Munakoore membraan leevendab hüperurikeemiat, suurendades uraadi eritumist kaaliumoksonaadi süstitud rottidel
Mar 16, 2022
Abstraktne:Hüperurikeemia on podagra artriidi ja muude ainevahetushäirete peamine põhjus. Munakoore membraan (EM) on tõhus ja ohutu lisand osteoartriidiga seotud valu ja jäikuse leevendamiseks. Siiski on EM-i mõju hüperurikeemiale ebaselge. See uuring määrab EM-i mõju kaaliumoksonaadiga süstitud hüperurikeemiale. Mõõdetakse kusihappe, kreatiniini, vere uurea lämmastiku kontsentratsiooni seerumis ja ksantiinoksüdaasi aktiivsust maksas. Valgu taseneeru- uraadi transporter 1 (URAT1), orgaanilise aniooni transporter 1 (OAT1), glükoosi transporter 9 (GLUT9) ja ATP-d siduv kassetttransporter G2 (ABCG2)neerudon kindlaks määratudneeru-histopatoloogia. Tulemused näitavad, et EM vähendab seerumi kusihappe taset ja suurendab kusihappe taset uriinis hüperurikeemilistel rottidel. Lisaks reguleerib EM allaneeru-URAT1 valgu ekspressioon reguleerib OAT1 ja ABCG2 üles, kuid ei muuda GLUT9 ekspressiooni. Lisaks ei muuda EM ksantiinoksüdaasi aktiivsust maksas ega seerumis. EM vähendab ka kusihappe omastamist hURAT1 ekspresseerivatesse munarakkudesse. Lõpuks väheneb EM märkimisväärseltneeru-põletik ja seerumi interleukiini{0}} tase. Need leiud viitavad sellele, et EM-il on soodustades antihüperurikeemiline toime neeru-uraadi eritumine ja reguleerimineneeru-uraadi transportijad. Seetõttu võib EM olla kasulik podagra ja hüperurikeemia ennetamiseks ja raviks.
Märksõnad:Neer; neerud; podagra; uraadi transporter 1; kusihappe; kaaliumoksonaat
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
Munakoore membraan (EM) on munakoore siseküljele kinnitatud kile, mis on üks munade komponente, mis on inimeste tervisele oluline toit. See võimaldab hapniku tungimist ja blokeerib mikroorganismide sissetungi. EM koosneb orgaanilisest materjalist (70 protsenti), mitteorgaanilisest materjalist (10 protsenti) ja veest (20 protsenti), kusjuures 80 protsenti orgaanilisest materjalist koosneb valkudest. Lisaks koosneb see 2,3 protsendist rasvast ja 3,4 protsendist süsivesikutest [1,2]. Muna komponentidest kasutatakse toidu toorainena munakollast ja -valget ning munakoor on kaltsiumilisandite tooraine hammaste ja luude moodustamiseks ja säilitamiseks [3]. EM liigitatakse siiski jäätmeteks ja seda ei kasutata sageli. EM-i artriidivastasest toimest on hiljuti teatatud lipopolüsahhariididest indutseeritud loommudelis ja inimeste kliinilistes uuringutes [4, 5]. EM on samuti parandanud põletikku kollageenist põhjustatud reumatoidartriidiga rottidel [6]. Lisaks on EM näidanud artriidivastast toimet mononaatriumjodoatsetaadist põhjustatud osteoartriidi rottidel [7]. Mononaatriumjodoatsetaat on podagra artriidi indutseerija ja mononaatriumuraadikristallide kuhjumine liigestesse võib põhjustada põletikku, mis põhjustab podagra artriiti. Hüperurikeemia võib põhjustada kusihappe (või uraadi) kristallide moodustumist ja nende kristallide ladestumine liigestesse põhjustab podagra, artriidi vormi, mis võib olla väga valus. EM on kollageeni, kondroitiinsulfaadi, glükoosamiini, hüaluroonhappe ja kaltsiumi allikas, mida kõiki on osteoartriidi ravis põhjalikult uuritud [8]. Nende uuringute tulemused näitavad EM potentsiaalset kasulikkust podagra ja hüperurikeemia ennetamiseks ja raviks.
Hüperurikeemia on insuliiniresistentsuse, diabeedi, rasvumise, hüpertensiooni, ateroskleroosi ja südame-veresoonkonna haiguste ning podagra artriidi progresseerumise peamine riskitegur [9–11]. Hüperurikeemia asjakohane kontroll aitab kaasa nende haiguste ennetamisele ja ravile. Hüperurikeemia tekib kusihappe tootmise suurenemise või kusihappe eritumise halvenemise korral [12]. Vähendades kusihappe tootmist ja suurendades eritumist, võib uraaditaset alandav ravi mängida üliolulist rolli hüperurikeemia ja hüperurikeemiaga seotud häirete kontrolli all hoidmisel [13]. Tavaliselt kasutatavaid uraadisisaldust alandavaid ravimeid, nagu allopurinool ja febuksostaat, kusihappe sünteesi inhibiitor, kasutatakse laialdaselt podagra raviks; aga neil ksantiinoksüdaasi (XO) inhibiitoritel võivad olla tõsised kõrvaltoimed, nagu allopurinooli ülitundlikkussündroom [14–16]. Bensbromaroon on urikosuuriline ravim, mida on kasutatud podagra tõrjeks viimased 30 aastat, kuid tõsiste hepatotoksiliste kõrvalmõjude tõttu eemaldati see Euroopa turult [17]. Seega on vaja välja töötada toksilisuseta looduslikest saadustest saadud ravimid, mis oleksid tõhusamad hüperurikeemiaga seotud häirete ennetamiseks ja pikaajaliseks raviks. Seetõttu uurib see uuring, kas EM kaitseb hüperurikeemia eest. Selles uuringus hinnatakse EM-i antihüperurikeemilist aktiivsust kaaliumoksonaadi (PO) põhjustatud hüperurikeemiaga rottidel. PO on selektiivselt konkureeriv urikaasi inhibiitor, mida kasutatakse laialdaselt maksa urikaasi toime pärssimiseks, mis põhjustab hüperurikeemiat [18,19]. Seega on PO-ga töödeldud rotid praktiline loommudel mitte ainult hüperurikeemia patoloogia uurimiseks, vaid ka potentsiaalsete ravimite hindamiseks [20]. EM-i aktiivsuse ja selle aluseks olevate mehhanismide uurimiseks hüperurikeemia korral uuritakse hüperurikeemilistel loomadel EM-i kahesuguseid mehhanisme kusihappe tootmise pärssimise ja kusihappe eritumise suurendamise kaudu.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
2. Materjalid ja meetodid
2.1. LoomadSeitsmenädalased isased Sprague Dawley rotid osteti ettevõttest Orient Bio (Seongnam, Korea). Neid kohandati konditsioneeritud loomade ruumis temperatuuril 22 ± 1 ◦C ja õhuniiskusega 50 protsenti ± 10 protsenti. Rottidele anti juurdepääs standardsele dieedile ja veele ad libitum. Loomkatsed kiitis heaks Korea idamaade meditsiini instituudi institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning katsed viidi läbi vastavalt komitee juhistele (kinnituskood. 19-024).
2.2. Hüperurikeemia esilekutsumine ja EM-i manustamineSelles uuringus kasutatud EM-i andis kuivatatud pulbrina JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Korea). Hüperurikeemia esilekutsumiseks süstiti loomadele intraperitoneaalselt 150 mg/kg PO (urikaasi inhibiitor). Kasutati järgmisi positiivseid kontrollravimeid: allopurinool (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja bensbromaroon (TCI, Tokyo, Jaapan). Enne süstimist lahustati PO 0,5% karboksümetüültselluloosis (CMC, Sigma, USA) ja 0,1 M naatriumatsetaadis (Sigma, USA). EM-i antihüperurikeemilise toime uurimiseks (katse 1, esialgne akuutne uuring) jagati rotid viide rühma (5 looma rühma kohta): normaalne rühm; PO-süstitud hüperurikeemia rühm (PO); PO pluss 10 mg/kg allopurinooli manustatud rühm; PO pluss 100 mg/kg EM-ga manustatud rühm; ja PO pluss 200 mg/kg EM-ga manustatud rühm. Katses 1 lahustati proovid CMC-s ja manustati suu kaudu (üks kord) rottidele 1 tund pärast PO süstimist 1 päeva jooksul. EM annusest sõltuvate aktiivsuste ja molekulaarsete mehhanismide uurimiseks (katse 2) jagati rotid 7 rühma (igaüks n=5): normaalne rühm (N); PO-süstiga hüperurikeemia rühm; PO pluss 10 mg/kg allopurinooli manustatud rühm; PO pluss 50 mg/kg bensbromarooni manustatud rühm; PO pluss 50 mg/kg EM-ga manustatud rühm; PO pluss 100 mg/kg EM-ga manustatud rühm; ja PO pluss 200 mg/kg EM-ga manustatud rühm. Proovid lahustati 0, 5% CMC lahuses ja manustati rottidele suu kaudu (iga päev) 1 tund pärast PO süstimist 5 päeva jooksul.
2.3. Vere-, uriini- ja koeproovide kogumineVeri koguti 2 tundi pärast ravimi manustamist ja uriin koguti ka 2 tunni pärast, kasutades pärast proovi töötlemist metaboolset puuri. Pärast vere ja uriini kogumist, kude(neerja maksa) proovid jaotati hoolikalt ja säilitati edasiste analüüside jaoks temperatuuril 80 ◦C. Seerum eraldati tsentrifuugimisega (2000 × g, 15 min, 4 °C). Seejärel kasutati seerumi- ja uriiniproove biokeemiliseks analüüsiks.
2.4. Kusihappe kontsentratsiooni analüüs seerumis ja uriinisKusihappe kontsentratsioon seerumis ja uriinis määrati kaubandusliku kusihappeanalüüsi komplekti (Biovision, Milpitas, CA, USA) abil vastavalt tootja antud juhistele.
2.5. Proinflammoorsete tsütokiinide taseme mõõtmine seerumisSeerumi interleukiini (IL)-1 kontsentratsiooni mõõdeti roti IL-1 ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektiga (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).
2.6. In vitro ksantiini oksüdaasi aktiivsus maksast ja seerumisXO aktiivsus maksakoes ja seerumis määrati, kasutades XO aktiivsuse analüüsi komplekti vastavalt tootja protokollidele (Sigma, USA). XO aktiivsust mõõdeti Spectra Max M3 mikroplaadilugejaga (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), kasutades varem avaldatud protokolle [21]. Ensüümreaktsioon käivitati substraadina 0,5 mM ksantiini lisamisega ja kusihappe kontsentratsiooni mõõdeti iga minuti järel 5 minuti jooksul. Võrdlusena kasutati XO inhibiitorit allopurinooli. Maksa XO aktiivsus normaliseeriti valgu üldtasemega.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
2.7. Neeru histopatoloogiline uuringNeerukuded eemaldati, fikseeriti kohe 1 päev formaliinis ja sisestati seejärel parafiini. Iga proov lõigati 6 µm paksuseks ja lõigud värviti hematoksüliini ja eosiini reagendiga. Seejärel visualiseeriti värvitud lõigud mikroskoobi all.
2.8. Western blot analüüsNeerkuded homogeniseeriti pro-prep ekstraktsioonilahuses (Intron, Seoul, Korea) ja seejärel tsentrifuugiti (13,000 × g, 4 ◦C) 15 minutit. Supernatanti kasutati sihtvalkude Western blot analüüsiks. Valgu üldtase määrati DC-valgu testiga veise seerumi albumiiniga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Primaarsete antikehade hulka kuulusid -aktiin (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), glükoosi transporter 9 (GLUT9, MyBioSource, San Diego, CA, USA), uraadi transporter 1 (URAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA) ja orgaaniline aniooni transporter 1 (OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, USA). Membraani ribad visualiseeriti ECL tuvastamisreagendiga, kasutades ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Seoul, Korea). Saadud kujutiste tihedus määrati NIH tarkvara Image J1.49 (Bethesda, MD, USA) abil. Visualiseeritud sihtvalgu tasemed normaliseeriti -aktiiniks. ATP-d siduva kasseti transporteri G2 (ABCG2) ekspressioonid saadi roti ABCG2 ELISA komplekti (MyBioSource) abil ja normaliseeriti valgu üldtasemega.
2.9. Uraatide omastamise mõõtmine UART{2}}ekspresseerivate munarakkude abilXenopuse hURAT{{0}}ekspresseerivad munarakud konstrueeriti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [20]. URAT1 inhibiitorit bensbromarooni (TCI, Tokyo, Jaapan) käsitleti võrdlusalusena. Ootsüüte inkubeeriti reaktsioonipuhvris Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahusega (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja ND lahusega (pH 7,4; 5 mM 4-(2-). Hüdroksüetüül)) piperasiin-1-etaansulfoonhappe puhver, 2 mM KCl, 1 mM magneesiumkloriid, 1,8 mM kaltsiumkloriid ja 96 mM naatriumkloriid, 1 mM pürasiinkarboksüülhape (Sigma-Aldrich, St. Louis) , MO, USA) temperatuuril 37 ◦C. Ootsüüte inkubeeriti täiendavalt lahuses, mis sisaldas erineva kontsentratsiooniga EM-i (1, 10 ja 100 µg/ml) 50 µM [14C] kusihappega (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) temperatuuril 37 °C. 60 minuti pärast peatati kusihappe omastamine külma DPBS-i lisamisega. Pärast peatamist lahustati ootsüüdid 0,1 N naatriumhüdroksiidi ja 10% naatriumdodetsüülsulfaadi lahuses ning radioaktiivsust loendati vedelikstsintillatsiooniga.
2.10. StatistikaKõik andmed väljendati keskmisena ± keskmise standardviga. Olulisi erinevusi hinnati statistiliselt ühesuunalise dispersioonanalüüsiga, millele järgnes Dunnetti test post hoc analüüsiks, kasutades GraphPad Prism 7.{4}}5 tarkvara. Erinevust peeti statistiliselt oluliseks, kui p-väärtus oli väiksem kui 0,05.
3. Tulemused
3.1. Munakoore membraani mõju seerumi kusihappe sekretsioonile,Üks PO-süst 1 päeva jooksul suurendas oluliselt seerumi kusihappe taset PO-ga süstitud hüperurikeemilistel rottidel võrreldes normaalsete rottide omadega (joonis 1). Samal ajal vähendas EM annustes 100 ja 200 mg/kg ja allopurinooli (positiivne kontroll) tõhusalt seerumi kusihappesisaldust PO-ga süstitud hüperurikeemilistel rottidel. Seetõttu viidi läbi järgmised uuringud, et tuvastada EM annusest sõltuvad tegevused ja mehhanismid.
3.2. Munakoore membraani mõju seerumi ja uriini kusihappe tasemele,APO süstimine 5 päeva jooksul tõstis oluliselt seerumi kusihappe taset PO rühmas võrreldes normaalse rühmaga (joonis 2a). EM-i ravi 100 ja 200 mg/kg, samuti allopurinooli ja bensbromarooniga vähendas oluliselt seerumi kusihappe taset PO rühmas. Lisaks hindamaneerufunktsioon, mõõdeti kreatiniini ja vere uurea lämmastiku (BUN) kontsentratsioone. Seerumi kreatiniini kontsentratsioon ei olnud rühmade vahel erinev (joonis 2b). Seerumi BUN kontsentratsioonid tõusid PO rühmas, kuid need tasemed langesid EM 200 mg/kg rühmas ja positiivse kontrolli (allopurinool ja bensbromaroon) rühmas (joonis 2c).
Et hinnata EM-i mõju kusihappe eritumisele, uuriti kusihappe taset uriinis. PO rühmas oli uriini kusihappe tase oluliselt vähenenud, mis suurenes EM-i (100 ja 200 mg/kg) ja bensbromarooni (joonis 2d) manustamisega. Need andmed näitasid, et EM võib suurendada neerude uraadi ekstraheerimist, et vähendada seerumi kusihappe taset hüperurikeemilistel rottidel.
3.3. Munakoore membraani mõju neerupõletikuleTäheldati kerget tubulaarset laienemist, tubulaarse epiteelirakkude vakuolaarset degeneratsiooni, turset ja põletikuliste rakkude infiltratsiooni.neerudPO-süstiga hüperurikeemiliste rottide puhul (joonis 3a). Kuid EM parandas neid tõhusaltneeru-histopatoloogilised muutused hüperurikeemilistel rottidel. Lisaks näitasid hüperurikeemilised rotid seerumis põletikueelse tsütokiini IL-1 tõusu (joonis 3b). Kõigi kontsentratsioonide EM reguleeris hüperurikeemiliste rottide seerumitasemeid märkimisväärselt alla. Bensbromarooni manustamine suurendas seerumi IL-1 taset rohkem kui PO-süstiga hüperurikeemilistel rottidel, kuigi mitte oluliselt, ja see on tõenäoliselt selle ravimi kõrvalmõju. Need tulemused viitavad sellele, et EM paranes tõhusaltneerudpõletik ja funktsioon hüperurikeemilistel rottidel.
3.34. Munakoore membraani mõju XO aktiivsusele
Maksas sisalduv XO indutseerib kusihappe tootmist. Seega hinnati EM-i inhibeeriva toime mehhanismi määratlemiseks hüperurikeemiale XO aktiivsust seerumis ja maksas, maksa XO aktiivsus suurenes oluliselt PO rühmas (joonis 4a, b). XO inhibiitor allopurinool vähendas oluliselt XO aktiivsust seerumis ja maksas. Siiski ei muutnud EM kõigis annustes XO aktiivsust. Need andmed näitavad, et EM ei inhibeeri XO aktiivsust ega vähenda kusihappe tootmist.
3.5. Munakoore membraani mõju uraadi eritumiseleEt hinnata EM-i mõju uraatide eritumisele, ekspresseeritakse mituneerude transportijadvaadati läbi. EM 100 ja 200 ug/ml ning bensbromaroon alandasid oluliselt URAT1 valgu tasetneerud(Joonis 5a,b). Kuid EM ei muutnud GLUT9 valgu taset (joonis 5c). EM kontsentratsioonil 200 ug/ml suurendas OAT1 valgu taset ja EM-i manustamine kõikidel kontsentratsioonidel suurendas ABCG2 taset (joonis 5d, e).
3.6. EM-i mõju URAT1 in vitro omastamisele munarakkudesLisaks kinnitati EM-i mõju in vitro uraadi omastamise süsteemile. EM-ravi 1, 10 ja 100 ug/ml näitas in vitro hURAT1- üleekspresseerivate munarakkude tugevat kusihappe omastamise inhibeerimist (joonis 6). Need andmed näitavad, et EM reguleerib uraadi transporterite ekspressiooni, et suurendada uraadi eritumist.
Arutelu
Inimestel mängivad neerud kusihappe homöostaasis olulist rolli, kuna enam kui 70 protsenti uraadi eritumisestneeru-,ülejäänud 30 protsenti eritub soolestikust väljaheitega [22,23]. Uraatide eritumist võivad aga häiridaneeru-häired, mis põhjustavad hüperurikeemiat. Kusihappe eritumine sõltub transportivatest valkudest proksimaalsetes tuubulitesneerudet kontrollida kusihappe sekretsiooni veres ja filtraadis [24].Neeruduraadi transporterid URAT1, mis asuvad luminaalsel membraanil ja GLUT9/ apikaalsel membraanilneerudproksimaalsed tuubulid, moodustavad uraadi reabsorptsiooni peamise rajaneerud[25,26]. OAT1, mis asub proksimaalse tuubuli basolateraalses membraanis, ja ABCG2, mis asub apikaalses membraanis, vastutavad peamiselt uraadi sekretsiooni eest verest epiteelirakkudesse [27]. Nende uraaditransporterite reguleerimist peetakse hüperurikeemia peamiseks terapeutiliseks sihtmärgiks. Selles uuringus vähenes EM tõhusaltneeru-URAT1 tasemed PO-süstiga hüperureemilistel rottidel, kuigi GLUT9 valgu ekspressioonid ei muutunud. Lisaks reguleeriti OAT1 ja ABCG2 valgu ekspressioone ülesneerudpärast EM-ravi, avaldades seeläbi urikosuurilist toimet. See uuring kinnitas EM-i inhibeerivat aktiivsust URAT1 uraadihaarde suhtes URAT1-üleekspresseerivates munarakkudes ja et see toime oli efektiivne URATl-ga soodustatud uraadihaarde tagasipööramisel. Kokku saadakse 90 protsenti uraadi tagasiimendumisestneeru-URAT1 [28]. Nende kontrollneerudUraatide transportijad EM-ravi abil võivad kaasa aidataneeru-kusihappe eritumine hüperurikeemiaga rottidel. Kreatiniin ja uurea lämmastik on ebanormaalse biomarkeridneerudfunktsioon, mis näitab selle võimetneerudvalkude metaboliitide väljutamiseks [24]. Tulemused näitasid, et PO suurendab seerumi kusihappe ja BUN kontsentratsioonineeru-düsfunktsioon. Kuid 200 mg/kg EM muutis selle tõusu paremaksneerufunktsioon. Ensüüm XO katalüüsib hüpoksantiini või ksantiini oksüdatsiooni kusihappeks [28]. XO inhibiitorid, nagu allopurinool, vähendavad seerumi kusihappe kontsentratsiooni ja reaktiivsete hapnikuühendite ületootmist, mis on peamiselt seotud XO üleaktiivsusega, mis põhjustab sageli veresoonte endoteeli põletikulisi rakukahjustusi, aidates kaasa metaboolse sündroomi ja kardiovaskulaarsete häirete tekkele [29]. ]. Seetõttu võib XO üleaktiveerimise pärssimine olla terapeutiline sihtmärk liigse kusihappe kahjulike mõjude kontrollimiseks. Kuid meie uuring näitas, et EM ei muutnud seerumi ja maksa XO aktiivsust PO-indutseeritud hüperurikeemiaga rottidel.
Hüperurikeemia võib olla riskielementneeruddüsfunktsioon [23]. Käesolevas uuringusneeruddüsfunktsiooni iseloomustas seerumi BUN ja põletikulise tsütokiini IL-1p taseme tõus janeeru-põletik hüperurikeemilistel rottidel. Needneeru-EM-ravi nõrgendas düsfunktsioone, mis viitab neerupõletiku paranemisele. Kuid ravim bensbromaroon tõstis hüperurikeemilistel rottidel seerumi IL-1p taset ja urikosuuriliste ravimite, sealhulgas bensbromarooni ja probenetsiidi peamise kõrvaltoimena teatati neerukahjustusest [30]. EM sisaldab looduslikult esinevat glükoosamiini, kondroitiinsulfaati, hüaluroonhapet, kollageeni, peptiide ja muid väävlit sisaldavaid aminohappeid [8]. Varasemad uuringud on näidanud, et glükoosamiin ja kondroitiin on näidanud põletikuvastast ja osteoartriidivastast toimet [31,32]. Hüaluroonhappel oli põletikuvastane ja antihüperurikeemiline toime mononaatriumuraadikristallidest indutseeritud ägeda podagra artriidi ja hüperurikeemia loommudelites [33]. Nende uuringute tulemused näitavad nende komponentide potentsiaalset kasulikkust hüperurikeemia ennetamiseks ja raviks. Kuid meie uuring ei näidanud, millised EM-i komponendid suurendasid kusihappe eritumist. EM-st saadud bioaktiivsete komponentide mõju tuleb täiendavalt uurida. Selles uuringus näitasime, et PO-indutseeritud hüperurikeemia janeerupõletikinhibeeriti EM-raviga. Seetõttu võib EM olla paljutõotav antihüperurikeemiline aine. Oletame, et EM-i efektiivne annus rottidel on 100 mg/kg (maksimaalne annus; 200 mg/kg). Kehapinna põhjal on inimesele vastav EM-i annus 16,2 mg/kg (täiskasvanutel 972 mg/päevas). Nende in vivo uuringute põhjal on EM-i soovitatav päevane annus kergete haigusseisundite korral 486 mg või 972 mg päevas ja maksimaalne annus on 1944 mg päevas raskete haigusseisundite korral. Siiski võib annus erineda sõltuvalt ravi kestusest ja vanusest. Nende tulemuste põhjal jätkub lähitulevikus EM-i inimeste kliiniline uuring.
