Angelica Sinensis Cistanche kiudaineühendi efektiivsus ja mehhanismid kõhukinnisuse leevendamiseks

Abstraktne:Kõhukinnisuson levinud haigus, mis võib oluliselt mõjutada inimeste elukvaliteeti ja tõsta sellega seotud haigusriske. Selles uuringus loodi kroonilise kõhukinnisuse hiiremudel, kasutades loperamiidvesinikkloriidi. Hiirtele manustati angelica sinensis Cistanche Fiber Compoundi, mis koosnes Dang Guist [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), nisukiud ja madala molekulmassiga ksülaan suurtes annustes (3,6 g·kg-1, 30 korda suurem inimesele soovitatavast annusest) ja väikeses annuses (0,6 g·kg{{8}). }, 5-kordne inimese soovitatav annus) 14 päeva jooksul. Uuringus hinnati ühendi terapeutilist efektiivsust, jälgides väljaheite morfoloogiat, mõõtes veesisaldust ja viies läbi peensoole motoorika katseid. Lisaks viidi läbi ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsid (ELISA), et hinnata seedetrakti hormoonide, sealhulgas motiliini (MTL), gastriini (GAS), põletikuliste faktorite interleukiin-1 (IL-1) ja tuumori nekroosifaktori taset seerumis. - (TNF-). Käärsoole kudede kahjustuse hindamiseks kasutati histopatoloogilist uuringut H&E värvimisega. Lisaks viidi läbi Western blot ja immunohistokeemia katsed, et uurida akvaporiini -3 (AQP3) ja c-Kit ekspressioonitasemeid käärsooles. Tulemused näitasid, et Angelica sinensis Cistanche Fiber Compound võib parandada väljaheidete morfoloogiat, suurendada väljaheite veesisaldust ja kiirendada hiirte peensoole läbimist. Lisaks tõusis oluliselt seedetrakti hormoonide tase seerumis ja vähenes märgatavalt põletikuliste tegurite tase. Käärsoole histopatoloogilise kahjustuse paranemisega kaasnes käärsoole veekanali valgu AQP3 ekspressiooni märkimisväärne vähenemine ja c-Kit ekspressiooni märkimisväärne suurenemine. Need tulemused viitasid ühiselt annuse-vastuse suhte olemasolule. Need leiud näitavad, et Angelicasinensis Cistanche Fiber Compound leevendab tõhusalt hiirte kõhukinnisust. Selle toime on seotud käärsoole veekanali valgu AQP3 ja c-Kit ekspressiooni reguleerimisega koos seerumi põletikuliste tegurite ja seedetrakti hormoonide moduleerimisega. Selle katse kiitis heaks Jinani ülikooli loomkatsete eetika komitee.

Märksõnad:kõhukinnisus; soolestiku määrimine ja kõhukinnisuse leevendamine; funktsionaalne toit; käärsool; traditsiooniline hiina meditsiin

KUI KAUA LÄBIB, ET CISTANCHE TÖÖTAB?

Kõhukinnisusontavaline seedetrakti haigus. The global prevalence of constipation in the elderly (>60-aastased) on 18,9%[1] ja levimus on sageli suurem naistel[2]. Seda iseloomustavad raskused roojamisel ja sagedane kõhukinnisus. väljaheidete vähenemine ja kõvenemine jne, mis põhjustab füüsilist ebamugavust ja seedetrakti talitlushäireid ning isegi põhjustab või süvendab seedetrakti haigusi, südame-veresoonkonna haigusi [3] jne, mis mõjutab tõsiselt elukvaliteeti. Traditsioonilise hiina meditsiini retsepte kasutatakse laialdaselt kõhukinnisuse parandamiseks ning neil on hea ja kindel kliiniline toime [4,5]. Selles uuringus kasutatud Angelica ja Cistanche deserticola kiuühend valmistatakse Cistanche deserticola, Angelica sinensis, nisukiudude ja ksülooligosahhariidide põhjal. Cistanche deserticola ja Angelica sinensis on kaks lahtistites tavaliselt kasutatavat traditsioonilist Hiina ravimit, mis reguleerivad soolestiku tööd ja parandavad kõhukinnisust. [6-9], kahel traditsioonilisel Hiina ravimil on sama päritolu kui minu kodumaal kasutataval ravimil ja toidul. Nende kombineeritud kasutamine võib saavutada qi ja verd täiendava ning yini ja yangi harmoniseeriva efekti. Nisukiud sisaldavad rohkesti lahustumatuid ja lahustuvaid toidukiudaineid, mis võivad soodustada soolestiku peristaltikat ja roojamist ning neid kasutatakse sageli kõhukinnisuse ravi abistava ravimina; Ksülo-oligosahhariid on funktsionaalne oligosahhariid, mis suudab reguleerida soolefloorat, stimuleerides seeläbi soolestiku peristaltikat. , suurendada väljaheidete niiskust [10], kombineerida nelja maitset ja ravida haiguse algpõhjust. Selle uuringu eesmärk oli hinnata selle angelica ja cistanche deserticola kiudude ühendi efektiivsust kõhukinnisusega hiirtel ja uurida selle võimalikku toimemehhanismi.

Materjalid ja meetodid

Katseloomad: 40 spetsiifilise patogeenivaba (SPF) klassi isast Kunmingi hiirt, vanuses 4–5 nädalat, osteti ettevõttelt Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., litsentsinumber SCXK (Guangdong) 2021-0011, ümbritseva õhu temperatuur on 22 ± 2 kraadi, õhuniiskus 50% ± 10% ning päevane ja öö tsükkel on 12 h/12 ​​h. Katseprotokollid ja protseduurid vastasid loomade kasutamise ja hooldamise eetilistele põhimõtetele ning need kiitis heaks Jinani ülikooli loomkatsete eetikakomitee.

Uuritav aine: Angelica sinensis ja Cistanche deserticola kiuühendi preparaat valmistatakse Angelica Sinensis'est ja Cistanche deserticolast, mis ekstraheeritakse veega, kontsentreeritakse, kuivatatakse ja purustatakse, et saada kuiv pastapulber (pasta saagis 52,95%). Kuivpastapulber segatakse hilisemaks kasutamiseks nisukiu ja ksülo-oligosahhariidiga. Angelica sinensis (partii number 230404CP108) ja Cistanche deserticola (partii number 230303CP109) osteti ettevõttelt Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. ning neid testiti Hiina farmakopöa 2020. aasta väljaande järgimiseks. Ksülo-oligosahhariidid osteti ettevõttelt Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. Partii number on 20210829026 ja kontroll vastab standardile GB/T35545; nisukiud pärineb firmalt J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG ja partii number on 07501230126. 60 kg kaaluva täiskasvanu puhul on angelica ja tsistanche kiuühendi soovitatav annus inimestele 7,118 g·d-1 , millest nisukiudude annus on 3,5 g·d-1. Selle ühendi sobivus on angelica: tsitanche: nisukiud: ksülooligosahhariidid=2:2:3:2 (keeditükkide annus põhineb toordroogil). Võtke 30-kordne inimesele soovitatud annus suure annuse rühmana ja 5-kordne inimese soovitatav annus väikese annuse rühmana, vastavalt 3,6 ja 0,6 g·kg-1·d-1. Valmistage suspensioon puhta veega, segage hästi ja pange kõrvale.

Ravimid ja reaktiivid Loperamiidvesinikkloriid (loperamiid, LOP), spetsifikatsioonid: Iga tablett sisaldab loperamiidvesinikkloriidi

Amiin 2 mg, 12 kapslit karbis, toote partii number: MIJ3102, ostetud ettevõttelt Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Mosapriidtsitraadi tabletid (Quali), spetsifikatsioonid: Iga tablett sisaldab 5 mg mosapriidtsitraati, 24 tabletti karbis, toote partii number: 25220603, ostetud ettevõttest Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; aktiivsöe pulber, spetsifikatsioon: 200 silma pruun pulber, partii number A805337, ostetud ettevõttelt Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; kummiaraabik, spetsifikatsioon: pulber, partii number A108975, ostetud ettevõttest Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Absoluutne etanool (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, 64-17-5); ammooniumpersulfaat (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), 5-kordne laadimispuhver (FD002), -aktiini antikeha (FD0060), kitse küülikuvastane sekundaarne antikeha (FDR007), kitse hiirevastane sekundaarne antikeha (FDM007) ja ECL värviarenduskomplekt (FD8020) kõik osteti ettevõttelt Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.; RIPA lüüsipuhver (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% paraformaldehüüdi (Biosharp Company, BL539A); immunohistokeemia komplekt (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); bitsinhoniinhappe (BCA) valgu kvantifitseerimise komplekt (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motiliin (MTL), gastriin (GAS) ja põletikulised faktorid interleukiin-1 (IL-1), tuumori nekroosifaktor (tuumori nekroosifaktor-, TNF-) ELISA komplekt (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); akvaporiin 3 (aquaporin 3, AQP3) antikeha (Affinity Company, AF5222); c -Kit antikeha (Cell Signaling Technology, 3074S).

Instrument: ülipuhta veemõõtur (Millipore Company, USA, Milli Q); Elektrooniline tasakaal (Sartorius, Saksamaa)

Ettevõte, BS224S); Elektrooniline analüütiline kaal (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Kiire jahutustsentrifuug (Sigma Company, Saksamaa, 3K15); Mikroplaadi lugeja (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); parafiini mikrotoom (Leica, Saksamaa) Company, RM2255); Konstantse temperatuuriga metallvann (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Täisautomaatne proovikiirveski (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); elektroforeesi instrument (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); skaneeriv mikroskoop (Precipoint Company, Precipoint M8); kemoluminestsentskujutise süsteem (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Rühmitamine ja mudeli loomine: 40 hiirt kasvatati adaptiivselt 5 päeva ja jagati seejärel juhuslikult negatiivsetesse kontrollrühmadesse.

(kontroll), mudelrühm (LOP), ühendi suure ja väikese doosi rühmad (LOP+PF-H, OP+PF-L), positiivne kontrollrühm (mosapriidtsitraat, LOP+MOS). Iga päev kell 9–1 0 anti kõigile rühmadele, välja arvatud negatiivne kontrollrühm, sondiga 10 mg·kg-1 loperamiidvesinikkloriidi, et luua hiire kõhukinnisuse mudel, ja negatiivsele kontrollrühmale anti võrdne kogus puhast vett sondiga. 14–15 tunni jooksul anti suure ja väikese annusega rühmadele ühendit vastavalt 3,6 ja 0,6 g·kg-1 ning positiivsele kontrollrühmale anti mosapriidtsitraati (MOS) 5 mg·kg{{ 19}}.

, anti negatiivsele kontrollrühmale ja mudelkontrollrühmale 14 järjestikuse päeva jooksul sondiga võrdses koguses puhast vett.

Hiirte seisundit ja väljaheidete omadusi jälgiti ja registreeriti ravimi sekkumise perioodil. Iga rühma hiirte põhiseisund ja väljaheited registreeriti.

Tähemärgid, kaaluge 3 korda nädalas ja kohandage annust. 3., 7., 10. ja 14. päeval pärast manustamist koguti igalt hiirelt 3–4 graanulit värsket väljaheidet, kaaluti kohe ja registreeriti märgkaaluna, kuivatati ahjus ja registreeriti kuivkaaluna ja väljaheite niiskusena. sisu arvutati. Arvutage väljaheite niiskusesisaldus (%)=(märgkaal − kuivkaal)/märgkaal × 100%.

Peensoole tõukefunktsiooni määramine viidi läbi vastavalt teatmekirjanduses [11] ja "Tervistoiduainete funktsionaalsete funktsioonide testimise ja hindamise meetodid (2023. väljaanne)" nõutavatele eksperimentaalsetele meetoditele. Pärast viimast annust hoiti iga rühma hiired 16 tundi tühja kõhuga ja veevabad. Mudelrühm, ühendi valem Suure ja väikese annusega rühmadele ning positiivsele kontrollrühmale manustati sondiga loperamiidvesinikkloriidi suspensiooni (10 mg·kg-1) ja negatiivsele kontrollrühmale võrdne kogus puhast vett sondiga. 0,5 tundi hiljem anti suure ja väikese annusega ühendi rühmadele ning positiivsele kontrollrühmale tinti (sisaldab 5%), mis sisaldas vastavaid testitava proovi annuseid (3,6 g·kg-1, vastavalt 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1). (aktiivsöe pulber, 10% kummiaraabik) ning negatiivsetele ja mudelrühmadele manustati võrdses koguses tinti. Loomad tapeti kohe 0,5 tunni pärast emakakaela dislokatsiooniga ning mõõdeti "peensoole kogupikkus" ja "tindi edenemise pikkus". Arvutage tindi edenemise kiirus=tindi edenemise pikkus (cm) / peensoole kogupikkus (cm) × 100%.

MTL, GAS, TNF- ja IL-1 taseme tuvastamiseks seerumis võeti hiire silmamunadest veri, mida tsentrifuugiti 4 kraadi juures 3 500 r·min-1 10 minuti pärast võeti ülemine seerum ning MTL ja GAS hiire seerumis määrati ELISA komplekti järgi. ja TNF-, IL-1 tasemed.

H&E tuvastab patoloogilised muutused käärsoolekoes. Hiirte käärsoole pestakse tavalise soolalahusega ja inkubeeritakse 4% paraformaldehüüdis.

Need fikseeriti aldehüüdis, sisestati rutiinselt 24 tunni pärast, lõigati, küpsetati ja värviti H&E-ga ning käärsoolekoe patoloogilisi muutusi jälgiti valgusmikroskoobi all.

AQP3 ja c-Kit ekspressiooni tuvastamiseks käärsoolekoes kasutati immunohistokeemilist meetodit. Igast rühmast koguti hiirte käärsoolekuded.

Parafiini lõigud, vaha eemaldamine, hüdratsioon, antigeeni otsimine, endogeense katalaasi blokeerimine, blokeerimine 2% kitse seerumiga, vastavalt AQP3 ja c-Kit antikehade lisamine ning inkubeerimine üleöö 4 kraadi juures, fosfaatpuhverdatud soolalahus, PBS) 5 minutit hematoksüliini kontravärvimine etanooli dehüdratsioon, ksüleeni läbipaistvus, neutraalne kummitihendamine, skaneerimine skaneeriva mikroskoobi all ja Image J tarkvara kasutamine tulemuste analüüsimiseks.

AQP3 ja c-Kit ekspressiooni tuvastamiseks käärsoolekoes kasutati Western blot meetodit. Võtke 10 mg külmutatud hiire käärsoole kude ja asetage see tsentrifuugituubi koos 150 μL RIPA lüüsipuhvriga, mis sisaldab 1% proteaasi inhibiitorit. Kasutage koe homogeniseerimiseks kiirveskit. , tsentrifuugige homogenaati madala temperatuuriga tsentrifuugiga kiirusel 10 000 p/min-1 10 minutit, võtke supernatant, määrake valgu kontsentratsioon BCA valgu kvantifitseerimise meetodil, segage laadimispuhvriga, denatureerige valku ja analüüsida tulemusi vastavalt igale proovile. Laaditi 30 ug valku, viidi läbi SDS-PAGE elektroforees, viidi märg membraanile ja blokeeriti seejärel 5% lõssipulbriga toatemperatuuril 1,5 tundi, pesti kolm korda TBST-ga, asetati esmane antikeha loksutile ja inkubeeriti üleöö. 4 kraadi, seejärel eemaldati ja pesti TBST puhvriga. Peske 3 korda lahusega, inkubeerige sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril ja seejärel peske 3 korda TBST-ga. Värvide arendamiseks kasutatakse ECL-kemoluminestsents-töölahust ja arendamiseks täisautomaatset kemoluminestsentskujutise süsteemi. Tulemuste analüüsimiseks kasutatakse Image J tarkvara.

Statistilised meetodid Kõik selles katses kasutatud andmed on väljendatud keskmise ± standardhälbe kujul. Eksperimentaalsete andmete joonistamiseks kasutati GraphPad Prism ja rühmade võrdlus viidi läbi ühesuunalise ANOVA või kahesuunalise ANOVA abil; kui erinevused rühmade vahel olid statistiliselt olulised, kasutati vähima olulise erinevuse (LSD) meetodit. ) Tehke rühmade paaridevahelised võrdlused ja P < 0,05 loetakse statistiliselt oluliseks erinevuseks.