Cistanche Deserticola mõju rinnavähi rakuliini T{0}}D proliferatsioonile, apoptoosile ja migratsioonile LncRNA LIFR-AS1 reguleerimise kaudu

[Abstraktne]Eesmärk Uurida Cistanche deserticola mõju rinnavähi rakuliini T-47D proliferatsioonile, apoptoosile ja migratsioonile ning selle regulatsioonile pika ahelaga mittekodeeriva (Lnc) RNA leukeemia inhibeeriva faktori retseptori antisenss-RNA-1 suhtes. (LIFR-AS1). Meetod T-47D rakke kultiveeriti erinevates kontsentratsioonides (100, 200, 400 μ Cistanche deserticola vesiekstrakti kultiveerimine kultuurisöötmes g/ml 24 tundi, jaotatuna väikese, keskmise ja suure doosi rühmadesse Samal ajal kasutati kontrollrühmana normaalseid kultiveeritud rakke. Transfekteerige si-NC ja si-LIFR-AS1 T-47D-rakkudesse ja lisage 400 μ Kultiveerige g/ml Cistanche deserticola kultuuriga söödet 24 tunniks, sealhulgas Cistanche deserticola suure annuse ja si-NC rühma ja Cistanche deserticola suure annusega pluss si-LIFR-AS1 rühma Ekspressiooni tuvastamiseks kasutati reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT PCR). LIFR-AS1 tase; Raku proliferatsioonivõime tuvastamine plaadi kloonimise testi abil; Voolutsütomeetria kasutamine rakutsükli ja apoptoosi kiiruse tuvastamiseks; Rakkude migratsiooni võimet testiti kriimustustestiga. Tulemused Võrreldes kontrollrühmaga, ekspressioonitase ja apoptoosi kiirus LIFR-AS1 kontsentratsioon Cistanche deserticola keskmise ja suure annuse rühmas suurenes oluliselt, kloonide arv vähenes oluliselt, G0-G1 rakkude osakaal suurenes oluliselt ning S-rakkude ja kriimustuste paranemise osakaal. määr on oluliselt vähenenud (P<0 05); Compared with Cistanche deserticola high-dose+si NC group, the number of clones formed in Cistanche deserticola high-dose+si LIFR-AS1 group was significantly increased, the proportion of G0-G1 cells and the apoptosis rate were significantly reduced, and the proportion of S cells and the scratch healing rate were significantly increased (P<0 05). Conclusion Cistanche deserticola can induce cell cycle arrest by up-regulating the expression of LIFR-AS1, thereby reducing the proliferation of breast cancer cells, inducing apoptosis, and inhibiting cell migration.

[Märksõnad] Cistanche deserticola; Pika ahelaga mittekodeeriv (Lnc) RNA leukeemia inhibeeriva faktori retseptori antisenss-RNA-1 (LIFR-AS1); Rinnavähk; Levinud levik; Apoptoos; üleandmine

Rinnavähk on üks levinumaid pahaloomulisi kasvajaid kliinikutes. Rinnavähi esinemissagedus Hiinas on koguni 12,5 protsenti 2 protsenti, varajase rinnavähi ravimäär on üle 86 protsendi, kuid endiselt puudub tõhus marker rinnavähi varaseks diagnoosimiseks. rinnavähk. Radiochemical · 624 · Chinese Journal of Gerontology Vol.43, jaanuar 2023 ja muud terviklikud ravimeetodid võivad parandada patsientide raviefekti, kuid patsientide prognoos on halb. Praeguseks ei ole rinnavähi patogenees selgitatud. Varasemad uuringud on näidanud, et hüperosiidil, apigeniinil ja teistel ravimitel on rinnavähivastane toime, kuid selle spetsiifilist toimemehhanismi pole veel selgitatud [1-4].

Cistanche-kasvajavastased toimed

Cistanche deserticola kuulub Rubiaceae sugukonda kuuluvate mitmeaastaste viinapuude hulka, millel on neeru yangi toniseeriv ning tuult ja niiskust hajutav toime. Uuringud on näidanud, et Cistanche deserticolal on farmakoloogiline toime, nagu kasvajavastane ja antioksüdantne toime [5]. Cistanche deserticola terapeutiline toime rinnavähile ja selle võimalik mehhanism on aga selgitamata. Pika ahelaga mittekodeeriva (Lnc) RNA leukeemia inhibeeriva faktori retseptori antisenss-RNA-1 (LIFR-AS1) ekspressioon rinnavähi korral on madal ja see võib reguleerida rakkude proliferatsiooni ja migratsiooni [6]. Siiski pole teada, kas LIFR-AS1 saab kasutada Cistanche deserticola terapeutilise sihtmärgina rinnavähi vastu. Selle uuringu eesmärk oli uurida, kas Cistanche deserticola võib LIFR-AS1 reguleerimise kaudu mõjutada rinnavähirakkude T-47D proliferatsiooni, apoptoosi ja migratsiooni.

1 Materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid ja reaktiivid

Cistanche deserticola (20190203) osteti ettevõttelt Bozhou Baichuan Pharmaceutical Co., Ltd; Rinnavähirakk T-47D osteti ettevõttelt Guangzhou Saiku Biotechnology Co., Ltd.; Lipofectamine2000 (20190412) ja apoptoosi tuvastamise komplekt (20181223) osteti ettevõttelt Beijing Solaybao Technology Co., Ltd; Trizol reaktiiv (20181203) osteti ettevõttelt Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd; Pöördtranskriptsiooni (20181103) ja fluorestsents-kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tuvastamise reagendid (20181116) osteti ettevõttelt Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd; Si-NC ja si-LIFR-AS1 osteti ettevõttelt Shanghai Jima Pharmaceutical Technology Co., Ltd; Küüliku anti-inimese B-raku lümfoomi (Bcl) -2 ja Bcl-2 seotud X-valgu (Bax) antikehad osteti ettevõttelt Santa Cruz Company Ameerika Ühendriikidest; Mädarõika peroksüdaasiga (HRP) märgistatud kitse küülikuvastane IgG sekundaarne antikeha osteti ettevõttelt Wuhan Doctor Bioengineering Co., Ltd. StepOnePlus reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR instrument osteti ettevõttelt ABI Corporation Ameerika Ühendriikides; FACS Calibur voolutsütomeetria osteti USA-st Beckman Kurt Companylt.

Cistanche pulbri kasu tervisele - kasvajavastane

Cistanche toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Eksperimentaalne rühmitamine

Cistanche deserticola vesiekstrakt [7]: kaaluge 100 g ravimit Morinda officinalis, leotage 30 minutit vees ja seejärel keetke 60 minutit. Filtreerige veekeetmine ja keetke uuesti 45 minutit. Koguge filtraat kaks korda ja kontsentreerige alandatud rõhul mahuni 160 ml. Jahuta ja inkubeeri 24 tundi külmkapis. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 3000 p/min võtke supernatant ravimi kontsentratsiooniga 2 g/ml. Lahjendage kultuurilahus nõutava kontsentratsioonini 100, 200 ja 400 μg/ml. T-47D-rakke kultiveeriti erinevates kontsentratsioonides (100, 200, 400 μ Cistanche deserticola vesiekstrakti kultiveerimine kultuurisöötmes g/ml 24 tundi, jaotatuna madala, keskmise ja suure annusega rühmadesse Cistanche deserticola. Samal ajal kasutati kontrollrühmana normaalseid kultiveeritud rakke. Transfekteerige si-NC ja si-LIFR-AS1 T-47D rakkudesse ja lisage 400 μ Cistanche deserticola kultuurisöödet g/ml kultiveeriti 24 tundi, sealhulgas suures annuses Cistanche deserticola pluss si-NC rühma ja suure annusega Cistanche deserticola pluss si-LIFR-AS1 rühma.

1.3 LIFR AS1 ekspressioonitaseme tuvastamine reaalajas fluorestsentsi kvantifitseerimise (qRT) abil – PCR

Iga rühma T-47D-rakkude kogu-RNA ekstraheeriti Trizoli meetodil ja pöördtranskribeeriti cDNA sünteesimiseks. DeRNA ensüüm (DEPC) lisati ja lahjendati 20 korda vees enne säilitamist -20 kraadises külmikus. qRT-PCR süsteemi ja reaktsiooniprotseduuri kasutati vastavalt fluorestsentsi kvantitatiivse tuvastamise komplekti juhistele ning LIFR-AS1 (sisemine võrdlus-GAPDH) suhteline ekspressioon rakkudes tuvastati.

1.4 Plaatide kloonimise katse

Inokuleerige iga rühma T-47D-rakud 6-süvendiga plaadile (1 × 103 rakku süvendi kohta) ja asetage need seejärel 14 päevaks edasiseks kultiveerimiseks inkubaatorisse. Peske eeljahutatud fosfaatpuhvriga (PBS) ja lisage metanool (500 μl). Asetage see 20 minutiks -20 kraadisesse külmkappi, visake metanool ära ja lisage 1% kristallvioletset värvimislahust (400 μl). Inkubeerige toatemperatuuril 15 minutit ja pesta destilleeritud veega. Pärast kuivatamist jälgige moodustunud kloonide arvu.

1.5 Rakutsükli tuvastamise katse

T-47D-rakud igas rühmas (1 × inokuleerige 105 tükki/ml 96 süvendiga plaatidele (100 μl/süvend), tsentrifuugige kiirusel 3000 p/min 5 minutit, visake supernatant ära ja lisage eel -jahutatud PBS-i resuspendeeritud rakud (500 μl) Lisage rakususpensioonile eeljahutatud etanool (70 protsenti), visake supernatant ära ja lisage RNaasA (50 μl) Pärast { {13}}minutiline veevann temperatuuril 37 kraadi μ l) Inkubeerige seda 4 kraadises külmikus 30 minutit ja analüüsige rakutsüklite osakaalu igas rühmas, kasutades FACS Calibur voolutsütomeetriat ja Flowjoy tarkvara.

Kõrbes elav cistanche

1.6 Rakkude apoptoosi kiiruse voolutsütomeetria tuvastamine

Lisage T-47D-rakkudele pesemiseks eeljahutatud PBS, visake supernatant ära ja lisage rakusademele 500 μ Rakud resuspendeerige puhverlahusega, toimige vastavalt apoptoosi tuvastamise komplektile ja tuvastage rakkude apoptoosi kiirus.

1.7 Kriimustustesti

Inokuleerige T{{0}}D rakud 6-süvendiga plaadile (1 × 103 süvendi kohta) pärast iga rühma töötlemist tõmmake horisontaalsuunas joon võrdluseks kultuuriplaadi põhja. Pärast 48-tunnist kultiveerimist tõmmake uuesti joon ja jälgige kriimustuse laiust kahel ajahetkel, et arvutada kriimustuste paranemise kiirus [(kriimustuse laius 0 h - kriimustuse laius 48 h) / kriimustuse laius 0 h × 100 protsenti 〕.

1.8 Baxi ja Bcl-2 valgu ekspressiooni Western blot tuvastamine

Pärast T{{0}}D-rakkude koguvalgu ekstraheerimist tuvastage valgu kontsentratsioon ja võtke SDS PAGE reaktsiooni jaoks sobiv kogus valguproove. Pärast membraani ülekandmist ja sulgemist lisage esimene antikeha lahjendi (1:1000) ja teine ​​​​antikehalahjendi (1:5000) ning kasutage automaatset geelkuvamissüsteemi, et analüüsida iga valguriba halli väärtust. 1.9 Statistiline töötlemine SPSS 21 abil Tehke t-test ja ühesuunaline ANOVA tarkvara 0 abil.

Eksperimentaalne uuring Cistanche deserticola kohta

2 tulemust

2.1 Cistanche deserticola mõju T-47D proliferatsioonile ja LIFR-AS1 ekspressioonile

Võrreldes kontrollrühmaga oli LIFR-AS1 ekspressioonitase Cistanche deserticola keskmise ja suure annuse rühmas oluliselt kõrgem, kloonide arv vähenes oluliselt, G0-G1 faasi rakkude osakaal oli oluliselt suurem. ja S-faasi rakkude osakaal oli oluliselt väiksem ning iga indeksi erinevused Cistanche deserticola deserticola keskmise ja suure annuse rühma vahel olid statistiliselt olulised (kõik P<0. 01) 05), but there was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells among the groups (P>0 05), vaata tabelit 1.

2. 2 Cistanche deserticola mõju T-47D apoptoosile

Võrreldes kontrollrühmaga suurenesid apoptoosi määr ja Baxi valgu tase Cistanche deserticola keskmise ja suure annusega rühmas oluliselt, samas kui Bcl-2 valgu tase langes oluliselt. Erinevate näitajate erinevused Cistanche deserticola keskmise ja suure annusega rühmade vahel olid statistiliselt olulised (kõik P<0. 05) 05), as shown in Table 1, Figure 1, and Figure 2

Tabel 1 Cistanche deserticola mõju T-47D rakutsükli klooni moodustumisele, LIFR-AS1 ekspressioonile ja raku apoptoosile (x ± s, n=3)

Võrreldes kontrollrühmaga: 1) P<0 05; Compared with the low-dose group of Cistanche deserticola: 2) P<0 05; Compared with the medium and low dose group of Cistanche deserticola: 3) P<

Joonis 1: Cistanche deserticola mõju T-47D apoptoosile igas rühmas

1-4: kontrollrühm, Cistanche deserticola väikese annuse rühm, Cistanche deserticola keskmise annuse rühm, Cistanche deserticola suure annuse rühm

Joonis 2 Cistanche deserticola mõju T-47D apoptootilise valgu ekspressioonile

2.3 Morinda officinalis'e mõju T-47D-rändele

Võrreldes kontrollrühmaga [({{0}} ± 1,39) protsenti, siis Cistanche deserticola keskmise annusega rühm [(43 56 ± 1.00 protsenti) ja Cistanche deserticola suurte annuste rühmas [({8}} ± 0,72 protsenti ]) kriimustuste paranemise määr vähenes oluliselt ja Cistanche deserticola suure annuse rühmas oli oluliselt madalam kui Cistanche deserticola keskmise annuse rühmas (P<0 05).

2.4 Mõjuhäirimine LIFR-AS1-ga Cistanche deserticolaga ravitud T-47D proliferatsioonis

Võrreldes Cistanche deserticola suurte annuste pluss si NC rühmaga suurenes Cistanche deserticola suure annuse ja si LIFR-AS1 rühmas moodustunud kloonide arv oluliselt, G0-G1 rakkude osakaal vähenes oluliselt ja S-rakkude osakaal suurenes (P<0 There was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells between the two groups (P>0. 05) 05), vt tabel 2.

Tabel 2 häiriva LIFR-AS1 mõjud T-47D-rakkude tsüklile, klonogeneesile, apoptoosile ja migratsioonile Cistanche deserticola ravis (x ± s, n=3)

2. 5 häiriva LIFR-AS1 mõju Cistanche Deserticola ravi poolt indutseeritud T-47D apoptoosile

Võrreldes Cistanche deserticola suure annuse ja si-NC rühmaga, vähenes Cistanche deserticola suure annuse pluss si-LIFR-AS1 rühma apoptoosi määr, Bax valgu tase ja Bcl-2 valgu tase oluliselt. (P<0 05), see Table 2, Figure 3, and Figure 4.

LIFR-AS1 2.6 interferentsi mõju T-47D migratsioonile ja LIFR-AS1 ekspressioonile Cistanche deserticola töödeldud rakkudes

Võrreldes Cistanche deserticola suure annuse ja si-NC rühmaga, suurenes Cistanche deserticola suure annuse ja si-LIFR-AS1 rühma kriimustuste paranemise määr oluliselt ja LIFR-AS1 ekspressioon vähenes oluliselt (P<0 05), see Table 2.

Joonis 3 Häiriva LIFR-AS1 mõju T-47D apoptoosile Cistanche deserticola ravis

1-2, Cistanche deserticola suure annuse ja si-NC rühm, Cistanche deserticola suure annuse ja si-LIFR-AS1 rühm

Joonis 4: häiriva LIFR-AS1 mõju T-47D apoptoosi valgu ekspressioonile Cistanche deserticola ravis

3 Arutelu

Hiina taimsel ravimil on infektsioonivastane, kasvajavastane ja muud toimed. See on kerge ja võib patsientidel mõningaid sümptomeid tõhusalt leevendada, kuid rinnavähi patogenees on keerulisem. Hiina taimse meditsiini rinnavähi vastast molekulaarset mehhanismi pole veel selgitatud [8–10]. Cistanche deserticola parandab immuunsust, antioksüdatsiooni ja tõhusat osteoporoosi ravi, kuid selle spetsiifiline toimemehhanism pole veel teada [11,12]. Selle uuringu tulemused näitavad, et Cistanche deserticola võib vähendada rinnavähirakkude proliferatsiooni, indutseerides rakutsükli peatamist, ning see võib soodustada rinnavähirakkude apoptoosi ja pärssida rinnavähirakkude rakkude migratsiooni.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

LIFR-AS1 ekspressiooni vähenemine on seotud maovähi halva elulemusega [13]. LIFR-AS1 inhibeerib mitteväikerakk-kopsuvähi invasiooni ja metastaase läbi miR-942-5p/tsink finger protein (ZNF) 471 telje [14]. Need tulemused viitavad sellele, et LIFR-AS1 ekspressiooni häirimine võib oluliselt muuta Cistanche deserticola mõju rinnavähirakkude proliferatsioonile, apoptoosile ja migratsioonile.

Kokkuvõtteks võib öelda, et Cistanche deserticola võib indutseerida rakutsükli peatamist, nõrgendada rinnavähirakkude proliferatsioonivõimet, soodustada rakkude apoptoosi ja pärssida rakkude migratsiooni. Selle mehhanism on seotud LIFR-AS1 ekspressiooni ülesreguleerimisega.

Hiina herb cistanche-Antitumor

4 Viited

1 Si L, Fu J, Liu W et al. Silibiniin pärsib rinnavähi MDA-MB-231 rakkude migratsiooni ja invasiooni mitokondriaalse fusiooni indutseerimise kaudu〔J〕．Mol Cell Biochem, 2020; 463( 1-2) : 189-201．

2 Qiu J, Zhang T, Zhu X et al. Hüperosiid indutseerib rinnavähirakkude apoptoosi OS-vahendatud NF-κB signaaliraja kaudu〔J〕．Int J Mol Sci, 2019; 21(1): 131-41．

3 Võitis YS, Seo KI. Lupiwighteone indutseerib inimese rinnavähirakkudes kaspaasist sõltuva ja sõltumatu apoptoosi, pärssides PI3K/Akt/mTOＲ rada〔J〕． Food Chem Toxicol, 2020; 135 (1): 110863-9.

4 Bauer D, Mazzio E, Soliman KFA. Apigeniini täielik transkriptoomiline analüüs TNF-immunoaktiveeritud MDA-MB-231 rinnavähirakkudel〔J〕．Cancer Genomics Proteomics, 2019; 16(6): 421-31．

5 Lai Manxiang, Ruan Zhiyan, Xu Yiping Neere toniseeriva traditsioonilise hiina meditsiini Cistanche deserticola [J] farmakoloogiliste mõjude uurimine. Aasia ja Vaikse ookeani piirkonna traditsiooniline meditsiin, 2017; 13(1): 63-4．

6 Xu F, Li H, Hu C. LIFＲ-AS1 moduleerib Sufut, et pärssida rakkude proliferatsiooni ja migratsiooni miＲ-197-3p poolt rinnavähi korral〔J〕．BiosciＲep, 2019; 39(7): 1-9．

7 Ilizati Khalifu Cistanche deserticola vesiekstrakti mõju EGFR-i ja HER-2 valkude ekspressioonile osteosarkoomirakkudes in vitro [D]. Peking: Pekingi meditsiiniülikool, 2019

8 Kushwaha PP, Vardhan PS, Kapewangolo P, et al. Bulbine frutescens fütokemikaal inhibeerib sälku signaaliülekande rada ja kutsub esile apoptoosi kolmiknegatiivsetes ja luminaalsetes rinnavähirakkudes. 〔J〕．Life Sci, 2019; 234(1): 116783-9．

9 Zhao Z, Jin G, Ge Y jt. Naringeniin inhibeerib rinnavähirakkude migratsiooni põletikuliste ja apoptoosirakkude signaaliradade kaudu 〔J〕．Inflammopharmacology, 2019; 27(5): 1021-36．

10 Zan L, Chen Q, Zhang L jt. Epigallokatehhiingallaat (EGCG) pärsib rinnavähirakkude kasvu ja tuumorigeensust, vähendades miＲ-25〔J〕．Bioengineered, 2019; 10(1): 374-82．

11 Zhang Xuexin, Xiao Liuying, Pan Jingqiang Cistanche deserticola mõju hiire kasvajarakkude proliferatsioonile ning Baxi ja Bcl-2 valkude ekspressioonile [J]. Traditsiooniline Hiina meditsiin, 2011; 34(4): 598-601．

12 Li Yimin, Chen Jian, He Jianquan jt Cistanche deserticola ravimseerumi mõju proto-onkogeeni ja tuuma sidumisfaktori 1 mRNA ekspressioonile osteoblastide osteoklastide kaaskultuurisüsteemis ［ J］. Hiina gerontoloogia ajakiri, 2015; 35(9): 2328-31．

13 Wang HF, Lv JQ, Li HH jt. Kõrge pikk mittekodeeriv LIFＲ-AS1 ekspressioon korreleerub halva ellujäämisega maokartsinoomi korral〔J〕． Eur Ｒev Med Pharmacol Sci, 2020; 24(10): 5378-84．

14 Wang Q, Wu J, Huang H, et al．lncＲNA LIFＲ-AS1 pärsib mitteväikerakk-kopsuvähi invasiooni ja metastaase miＲ-942- 5p /ZNF471 telje kaudu〔J〕．Cancer Cell Int,2020; 20(1): 180190.