Perfluorooktaanhappe mõju soolestiku mikrobiootale ja mikroobide metaboliitidele C57BL/6J hiirtelⅡ

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Loomad

Nelja nädala vanused spetsiifilised patogeenivabad C57BL/6J isased hiired osteti firmast Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Hiired tarbisid joogivett ad libitum. Georgia ülikooli loomakasvatushoones hoiti 22 °C ja 40–70% niiskust 12:12-tunnise valguse ja pimeduse tsükli all. Enne PFOA kokkupuute katset peeti viis hiirt ühes puuris ja hiired vahetasid puure juhuslikult kord nädalas nelja nädala jooksul. PFOA kokkupuude algas siis, kui hiired olid kaheksa nädala vanused ja kokkupuuteperiood kestis neli nädalat. Katse alguses määrati hiired juhuslikult PFOA kokkupuute rühma või kontrollrühma (igas rühmas n=10 hiirt), ühes puuris oli üks hiir. PFOA-d (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) manustati hiirtele joogivee kaudu. PFOA lõppkontsentratsioon joogivees oli 1 miljondikosa (ppm). Annus valiti meie eelmise uuringu [24] põhjal. Kontrollhiired tarbisid joogivett ilma PFOA-d lisamata. Loomade protokolli kiitis heaks Georgia ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (protokolli kood: A2014 10-014-Y2-A1).

KLIKKIGE Kõhukinnisuse kodus kasutatavate vahendite juurde

2.2. Metaboliitide ekstraheerimine

Metaboliitide ekstraheerimine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [25]. Lühidalt, 20 µl igast seerumiproovist ekstraheeriti 225 µl metanooliga. Proove segati vorteksiga 10 sekundit. Seejärel lisati ülaltoodud proovidele faaside eraldumise esilekutsumiseks 750 µL metüül-tert-butüüleetrit (MTBE) ja 188 µL vett. Proove loksutati 4 ◦C juures 6 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine 14,000× g juures 2 minutit. Ekstraheerimislahusti degaseeriti ja eeljahutati temperatuurile –20 °C. Ülemine mittepolaarne faas (350 ui) koguti ja aurustati täieliku kuivaks, kasutades Labconco Centrivap külmalõksu kontsentraatorit (Labconco, Kansas, MO, USA). Maksa- ja väljaheiteproovide puhul lisati igale proovile 10 mg 225 µl metanooli ja 750 µl LMTBE-d. Proovid homogeniseeriti, kasutades aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) kiirusel 1500 p/min 30 liiva kohta, seejärel segati vorteksiga ja loksutati temperatuuril 4 °C 6 minutit. Seejärel lisati proovidele 188 µL vett, millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 14,000 × g 2 minutit. Ülemine mittepolaarne faas (350 ui) koguti ja aurustati täieliku kuivaks. Kuivatatud proovid resuspendeeriti seejärel 60 ui 4:1 atsetonitriilis ja vees (maht/maht) koos sisestandarditega. Proove segati keerisega, millele järgnes ultrahelitöötlus 5 minutit ja tsentrifuugimine kiirusel 14,000 × g 2 minutit. Supernatant koguti LC-MS analüüsi jaoks.

2.3. Sihtmärkimata metaboloomika profileerimine

Sihtmärkimata metaboolse profiili koostamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [25]. Vanquishi UHPLC süsteemi (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) kasutati metaboliitide eraldamiseks Acquity UPLC BEH Amide kolonniga (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), mis oli ühendatud Acquity VanGuard BEH Amide eel- kolonn (5 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, Waters, Milford, MA, USA). LC-MS-kvaliteediga vesi (100%) 10 mM ammooniumformiaadi ja 0,125% sipelghappega (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , USA) kasutati liikuva faasina A. Vahepeal kasutati liikuva faasina B 95:5 atsetonitriili: vett (maht/maht), mis sisaldas 10 mM ammooniumformiaati ja 0,125% sipelghapet. Gradient algas 100% B-ga temperatuuril 0–0 2 min, 70% Bat 7,7 min, 40% B 9,5 min ja 30% B 10,25 min, millele järgnes 100% B 12,75–16,75 min. Voolukiirus hoiti 0,4 ml/min juures. Spektrid koguti elektropihustusionisatsiooni (ESI) positiivses režiimis, kasutades Q-Exactive HF-i (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Massivahemikuks määrati m/z 60 kuni 900 MS/MS spektri omandamise andmetest sõltuva režiimiga. Sihtmärgistamata metaboloomika algandmed teisendati esmalt ABF-failideks, kasutades ABF-i muundurit (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (juurdepääs 6. juulil 2022)). Metaboliitide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati MSDIAL versiooni 5.1.0.1 [26]. Massispektri tunnuste loendi optimeerijat (MS-FLO) kasutati funktsioonide loendite kvaliteedi parandamiseks, märgistades funktsioonid andmete edasiseks kureerimiseks [27]. Säilitusaeg m/z raamatukogudMetaboliitide identifitseerimiseks kasutati Põhja-Ameerika MassBanki ja Fiehn HILIC MS/MS spektrite andmebaase.

2.4. 16S rRNA geenide sekveneerimine

Kogu DNA ekstraheeriti väljaheiteproovidest, kasutades PowerSoil® DNA isolatsioonikomplekti (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), järgides tootja juhiseid. 515F ja 806R praimereid kasutati 16S rRNAgeeni V4 piirkonna amplifitseerimiseks, millele järgnes normaliseerimise ja vöötkoodi abil. DNA sekveneeriti IlluminaMiSeq v2 komplektis 500 tsükliga. 16S rRNA geenide sekveneerimise andmeid analüüsiti, kasutades programmi Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) II [28]. Lühidalt, töötlemata sekveneerimisandmed eemaldati DADA2 kaudu, millele järgnes operatiivse taksonoomilise üksuse (OTU) valik. Andmebaasina kasutati SILVA-d (versioon 138), mida koolitas scikit-learn Naïve-Bayes-põhine klassifikaator.

2.5. Statistiline analüüs

Lineaarse diskrimineeriva analüüsi efekti suurust (LEfSe) kasutati bakteriperekondade määramiseks, mis kõige tõenäolisemalt selgitasid erinevusi PFOA ja kontrollrühmade vahel [29]. Metaboliitide võrdlemiseks kasutati PFOA ja kontrollrühmade vahelise p-väärtuste arvutamiseks Mann-Whitney U testi. Vale avastamise määra kasutati mitme võrdluse parandamiseks. Oluliseks peeti metaboliite p-väärtusega < 0.05. Osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüs (PLS-DA) ja raja rikastamise analüüs viidi läbi, kasutades MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmicsit kasutati soolestiku mikrobiota ja väljaheite metaboliitide integreerivaks analüüsiks – see on integreeriv raamistik omics-andmete mitmemõõtmeliseks analüüsiks [31].

Looduslik taimne ravim kõhukinnisuse leevendamiseks-Cistanche

Cistanche on parasiittaimede perekond, mis kuulub sugukonda Orobanchaceae. Need taimed on tuntud oma raviomaduste poolest ja neid on traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) kasutatud sajandeid. Cistanche liike leidub valdavalt Hiina, Mongoolia ja teiste Kesk-Aasia kuivades ja kõrbepiirkondades. Cistanche taimi iseloomustavad nende lihavad kollakad varred ja neid hinnatakse kõrgelt nende võimaliku tervisega seotud eeliste tõttu. TCM-is arvatakse, et Cistanche'il on toonilised omadused ja seda kasutatakse tavaliselt neerude toitmiseks, elujõu suurendamiseks ja seksuaalfunktsiooni toetamiseks. Seda kasutatakse ka vananemise, väsimuse ja üldise heaoluga seotud probleemide lahendamiseks. Kuigi Cistanche on traditsioonilises meditsiinis kasutatud pikka aega, on selle tõhususe ja ohutuse teaduslikud uuringud käimas ja piiratud. Siiski on teada, et see sisaldab mitmesuguseid bioaktiivseid ühendeid, nagu fenüületanoidglükosiidid, iridoidid, lignaanid ja polüsahhariidid, mis võivad kaasa aidata selle ravitoimele.

Wecistanche'i omacistanche pulber, tsitanche tabletid, cistanche kapslidja muud tooted on välja töötatud kasutadeskõrbcistanchetoorainena, mis kõik mõjuvad hästi kõhukinnisust leevendavalt. Spetsiifiline mehhanism on järgmine: Cistanche'il arvatakse olevat potentsiaalne kasu kõhukinnisuse leevendamisel, tuginedes selle traditsioonilisele kasutamisele ja teatud ühenditele, mida see sisaldab. Kuigi teaduslikud uuringud konkreetselt Cistanche mõju kohta kõhukinnisusele on piiratud, arvatakse, et sellel on mitu mehhanismi, mis võivad aidata kaasa selle potentsiaalile kõhukinnisust leevendada. Lahtistav toime:CistancheTraditsioonilises Hiina meditsiinis on seda juba pikka aega kasutatud kõhukinnisuse ravimina. Arvatakse, et sellel on kerge lahtistav toime, mis võib aidata soodustada soolte liikumist ja põhjustada kõhukinnisust. Selle toime võib seostada mitmesuguste Cistanche'i ühenditega, nagu fenüületanoidglükosiidid ja polüsahhariidid. Soolestiku niisutamine: traditsioonilise kasutuse põhjal arvatakse, et Cistanche on niisutavate omadustega, mis on suunatud just sooltele. Soolestiku niisutamise ja määrimise soodustamine võib aidata tööriistu pehmendada ja hõlbustada läbipääsu, leevendades seeläbi kõhukinnisust. Põletikuvastane toime: kõhukinnisust võib mõnikord seostada seedetrakti põletikuga. Cistanche sisaldab teatud ühendeid, sealhulgas fenüületanoidglükosiide ja lignaane, millel arvatakse olevat põletikuvastased omadused. Vähendades põletikku soolestikus, võib see aidata parandada väljaheite regulaarsust ja leevendada kõhukinnisust.