiga (Keyence Corporation). Elusrakke inkubeeriti 500 nM ER Trackeriga HBSS-s 30 minutit, seejärel pesti kaks korda HBSS-is, resuspendeeriti 1 mM EDTA/PBS-s (pH 8,0) 0,5% BSA-ga ja lasti läbi rakusõela. Rakke analüüsiti Galliose voolutsütomeetril ja andmeid analüüsiti FlowJo v10 tarkvara abil.
Gaasikromatograafia-massispektromeetria (GC-MS). Kogu lipiidide ekstraheerimine rakupelletitest viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (27). Viidi läbi ekstraktide hüdrolüüs ja derivatiseerimine FA metüülestriteks (FAME). Konjugeeritud FA-de sisestandardite jaoks C20:4 (ω-6), C20:5 (ω-3), C22:5 (ω-6), C22:5 (ω-3) ja C22 :6 (ω-3) FAME-d osteti ettevõttelt MilliporeSigma või Cayman Chemical Company. GC-MS analüüs viidi läbi, kasutades GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) koos Omegawax® kapillaari GC kolonniga (MilliporeSigma; kat. nr 24136). Temperatuurigradienti tõsteti algselt 70 °C-lt 150 °C-le kiirusega 20 °C minutis ja 150 °C-lt 280 °C-le kiirusega 8 °C minutis, seejärel alandati 280 °C-lt 200 °C-le kiirusega 15 ˚C minutis. Proovi süstimine viidi läbi jaotuseta režiimis, süstides 1,0 µl proovi. MS analüüsi jaoks määrati iooniallika ja liidese temperatuur vastavalt 200 ˚ ja 270 ˚C. Andmed saadi täisskaneerimise režiimis (30–600 m/z) 70 eV ionisatsioonipinge all. FAME-d tuvastati retentsiooniaja ja elektronionisatsiooni-MS (EI-MS) spektri vastavuse alusel FAME-standarditele. FAMEde suhteline kogus arvutati, võrreldes proovi massi keskmist piigi pindala. Iga proovi mõõdeti sõltumatult kolm korda.
Statistiline analüüs. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades tarkvara JMP 10 (SAS Institute, Inc.), GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) või R-paketti (versioon 4.0.2; RStudio, Inc.). Kahe rühma vaheliste erinevuste olulisust hinnati paaritu Studenti t-testi või Mann-Whitney testi abil. Kolme või enama rühma vaheliste erinevuste olulisust hinnati ühesuunalise ANOVA abil koos post hoc võrdlustega, kasutades Dunnetti testi või Kruskal-Wallise testi, millele järgnes Dunni post hoc test Bonferroni korrektsiooniga. Elulemuskõverad koostati Kaplan-Meieri meetodil ja kõverate erinevust hinnati log-rank testi abil. Patsiendid jagati kahte rühma, madala ekspressiooni või kõrge ekspressiooniga rühma, kasutades keskmise ekspressiooni väärtuste piirväärtust. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Tulemused
ELOVL2 on RCC-s väga üleekspresseeritud. Seitsme ELOVL isoensüümi arvukust vastavates normaalsetes ja kasvajakudedes uuriti esmalt käesolevas kohordis, mis näitas, et ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 ja ELOVL7 ekspressioonitasemed olid ccRCC kudedes kõrgenenud (joonis 1A). Nende tulemuste kinnitamiseks uuriti ELOVL isosüümi geeni ekspressiooni vastavates normaalsetes ja kasvaja kudedes, kasutades TCGA andmebaasi (KIRC kohort). Kinnitati, et ELOVL2 mRNA ekspressioon oli kõige kõrgemal ja märkimisväärselt kõrgem ccRCC kudedes (joonis 1B; P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">
ekspressioonitasemed olid ACHN, 786-O ja SK-RC-52 rakuliinides märkimisväärselt kõrgenenud, kuigi mRNA ekspressioonitasemed OS-RC-2 rakuliinis olid madalamad kui RPTEC rakuliinis (joonis 1D). . Seejärel uuriti ELOVL2 geeniekspressiooni vähiga seotud muutusi erinevat tüüpi vähi puhul, kasutades GENT2 andmebaasi (joonis 1E). Võrreldes normaalsete kudedega leiti, et ELOVL2 ekspressioon on oluliselt kõrgemneerud, eesnäärme-, kopsu- ja käärsoolevähk, samas kui ELOVL2 ekspressioon oli sarnane põie- või rinnavähi korral. Need tulemused viitasid sellele, et ELOVL isoensüümide rollid erinesid vähitüübiti ja et ELOVL2 üleekspressioon võib olla seotud RCC, eriti ccRCC kantserogeneesi või haiguse progresseerumisega.
ELOVL2 üleekspressioon on seotud RCC progresseerumisega. Uuriti seost ELOVL2 geeniekspressiooni ja kasvaja-sõlme-metastaaside (TNM) etappide vahel KIRC kohordis, et selgitada ELOVL2 kliinilist tähtsust ccRCC-s. ELOVL2 ekspressioon oli kõrgem lokaalselt kaugelearenenud ja metastaatilise haiguse korral, kuigi selle ekspressioon ei olnud seotud lümfisõlmede metastaaside staatusega (joonis 2A-C). Kollektiivselt suurenes ELOVL2 ekspressioon vastavalt kliinilisele staadiumile (joonis 2D). Seejärel hinnati seost ELOVL2 ekspressiooni ja RCC-ga patsientide prognoosi vahel, et selgitada ccRCC kliinilist mõju. Kaplan-Meieri analüüsi kohaselt selgus, et ELOVL2 kõrge ekspressioon oli praeguses kohordis oluliselt seotud halva prognoosiga (P=0.0015, joonis 2E). Nende tulemuste kinnitamiseks uuriti KIRC kohordis täiendavalt seost ELOVL2 ekspressiooni ja ccRCC-ga patsientide prognoosi vahel ning näidati, et samamoodi oli ELOVL2 kõrge ekspressioon oluliselt seotud halva prognoosiga (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">
ELOVL2 soodustab neeruvähirakkude proliferatsiooni. ELOVL2 funktsiooni hindamiseks RCC rakkude proliferatsioonis viidi läbi ELOVL2 shRNA knockdown 786-O, ACHN ja SK-RC-52 rakkudes. Iga shRNA mõju hinnati RT-qPCR abil ja kinnitati ELOVL2 ekspressiooni oluline vähenemine (joonis 3A). Seejärel viidi läbi MTT testid, et uurida ELOVL2 knockdowni mõju rakkude proliferatsioonile. Täheldati, et ELOVL2 pärssimine pärssis kõigi rakkude proliferatsiooni võrreldes kontroll-shRNA-ga transfekteeritud rakkudega (joonis 3B).
Seevastu indutseeriti ELOVL2 üleekspressioon OS-RC-2 rakkudes, rakuliinis, mille ELOVL2 basaalekspressioon oli madalam. Transfektsiooni efektiivsust hinnati RT-qPCR abil ja kinnitati oluliselt suurenenud ELOVL2 ekspressioon (joonis 3C). MTT testid näitasid, et ELOVL2 üleekspresseerivate rakkude proliferatsioon oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt soodustatud (joonis 3D), mis näitab, et ELOVL2 võib olla ELOVL2 proliferatsiooni promootor.neeru-vähirakud.
ELOVL2 ablatsioon pärsib kasvaja kasvu in vivo, PUFA-de sünteesi ja LD-de tootmistneeru-vähirakud. ELOVL2 rollide edasiseks selgitamiseks RCC progresseerumisel loodi ELOVL2-knockout ACHN rakuliin, kasutades CRISPR/Cas9 süsteemi (sgELOVL2-1 ja sgELOVL2-2) (joonis S1). In vitro vähenes rakkude proliferatsioon oluliselt ELVOVL2 ablatsiooni tõttu ACHN-rakkudes (joonis S1). Veelgi olulisem on see, et ELOVL2 CRISPR/Cas9-vahendatud ablatsioon pärssis tuumori kasvu, kui rakud implanteeriti subkutaanselt hiirtele (joonis 4A). Subkutaansete ksenotransplantaadi kasvajate maksimaalsed mahud ACHN/kontrollis ja ACHN/sgELOVL2-2-s olid surmamise päeval vastavalt 241 ja 109 mm3. Pange tähele, et kõik ACHN / sgELOVL2-1 rühma ksenotransplantaadi kasvajad taandusid spontaanselt 14 päeva pärast siirdamist ja neid ei tuvastatud ekstirpatsiooni ajal. Ki-67 indeksit uuriti ka kontroll- või sgELOVL2-ga transfekteeritud ksenotransplantaadi kasvajate puhul ja täheldati, et ACHN/sgELOVL2-2 rakkudel oli oluliselt madalam Ki-67 indeks kui ACHN/kontrollrakkudel (joonised 4B ja C). . Need tulemused toetasid veelgi võimalust, et ELOVL2 suurendab kasvaja kasvu in vivo. Kuna ELOVL2 asub kromosoomis 6p24.2 ja kodeerib endoplasmaatilise retikulumi transmembraanset valku, mis kontrollib C20–C24 PUFA-de pikenemist (7), hinnati seejärel FA kogutaset rakkudes ACHN/sgControl ja ACHN/sgELOVL2, kasutades GC-MS analüüsi. (joonis S2). LC-PUFA taseme muutust on näidatud joonisel 4D. ELOVL2 on oluline ensüüm dokosaheksaeenhappe (DHA, C22:6 n-3) endogeenses tootmises (28, 29) ja ootuspäraselt langes DHA tase oluliselt ELOVL2 ablatsiooni tõttu veres.neeru-vähirakud. Veelgi enam,
muude LC-PUFA liikide, sealhulgas arahhidoonhappe (AA, C20:4 n-6), eikosapentaeenhappe (EPA) ja dokosapentaeenhappe (DPA) kogused vähenesid samuti oluliselt. Teisest küljest ei muutunud ACHN / sgELOVL2 rakkudes DPA tootmist järjekindlalt. DPA kogus ACHN-rakkudes oli väga madal ja seda ei tuvastatud mitmes proovis (joonis S2). Kuna varasemad uuringud on näidanud, et ELOVL2 soodustab LD-de akumuleerumist DHA (11, 12) tootmise kaudu, hinnati LD-de säilitamist täiendavalt neutraalse lipiidide värvimise abil. Märkimisväärne on see, et LD-de arvukus ACHN/sgELOVL2 rakkudes oli oluliselt vähenenud võrreldes ACHN/sgControl rakkudega (joonis 4E-4G), mis viitab sellele, et lipiidide metabolismi muutmine ELOVL2 üleekspressiooniga võib mõjutada RCC rakkude proliferatsiooni.
ELOVL2 ablatsioon kutsub esile apoptoosineeru-vähirakud. Varasemad uuringud on näidanud, et intratsellulaarsete LD-de tootmine soodustab apoptoosi stressirohke kasvaja mikrokeskkonnas (4). Seetõttu hinnati käesolevas uuringus apoptoosi ACHN/sgControl või ACHN/sgELOVL2 rakkudes ja ACHN/sgELOVL2 rakkudes tuvastati kaspaasi 3/7 oluliselt kõrgem aktiivsus (joonis 5A). Samamoodi tuvastati suurem arv apoptootilisi ACHN/sgELOVL2 rakke võrreldes ACHN/sgControl rakkudega, mida tõendab anneksiin V/PI värvimine (joonis 5B). Sõltuvalt raku stressist viib sisemine apoptoos (30) mitokondriaalse membraani potentsiaali kadumiseni; seega hinnati käesolevas uuringus täiendavalt ACHN / sgControl või ACHN / sgELOVL2 rakkude mitokondriaalset transmembraanset elektrilist potentsiaali, kasutades fluorestseeruvat JC-1. Agregaatide/monomeeride suhe vähenes oluliselt ACHN/sgELOVL2 rakkudes (joonis 5C), mis näitab mitokondriaalse transmembraanse polarisatsiooni soodustamist ja sisemise apoptootilise raja aktiveerimist ELOVL2 ablatsiooniga. Täpsemalt, pro-apoptootilise geeni (BAX, BAK, PUMA ja NOXA) ekspressioonitasemed tõusid oluliselt, samas kui anti-apoptootilise geeni (BCL2 ja MCL1) ekspressioonitasemed vähenesid oluliselt ELOVL2 ablatsiooni tõttu (joonis 5D). Need tulemused näitasid, et ELOVL2 aitab kaasa rakkude ellujäämisele neeruvähirakkude apoptoosi pärssimise kaudu
Lipiidide säilitusvõime halvenemine LD-vormis võib viia ER-i homöostaasi kokkuvarisemiseni, käivitades voltimata valguvastuse (UPR) ja raku apoptoosi (4, 5). Seetõttu, et toetada hüpoteesi ELOVL2 ekspressiooni kaasamise kohta ER-i homöostaasis, viidi ER-jälgija värvimine läbi ACHN / sgControl või ACHN / sgELOVL2 rakkudes. Järgnev ER-pildistamine (joonis 5E) ja voolutsütomeetria abil kvantifitseerimine (joonis 5F ja G) näitasid ER-i laienemist ACHN/sgELOVL2 rakkudes ER-i stressi tõttu. Lisaks soodustas ELOVL2 ablatsioon UPR-andurite aktivaatori IRE1 (joonis 5H) fosforüülimist, samas kuiCHOP, mis mängib peamist rolli ER stressist põhjustatud apoptoosis, reguleeriti üles ELOVL2 ablatsiooniga (joonis 5H). Need tulemused näitasid ühiselt, et ELOVL2 vahendatud lipiidide metabolism pärsib raku apoptoosineeru-vähirakud ja soovitas, et ER-i homöostaasi häirimine võib olla potentsiaalne induktsioonimehhanism.
Arutelu
Käesolev uuring näitas, et ELVOL2 võib muuta lipiidide metabolismi ja soodustada kasvaja kasvu neeruvähirakkude apoptoosi pärssimise kaudu. Lisaks täheldati, et ELOVL2 ekspressioon RCC kudedes oli kõrgem ja see
ELOVL2 kõrgem ekspressioon oli märkimisväärselt seotud RCC-ga patsientide halva prognoosiga. ELOVL2 rolli kohta vähi progresseerumisel on saadaval piiratud arv uuringuid (22, 31, 32) ja nende tulemused on vastuolulised. Simple jt (22) näitasid, et ELOVL2 soodustas LC-PUFA sünteesi, toetades tõhusat EGFR-i signaaliülekannet ja glioblastoomi tüvirakkude proliferatsiooni. Seevastu Kang jt (31) teatasid, et ELOVL2 ablatsioon võib soodustada rakkude migratsiooni ja rinnavähirakkude kolooniate moodustumist ning näitas, et ELOVL2 ekspressiooni vähenemine oli seotud rinnavähiga patsientide halvema prognoosiga. Lisaks teatasid Ding jt (32), et ELOVL2 pärsib neuroblastoomirakkude proliferatsiooni ja seda seostati soodsate ellujäämismääradega. Varasemates uuringutes teatatud vastuoluliste leidude kohaselt on näidatud ELOVL2 mitmeotstarbeline funktsioon vähi progresseerumisel, mis varieerub selgelt vähitüübiti.
Muutunud lipiidide metabolism mõjutab suuresti vähi progresseerumist, mida on täheldatud käesoleva uuringu tulemustes, mis on kooskõlas uuringutega, mis kirjeldavad ELOVL2 rolli LC-PUFA-de pikenemisprotsessi peamise kontrollijana ja kriitilise ensüümina DHA biosünteesis. 7). Käesolevas uuringus näidati, et endogeensed LC-PUFA-d,
sealhulgas AA ja DHA, vähenesid ELOVL2 ablatsiooni tõttu neeruvähirakkudes. Seoses sellega on varem teatatud, et AA raja pärssimine lipoksügenaasi (LOX) inhibiitorite poolt kutsub esile apoptoosi ja vähendab rakkude elujõulisust.neeru-vähirakud in vitro (33,34). Kuigi käesoleva uuringu ELOVL2 üleekspressiooni tulemused on nende mehaaniliste leidudega kooskõlas, on siiski varem teatatud, et DHA manustamine võib inhibeerida neeruvähirakkude proliferatsiooni ja invasiooni in vitro (35, 36). Siiski on teada, et LC-PUFA-del on vähi progresseerumisele erinev ja kontrastne mõju. Seetõttu võib ELOVL2 inhibeerimisest tingitud tundliku tasakaalu muutumine mitmesuguste LC-PUFA-de vahel olla seotud erinevate vähitüüpide puhul täheldatud erinevate fenotüüpidega. Varasemad uuringud on näidanud, et LD-sid suurendavad ELOVL2 endogeense DHA tootmise kaudu hiirtel (11, 12). Samamoodi selgus, et ELOVL2 ablatsioon võib pärssida DHA ja LD-de tootmist neeruvähirakkudes, mis viitab sellele, et ELOVL2 üleekspressioon võib soodustada LD tootmist endogeense DHA tootmise kaudu RCC-s. Vähirakke leidub sageli karmimates keskkonnatingimustes (makro- ja mikro-), sealhulgas hüpoksia ja toitainete puuduses, kuid siiski kasvavad nad selliste tõsiste stressitegurite korral kiiresti. On näidatud LD-de funktsioone raku stressi tingimustes, nagu energia ja redoks-homöostaasi säilitamine, autofagia reguleerimine, ER-i homöostaasi säilitamine ja kaitse lipotoksilisuse eest (4).
Ackerman jt (6) näitasid, et LD-d takistavad toksiliste, küllastunud lipiidide kogunemist hüpoksia ajal, puhverdades raku lipiidide küllastumist TG-residentide küllastumata FA-de vahetamise kaudu ccRCC-s. Küllastunud FA-dest (SFA), sealhulgas palmitaadist (C16:0) tingitud rakkude lipotoksilisus võib põhjustada apoptoosi, mis põhjustab vähirakkude surma (37, 38). Hiljuti määrati ELOVL2 kriitiliseks ellujäämist soodustavaks ensüümiks, mis aitab ära hoida glükolipotoksilisusest põhjustatud raku apoptoosi (39). Pange tähele, et ELOVL2 / DHA teljega modifitseeritud lipiidide jaotumine põhjustab SFA palmitaadi mittetoksilist kasutamist, soodustades selle transporti mitokondritesse FA oksüdatsiooniks (FAO) CPT1-st sõltuva mehhanismi kaudu. Lisaks näitasid Balaban jt, et C4-2B eesnäärmevähi rakud ja MCF-7 rinnavähirakud on mitokondriaalse FAO poolt kaitstud palmitaadi poolt indutseeritud apoptoosi eest (37, 38). Palmitaadist põhjustatud lipotoksilisuse ajal on teatatud apoptootiliste valkude, sealhulgas BCL-2 või MCL-1 raku taseme langusest (40, 41), samas kui on teatatud proapoptootiliste valkude, sealhulgas PUMA või NOXA tasemetest. suurendada (42,43). Käesolevas uuringus selgus, et ELOVL2 ablatsioon võib soodustadaneeru-vähirakkude apoptoosi pro- ja anti-apoptootiliste geenide muutmise kaudu sarnasel viisil. Need leiud viitavad sellele, et ELOVL2 võib kaitsta rakke lipotoksilisusest tingitud apoptoosi eest, et soodustada kasvaja kasvu RCC-s.
Lisaks näidati, et ELOVL2 ablatsioon RCC-s võib soodustada ER-i stressi ja CHOP-i ülesreguleerimist, vähendades BCL-2 ja MCL-1, reguleerides samal ajal BAK-i ja BAX-i mitokondritest sõltuva raja kaudu (44). Tõepoolest, käesoleva uuringu tulemused näitasid, et ELOVL2 ablatsioon muutis sarnaselt pro- ja anti-apoptootilisi geene. Kooskõlas Qui jt (5) uuringu tulemustega, kes teatasid, et HIF2 / PLIN2-sõltuvad LD-d soodustavad resistentsust ER stressi vastu ja rakkude ellujäämist ccRCC-s, toetavad need kollektiivsed leiud ER stressi, mis soodustab ELOVL2 poolt raku apoptoosi. ablatsioon sisseneeru-vähirakke, vähendades LD-sid ja eemaldades raku puhvri toksiliste lipiidide vastu.
Kokkuvõttes näitas käesolev uuring meie teadmiste kohaselt esimest korda, et ELOVL2 soodustab tuumori kasvu, inhibeerides apoptoosi PUFA-de pikenemise kaudu, vähemalt osaliselt säilitades ER-i homöostaasineeru-vähirakud. Kokkuvõttes tehti ettepanek, et ELOVL2-indutseeritud LD-d võivad kaasa aidata vähi progresseerumisele tänu mitmele kaitsvale toimele rakulise stressi vastu RCC-s. Lisaks tehti ettepanek, et ELOVL2 võib olla atraktiivne potentsiaalne terapeutiline sihtmärk RCC-ga patsientidele.
