Abstraktne

Eesmärk: Uurida Cistanche'i sisaldava valemi (mis asendab verd toitvaid ja neere toniseerivaid algupäraseid ürte) mõju kasvufaktori - 2 (TGF- 2) ekspressiooni muutmisele, sklera ümberkujunemisele ja veetranspordile vormipuuduse lühinägelikkusega (FDM) rottidel, reguleerides caMCAVve11/1. (AQP1) rada.

Meetodid: Valiti nelikümmend SPF-klassi isast SD-rotti, millest 30 kasutati FDM-mudeli loomiseks. Pärast edukat modelleerimist jagati rotid FDM rühma, pirensepiini (PIR) rühma ja Cistanche valemi rühma, igas rühmas oli 10 rotti. Ülejäänud 10 modelleerimata rotti toimisid normaalse rühmana. Tavaline rühm ja FDM-rühm ei sekkunud. PIR-rühma raviti PIR-silmatilkadega kaks korda päevas (hommikul ja õhtul), samas kui Cistanche'i valemiga rühmale manustati maosisest Cistanche'i sisaldavat segu. Rottide murdumisviga ja aksiaalne pikkus tuvastati retinoskoobi ja diagnostilise instrumendi abil. Sklera koe morfoloogiliste muutuste jälgimiseks kasutati HE värvimist. TGF- 2 ekspressiooni tuvastamiseks sklerakoes kasutati immunohistokeemilist värvimist. AQP1 ja CAV1 valkude suhtelise ekspressioonitaseme määramiseks sklerakoes kasutati Western blot analüüsi. RT-PCR viidi läbi, et mõõta glutamaat-aspartaadi transporteri (GLAST) ja glutamaadi transporter 1 (GLT-1) mRNA suhtelisi ekspressioonitasemeid sklerakoes. Tulemused: Võrreldes normaalse rühmaga vähenesid oluliselt AQP1 ja CAV1 valkude murdumisviga, TGF- 2 ekspressioonitase ja suhteline ekspressioonitase FDM rühmas, Cistanche valemirühmas ja PIR rühmas, samas kui GLAST mRNA ja GLT-1 mRNA aksiaalne pikkus ja suhteline ekspressioonitase suurenesid oluliselt (kõik.05). Võrreldes FDM-rühmaga suurenesid Cistanche'i valemirühmas ja PIR-rühmas oluliselt AQP1 ja CAV1 valkude murdumisviga, TGF- 2 ekspressioonitase ja suhteline ekspressioonitase, samas kui GLAST mRNA ja GLT-1 mRNA aksiaalne pikkus ja suhteline ekspressioonitase olid oluliselt vähenenud (kõik P < 0,05). Võrreldes Cistanche'i valemirühmaga vähenesid PIR-rühmas oluliselt AQP1 ja CAV1 valkude murdumisviga, TGF- 2 ekspressioonitase ja suhtelised ekspressioonitasemed, samas kui GLAST mRNA ja GLT-1 mRNA aksiaalne pikkus ja suhteline ekspressioonitase suurenesid oluliselt (kõik P < 0,05). HE-värvimise tulemused näitasid, et normaalses rühmas ei esinenud ebanormaalseid muutusi võrkkesta iga kihi struktuuris; FDM rühma võrkkest hõrenes ja ganglionrakkude kihis ilmnesid tõsised vakuolaarsed muutused; suurendati Cistanche'i valemirühma ja PIR-rühma võrkkesta paksust, rakkude paigutus oli põhimõtteliselt korrapärane, ganglionrakkude arv suurenes ja rakud paiknesid igas kihis tihedalt, kusjuures kõige olulisem jõudlus oli Cistanche'i valemirühmas. Järeldus: Cistanche'i sisaldav valem avaldab FDM-i ravile teatud positiivset mõju ja selle mehhanism võib olla seotud CAV1, AQP1 ja TGF- 2 ekspressiooni reguleerimisega, samuti sklera ümberkujunemise ja veetranspordi funktsioonide tasakaalustamise ja parandamisega.

 

 

CISTANHE ÜRDIMISALDUS NEERUTÄGIMISE PARANDAMISEKS

 

 

Märksõnad

Vormi deprivatsiooni lühinägelikkus; Tsistanche'i sisaldav valem; Muutuv kasvufaktor- 2; akvaporiin 1; Caveoliin-1; Sklera ümberkujundamine; Veetransport

 

Viimastel aastatel on inimeste elustiili muutumise ja elektroonikaseadmete pideva arenguga ka lühinägelikkuse esinemissagedus tõusuteel. Levinud haigusena on sellest saanud ülemaailmne terviseprobleem. Form-deprivation lühinägelikkus (FDM) on lühinägelikkuse eritüüp, mis on tavaliselt põhjustatud silmade visuaalse stimulatsiooni puudumisest või vähenemisest. FDM mitte ainult ei häiri sklera ümberkujunemise protsessi, vaid põhjustab ka ebanormaalseid muutusi silmamuna kujus ja veetranspordi funktsiooni häireid, mis võivad veelgi süvendada sklerakoe kahjustusi ja deformatsioone. Aquaporin 1 (AQP1) on laialt levinud valk, mille põhiülesanne on soodustada veemolekulide kiiret transporti läbi rakumembraanide. Silmas on AQP1 jaotus ja funktsioon seotud silmasisese vedeliku dünaamilise tasakaaluga. Caveolin-1 (CAV1) on valk, mis osaleb rakumembraani mikrostruktuuride moodustamises ja signaaliülekandes. Silmas esineb CAV1 peamiselt võrkkesta pigmendi epiteelirakkudes ja fotoretseptori rakkudes ning on seotud visuaalsete signaalide edastamise ja silmasisese keskkonna stabiilsusega. Transformeeriv kasvufaktor- 2 (TGF- 2) on pleiotroopne tsütokiin, millel on mitu bioloogilist toimet, näiteks soodustab rakkude proliferatsiooni, diferentseerumist ja migratsiooni. Silmasiseses keskkonnas mängib TGF- 2 sarvkesta ja kõvakesta arengus ja säilitamises olulist rolli. Praegu on FDM-i peamine ravi ravimravi.

Traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) arvatakse, et lühinägelikkuse teke on seotud selliste teguritega nagu ebapiisav qi ja veri ning neeruessentsi puudulikkus. Neeru peetakse "kaasasündinud vundamendiks" ja see on tihedalt seotud silmade funktsiooniga. TCM väidab, et "neer juhib olemust ja essents toidab silmi; maks avaneb silmadesse ja piisav maksaverd tagab selge nägemise". Seetõttu on neerude toniseerimine ja vere toitmine TCM-i puudulikkuse sündroomidest põhjustatud silmahaiguste puhul alati olnud oluline ravipõhimõte.

Cistanche, tuntud kui "kõrbe ženšenn" ja üks "üheksast surematust ravimist" TCM-is, on meditsiinilise koostisosana rohkem kui 2000 aastat vana. Muistses TCM-klassikasse tipptasemel toitva ravimmaterjalina salvestatud Cistanche on kõrgelt hinnatud neerude toniseeriva, essentsi täiendamise, verd toitva ja kuivust niisutava toime tõttu. Erinevalt paljudest teistest TCM-i ürtidest kasvab Cistanche eranditult kõrbetes, parasiitidena peamiselt Tamarix ramosissima juurtel sellistes piirkondades nagu Xinjiang, Sise-Mongoolia ja Gansu Hiinas. Unikaalne kõrbekeskkond varustab seda rikkalike toimeainetega, sealhulgas ehhinakosiid, verbaskosiid ja flavonoidid, millel on teaduslikult tõestatud tugevad antioksüdantsed omadused, mis vähendavad rakkude apoptoosi ja soodustavad rakkude proliferatsiooni.

Kaasaegsed uuringud on näidanud, et Cistanche'il on märkimisväärne neere toitev toime. See võib vähendada neerurakkude apoptoosi, soodustada neerurakkude proliferatsiooni, parandada kahjustatud neerurakke ja laiendada neerude veresooni, parandades seeläbi neerufunktsiooni. Lisaks võib Cistanche tugevdada immuunsust, soodustades lümfotsüütide proliferatsiooni, seista vastu väsimusele, suurendades maksa glükogeeni tootmist, ja avaldada vananemisvastast toimet vabade radikaalide eemaldamise kaudu. Need bioloogilised tegevused on väga kooskõlas TCM-i teooriaga "neerude toniseerimine ja toitev essents" ning annavad ka teadusliku aluse selle kasutamiseks silmahaiguste ravis. Tuginedes TCM-i terapeutilisele põhimõttele toniseerida neere ja toita verd ning kombineerides Cistanche kaasaegseid farmakoloogilisi omadusi, asendas see uuring esialgsed verd toitvad ja neere toniseerivad ravimtaimed Cistanche'iga, et moodustada uus Cistanche'i sisaldav valem, ning uuriti selle efektiivsust ja mehhanismi FDM-i ravis, mille eesmärk on luua uus looduslik rapie idee. lühinägelikkus.

1 Materjalid ja meetodid

1.1 Katseloomad

Nelikümmend SPF-klassi isast SD-rotti, kaaluga 180–200 g ja vanuses 6–8 nädalat, osteti Pekingi Keyu loomakasvatuskeskusest [litsentsi nr: SCXK (Jing) 2022-0004] ja neid kasvatati regulaarselt Hiina Eye meditsiiniteaduste akadeemia loomahaiglas. See katse vastas „Katseloomade haldamise eeskirjade” asjakohastele sätetele ja selle kiitis heaks Hiina Hiina Meditsiiniteaduste Akadeemia silmahaigla meditsiinieetika komitee (partii nr: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Peamised reaktiivid ja instrumendid

Meditsiinilise materjalina kasutati Cistanche tubulosa (ostetud ettevõttelt Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., mille toimeained, sealhulgas ehhinakosiidi sisaldus on suurem või võrdne 30,0%, verbaskosiid on suurem või võrdne 12,0% ja fenetüülalkoholi glükosiidide kogusisaldus on suurem või võrdne 75,0%). pirentsepiin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Ühend Tropikamiidi silmatilgad (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., spetsifikatsioon 5 ml); 4 g·L⁻¹ oksübuprokaiinvesinikkloriidi silmatilku (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 antikeha (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1 antikeha (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktiini antikeha (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Kitse küülikuvastane IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE värvimiskomplekt (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Modelleerimismeetod ja rühmitamine

FDM mudeli loomiseks kasutati 30 rotti. Rotid anesteseeriti pentobarbitaalnaatriumi (30 mg-kg-1) intraperitoneaalse süstimisega. Pärast parema silma puhastamist ja desinfitseerimist povidoon-joodiga liimiti paremale silmale läbipaistmatu silmamask. Silmamaski kontrolliti iga päev eraldumise või kerge lekke suhtes ja liimiti uuesti, kui see oli lahti. Vasak silm jäi ravimata. Pärast 4-nädalast monokulaarse vormi puudumist viidi rottidele läbi binokulaarne retinoskoopia ja aksiaalse pikkuse mõõtmine. Modelleerimise edukriteeriumid: pärast tsüklopleegiat mõõdeti refraktsiooniviga retinoskoobi või automaatse refraktomeetriga ja ilmajäänud silmal ilmnes oluline lühinägelik nihe murdumisseisundis [st binokulaarse murdumisvea erinevus, mis on suurem või võrdne 2 D, loeti edukaks modelleerimiseks ja puuduliku silma keskmine lühinägelikkuse nihe oli umbes D ±5, võrreldes ..4 kontrolliga. Kõik 30 rotti modelleeriti edukalt ja jagati FDM-rühma, PIR-rühma ja Cistanche'i valemirühma, igas rühmas oli 10 rotti. Ülejäänud 10 modelleerimata rotti toimisid normaalse rühmana.

1.4 Sekkumismeetodid

Tavaline rühm ja FDM-rühm ei sekkunud. PIR-rühmale manustati 5 tilka PIR-silmatilku paremasse silma kaks korda päevas (hommikul ja õhtul) 2-minutilise intervalliga 15 päeva jooksul. Cistanche'i valemirühma sekkuti Cistanche'i sisaldava valemiga. Cistanche tubulosa (50 g, põhikoostisaine) keedeti veega ja kontsentreeriti meditsiiniliseks lahuseks kontsentratsiooniga 1000 g·L-1. Rottidele manustati maosiseselt annuses 12,70 g·kg⁻1 üks kord päevas 15 päeva jooksul. Cistanche annus määrati selle kliinilise kasutuskogemuse ja kaasaegsete farmakoloogiliste uuringute põhjal, tagades selliste toimeainete nagu ehhinakosiid ja verbaskosiid efektiivsed kontsentratsioonid.

1.5 Tuvastamismeetodid

1.5.1 Murdumisvea ja aksiaalpikkuse muutuste hindamine

Morfoloogilise ja murdumisvea tuvastamine: 24 tundi pärast vormi äravõtmise lõppu valiti igast rühmast tuvastamiseks juhuslikult 3 rotti. Enne katset pandi rotid 30 minutiks pimedaks kohandatud keskkonda, seejärel tuimastati isofluraani sissehingamise teel ja kinnitati spetsiaalsele loomaklambrile. Silmamuna panoraamseks skaneerimiseks kasutati kõrge eraldusvõimega OCT-kuvamissüsteemi. Skaneerimise ajal reguleeriti sond sarvkestaga risti, et saada võrkkesta ja läätse selged ristlõikepildid. Iga silma skaneeriti 3 korda järjest ja süsteemi sisseehitatud tarkvara abil mõõdeti sfäärilise ekvivalendi murdumisvea arvutamiseks automaatselt telgkaugust sarvkesta eesmisest pinnast võrkkesta pigmendiepiteeli kihini (st aksiaalset pikkust). Andmete täpsuse tagamiseks analüüsisid kaks professionaalselt koolitatud teadlast sõltumatult pilte pimesi. Kui kahe mõõtetulemuse erinevus oli suurem kui 0,50 D, jäeti andmed kõrvale ja mõõdeti uuesti. Aksiaalse pikkuse kinnitav tuvastamine: ÜMT mõõtmistulemuste kontrollimiseks kasutati ka A-scan ultrahelidiagnostilist instrumenti. Kõigepealt tilgutati rottide mõlemasse silma oksübuprokaiinvesinikkloriidi silmatilgad paikseks anesteesiaks ja seejärel asetati A-skaneerimise sond õrnalt sarvkestaga kontakti. Seade reguleeriti käsitsi režiimile ja täpne ultraheli levimiskiirus määrati vastavalt silmasisesele keskkonnale: 1540 m·s⁻¹ eesmise kambri ja klaaskeha jaoks. Töötamise ajal paiknes iga liides käsitsi märgistamise teel ja keskmise väärtuse saamiseks mõõdeti iga silma 3 korda korduvalt. See katse viidi läbi pimestatud viisil ja kõik operaatorid said ühtse väljaõppe, et tagada järjepidevad mõõtmistehnikad. Instrument kalibreeriti enne mõõtmist ja mõned proovid valiti juhuslikult korratavuse testimiseks, et hinnata klassisiseseid ja klassidevahelisi korrelatsioonikordajaid (ICC). Andmete teaduslikkuse ja usaldusväärsuse tagamiseks järgiti katse ajal rangeid standardiseeritud tööprotseduure.

1.5.2 HE värvimine

Pärast murdumisvea ja aksiaalse pikkuse tuvastamist ohverdati rotid liigse anesteesia abil. Mõlema silma silmalaud ja ümbritsevad kuded desinfitseeriti ning märgiti sarvkesta keskpunktiga risti asetsev nina- ja temporaalne limbus. Sidekesta lõigati vastavalt märkidele ja silmamuna tuumast eemaldati. Limbusele tehti sisselõige, et eemaldada eesmise segmendi kude ja klaaskeha ning sklera kude jäeti alles. Sklerakude fikseeriti 40 g·L⁻¹ paraformaldehüüdiga 24 tundi, dehüdreeriti gradient-etanooliga, sisestati rutiinselt parafiini, puhastati ksüleeniga, paigaldati neutraalse palsamiga, lõigati 5 μm, värviti HE-ga ja vaadeldi optiliste morfoloogiliste muutuste suhtes koes.

1.5.3 Immunohistokeemiline värvimine TGF- 2 ekspressiooni jaoks sklerakoes

Igast rühmast valiti kaks rotti. Sklerakoe lõigud allutati antigeeni otsimisele ja blokeerimisele, inkubeeriti hiire anti-TGF- 2-ga (1:3000) 24 tundi, pesti, inkubeeriti sekundaarse antikehaga (1:2000) 1 tund, neid arendati ja värviti rutiinselt, vaadeldi neutraalse palsamiga ning tehti 2-3 optilise koe muutusi. Positiivse osa halli väärtuse tuvastas pildianalüüsi süsteem.

1.5.4 Western blot AQP1 ja CAV1 valgu ekspressioonitasemete tuvastamine sklerakoes

Igast rühmast valiti kaks rotti. Sklera kude lõigati välja, homogeniseeriti ja kogu valk ekstraheeriti RIPA lüüsipuhvri lisamisega. Viidi läbi valkude denatureerimine, kvantifitseerimine, elektroforees, membraaniülekanne ja blokeerimine. Lisati primaarsed antikehad AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) ja -aktiini antikeha (1:2000) ja inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. Lisati sekundaarne antikeha (1:2000) ja inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund. Lisati ECL reaktiiv ja valguhalli väärtust analüüsiti Image Lab tarkvaraga. Sihtriba halli väärtuse suhe -aktiini omasse oli selle suhteline ekspressioonitase.

1.5.5 RT-PCR abil GLAST-i ja GLT-1 mRNA ekspressiooni tuvastamine sklerakoes

Võeti järelejäänud rottide sklerakude ja kogu RNA ekstraheeriti Trizoli meetodil. Kogu RNA mõõdeti spektrofotomeetriga ja cDNA pöördtranskribeeriti vastavalt komplekti juhistele. RT-PCR reaktsioonisüsteem valmistati järgmiste reaktsioonitingimustega: 75 kraadi 30 sekundit, 85 kraadi 60 sekundit, 80 kraadi lõõmutamiseks 30 sekundit, 65 kraadi pikendamiseks 30 sekundit, kokku 40 tsüklit. Sisemise võrdlusalusena aktiiniga arvutati glutamaat-aspartaadi transporteri (GLAST) ja glutamaadi transporteri 1 (GLT-1) suhtelised ekspressioonitasemed 2⁻ΔΔCt meetodil. Praimeri järjestused on näidatud tabelis 1. Rühmadevaheliseks võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi ja rühmade paaris võrdlemiseks LSD-t testi. Testitase:=0.05.