EDS{0}}interakteeruv J-valk 1 on Arabidopsises taime kaasasündinud immuunsuse oluline negatiivne regulaator

Abstraktne

Taimed on välja töötanud täpsed mehhanismid, et optimeerida immuunvastust patogeenide vastu. TÕHENDATUD HAIGUSTE TUNDLIKUS 1 (EDS1) mängib olulist rolli taime kaasasündinud immuunsuses, reguleerides basaalresistentsust ja efektori poolt käivitatud immuunsust. Resistentsuse tugevdamiseks on vajalik EDS1 nukleotsütoplasmaatiline kaubitsemine, kuid molekulaarne mehhanism jääb tabamatuks. Siin näitame, et EDS1-INTERACTING J PROTEIN1 (EIJ1), mis toimib vastusena patogeeni nakatumisele DnaJ-valgusarnase chaperonina, toimib EDS1-ga suheldes taimede immuunsuse olulise negatiivse regulaatorina. EIJ1 funktsiooni kadumise mutatsioon ei mõjutanud taimede kasvu, kuid suurendas oluliselt patogeeni resistentsust. Patogeeniga nakatumisel lokaliseerus EIJ1 kloroplastist tsütoplasmasse, kus see interakteerub EDS1-ga, piirates seeläbi patogeeni poolt põhjustatud EDS1 kaubitsemist tuuma ja ohustades resistentsust nakkuse varases staadiumis. Haiguse arengu ajal lagunes EIJ1 järk-järgult, võimaldades EDS1 tuumaakumuleerumist transkriptsiooniresistentsuse tugevdamiseks. Avirulentne tüvi Pst DC3000 (AvrRps4) kaotas EIJ1 repressiivse toime, kutsudes kiiresti esile selle lagunemise efektori poolt käivitatud immuunsusreaktsioonis. Seega näitavad meie leiud, et EIJ1 on oluline EDS{23}}sõltuv negatiivne kaasasündinud taimeimmuunsuse regulaator ja annab mehaanilise arusaama sellest, kuidas immuunvastuse ajal reguleeritakse EDS1 tuuma ja tsütoplasma jaotust.

cistanche on kasulikud - tugevdab immuunsüsteemi

Sissejuhatus

Taimed on oma immuunvastuste moduleerimiseks välja töötanud keerulise võrgu. Et kaitsta end patogeenide eest, kasutavad taimed kahte peamist regulatiivset strateegiat: mustri käivitatud immuunsus (PTI) ja efektor-käivitatud immuunsus (ETI). PTI-d juhivad mustrituvastusretseptorid (PRR), mis tunnevad ära patogeenide või mikroobidega seotud molekulaarmustrid (Zipfel, 2008). Nakatumise hõlbustamiseks pärsivad virulentsed patogeenid PTI-d, sekreteerides patogeeni efektoreid, ja nad manipuleerivad peremeesrakke, et hõlbustada toitainete omandamist ja lõpuks paljunemist (Tsuda ja Katagiri, 2010). Taime madalat resistentsust nende virulentsete patogeenide suhtes nimetatakse basaalresistentsuseks (Jones ja Dangl, 2006; Klessig et al., 2018). Teisest küljest vahendavad ETI-d taimede poolt kodeeritud haigusresistentsuse (R) valgud, mis võivad otseselt või kaudselt ära tunda patogeenide sekreteeritud efektorite olemasolu (Tsuda ja Katagiri, 2010). Enamik R-valke sisaldab nukleotiidi sidumissaiti ja leutsiinirikast kordusdomeeni (NB-LRR). NB-LRR valgud, mis sisaldavad N-terminaalset Toll/Interleukiini-1 retseptori (TIR) ​​valgu ja valgu interaktsiooni domeeni, on tuntud kui TIR-NB-LRR (TNL) valgud ja need moodustavad suurima NB-valkude rühma. LRR valgud (Caplan et al., 2008). Võrreldes basaalresistentsusega kutsub ETI esile tugevama ja kiirema kaitsereaktsiooni patogeenide vastu ning sellega kaasneb sageli lokaalne rakusurm, mis on ülitundliku reaktsiooni iseloomulik tunnus (HR; Dodds ja Rathjen, 2010). TÕHENDATUD HAIGUSTE TUNDLIKUS 1 (EDS1), taimede immuunsuse keskne regulaator, aitab kontrollida põhiresistentsust, piirates biotroofsete ja hemibiotroofsete patogeenide sissetungi (Wiermer et al., 2005). EDS1 mängib olulist rolli ka ETI-s, mida vahendab peamiselt R-valkude klass TNL (Heidrich et al., 2012). EDS1 teeb tihedat koostööd oma tsütoplasmas ja/või tuumas olevate kaasregulaatoritega PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 ja SENESCENTSIGA SEOTUD GEENI 101, et reguleerida rakusisest reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist, salitsüülhappe (SA) akumulatsiooni ja muid protsesse, tugevdades seega patogeenide resistentsust (Ruste). ´rucci et al., 2001; Rietz jt, 2011; Wagner jt, 2013). Seega on Arabidopsis eds1 mutant Pseudomonas syringae pv suhtes väga vastuvõtlik. tomati (Pst) tüvi DC3000 ja sellel on kahjustatud TNL-vahendatud ETI, mille puhul on inhibeeritud ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1; SA biosünteetiline geen) ekspressioon ja SA biosüntees (Parker et al., 1996; Feys et al., 2001; Bartsch et al. al., 2006). Lisaks näitab EDS1 valgu liikumist tsütoplasma ja tuuma vahel, mida vahendavad tuumatranspordi retseptorid (Garcı´a et al., 2010). Kuigi EDS1 tuumafunktsioonid hõlmavad põhiresistentsust ja ROS-i tootmist, nõuab programmeeritud rakusurm ja resistentsuse tugevdamine EDS1 tuuma ja tsütoplasma lokaliseerimise koordineerimist (Heidrich et al., 2011). Tasakaal tsütosoolis oleva EDS1 koguse ja tuumas oleva koguse vahel on oluline tõhusa basaalresistentsuse ja TNL-i käivitatud immuunsuse jaoks (Garcı´a et al., 2010). Siiski jääb ebaselgeks, kuidas EDS1 säilitab nukleotsütoplasmaatilise jaotusmustri taime kaasasündinud immuunvastuste ajal. DnaJ-valgud (või J-valgud) on chaperone-valgud (Pulido ja Leister, 2018), mis kuuluvad tsüsteiini (Cys)-rikka domeeni superperekonda ja osalevad tekkivate valkude voltimises ja kokkupanemises, valkude transpordis läbi membraanide koos järgneva ümbervoltimisega ja voldimata või defektsete valkude kõrvaldamine (Bukau et al., 2006). Need protsessid on vajalikud enamiku rakuvalkude normaalseks funktsioneerimiseks erinevates arenguetappides (Pulido ja Leister, 2018). Erinevate organismide uuringud näitavad, et DnaJ-valgud mängivad ka biootilistes ja abiootilistes stressireaktsioonides, eriti immuunvastustes, erinevat rolli. Nicotiana benthamiana puhul toimib DnaJ valk Nb-MIP1 košaperoonina vastuseks viiruspatogeenidele (Du et al., 2013). Sojaoa (Glycine max L.) Gm-soojusšoki valk 40 (HSP40.1), tuumas lokaliseeritud DnaJ valk, on soja mosaiikviiruse suhtes resistentsuse positiivne regulaator (Liu ja Whitham, 2013). Tomatites (Solanum lycopersicum) teatati, et kloroplastis lokaliseeritud DnaJ valk Le-CDJ2 parandas resistentsust bakteriaalse patogeeni Pseudomonas solanacearum suhtes (Wang et al., 2014). Lisaks teatati, et Tsi1- interakteeruv valk1 (Tsip1), tubaka (Nicotiana tabacum) DnaJ valk, reguleerib vastusena stressile Tsi{71}}vahendatud transkriptsioonilist aktivatsiooni (Ham et al., 2006). Need tulemused näitavad selgelt, et DnaJ valgud mängivad taimede immuunsuses olulist rolli, kuigi nende aluseks olevad mehhanismid nõuavad täiendavat uurimist. Selles uuringus eraldasime Arabidopsis thaliana EDS1 INTERACTING J PROTEIN 1 (EIJ1), HSP{76}}sarnase DnaJ valgu, ja näitasime, et EIJ1 interakteerub EDS1-ga taimes. Funktsiooni kaotanud eij1 mutantsed taimed näitasid normaalset kasvu, tugevamat patogeeniresistentsust ja resistentsusega seotud geenide kõrgemat ekspressiooni patogeenidega nakatumisel võrreldes metsiktüüpi taimedega. Siiski ei päästnud EIJ1 funktsiooni kadumise mutatsioon Pst DC3000-ga nakatamisel eds1 mutandi vastuvõtlikku fenotüüpi. Lisaks vabanes EIJ1 valk, mis tavaliselt lokaliseerub kloroplastile, patogeeni inokuleerimisel kloroplastist tsütoplasmasse, kus see interakteerub EDS1-ga, takistades seega selle patogeeni poolt käivitatud kaubitsemist tuuma ja seega ohustades resistentsusreaktsiooni varakult. infektsiooni staadium. Need leiud selgitavad EDS1 nukleotsütoplasmaatilise jaotusmustri aluseks oleva regulatiivse mehhanismi olulisi üksikasju ja pakuvad potentsiaalselt tõhusat sihtmärki põllukultuuride haigusresistentsuse aretamiseks.

cistanche on kasulikud - tugevdab immuunsüsteemi

Tulemused

EIJ1 interakteerub EDS1-ga in vitro ja in vivo

Taimekaitsereaktsioonide olulise komponendina asub EDS1 taime kaasasündinud immuunsuse signaalimisvõrgu võtmesõlmes. EDS1 potentsiaalsete interakteeruvate valgupartnerite tuvastamiseks viisime läbi pärmi kahe hübriidse sõelumise. EDS1 näitas tugevat koostoimet tundmatu funktsiooniga Arabidopsis HSP40--taolise chaperone valguga (AT2G24860) (joonis 1, A ja B), mis kuulub DnaJ superperekonda (täiendav joonis 1A); seda valku nimetatakse edaspidi EIJ1-ks. Järjestuse analüüs näitas, et EIJ1 sisaldab 144 aminohappejääki, sealhulgas nelja Cys-rikast Zn-sõrme motiivi (CXXCXGXG; täiendav joonis 1A). Kuigi teistel katteseemneliikidel on EIJ1 homoloogid, näivad lähimad homoloogid piirduvat Brassicaceae'ga (täiendav joonis 1B ja fail S1). Nimelt näitas EIJ1 järjestuse sarnasust N. tabacum Tsip1 valguga, mis on seotud patogeeniresistentsusega (täiendav joonis 1B; Ham et al., 2006). EDS1 ja EIJ1 vahelise interaktsiooni eest vastutavate funktsionaalsete domeenide tuvastamiseks kasutati pärmi kahehübriidtestides nende valkude kahte kärbitud versiooni (joonis 1A; täiendav joonis 1A). EIJ1 N-ots näitas tugevat interaktsiooni nii täispika EDS1 kui ka EDS1 N-otsaga, kuid nõrka interaktsiooni EDS1 C-otsaga (joonis 1B). See viitab sellele, et EDS1 N-ots, mis sisaldab lipaasisarnast domeeni, ja EIJ1 N-ots on nende koostoimeks vajalikud ja piisavad. Kuigi EIJ1 C-ots sisaldab konserveerunud Cys-rikast Zn-sõrme domeeni, mis võib hõlbustada selle seondumist DNA või muude valkudega, ei aita see kaasa interaktsioonile EDS1-ga. Allatõmmetestid kontrollisid veelgi EDS1 ja EIJ1 vahelist koostoimet in vitro (joonis 1C), samas kui kaasimmunosadestamise (Co-IP) testid, kasutades 35Spro: EIJ1- 6HA 35Spro: EDS1-3FLAG transgeenseid taimi kinnitas nende koostoimet taimes (joonis 1D). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et EDS1 interakteerub EIJ1-ga nii in vitro kui ka in vivo. EIJ1 iseloomustus EIJ1 subtsellulaarse lokaliseerimise määramiseks liitsime EIJ1 avatud lugemisraami mCherry reportergeeniga lillkapsa mosaiikviiruse 35S promootori kontrolli all, et genereerida 35Spro: EIJ{56}}mCherry konstrukt. See konstruktsioon muudeti ajutiselt N. benthamiana lehtedeks agroinfiltratsiooni teel. Fluorestsentsmikroskoopia näitas, et EIJ1-mCherry paiknes nii kloroplastis kui ka tuumas (joonis 2A). Seda lokaliseerimismustrit kinnitati transgeensete 35Spro: EIJ1-6HA taimede immunoblotanalüüsiga (täiendav joonis 2). EIJ1 ekspressioonimustri uurimiseks liideti EIJ1 genoomne järjestus ß-glükuronidaasi (GUS) reportergeeniga, et genereerida EIJ1pro: EIJ1-GUS transgeensed Arabidopsise liinid. Rosettide lehtedel ja juurtel tuvastati tugev GUS aktiivsus; GUS-i aktiivsus oli aga silikides nõrk ning vartel ja lilledel tuvastamatu (joonis 2B). Need tulemused olid kooskõlas EIJ1 ekspressioonitulemustega, mida uuriti kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni-PCR (RT-PCR) abil erinevates kudedes (joonis 2C). Arvestades, et EDS1 on taimede immuunsuse keskne regulaator (Saika et al., 2011), uurisime, kas EIJ1, oletatav EDS1 kofaktor, osaleb ka vastusena patogeeni infektsioonile. EIJ1 transkripti tase indutseeriti töötlemisel kas hemibiotroofsete bakteritega Pst DC3000 või SA (joonis 2D). GUS-värvimine näitas, et EIJ1 indutseeriti ja kontsentreeriti märkimisväärselt Pst DC 3000- inokuleeritud lehtede trikhoomide ümber (joonis 2E–G), mis viitab EIJ1 võimalikule bioloogilisele tähtsusele kaitsereaktsioonis (Xin ja He, 2013). Järgmisena uurisime EIJ1 taset 35Spro: EIJ1-HA taimedes, mida on töödeldud Pst DC3000 või SA-ga. Huvitav on see, et Pst DC3000 või SA töötlemisel lagunes EIJ1 pärast kiiret induktsiooni järk-järgult (joonis 2, H ja I). See tulemus ei olnud kooskõlas patogeeniga nakatumise ajal 35Spro: EIJ1-HA taimedes täheldatud stabiilse EIJ1-HA ekspressioonimustriga (täiendav joonis 3), mis näitab EIJ1 transkriptsioonijärgset regulatsiooni. Need tulemused näitavad koos, et EIJ1 osaleb taime immuunvastuses.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

EIJ1 funktsiooni kaotuse mutatsioon suurendab SA raja kaudu resistentsust Pst DC3000 suhtes

Et uurida EIJ1 rolli taimede immuunsuses, tuvastasime Arabidopsise mutandi (SALK_142975), mis sisaldab T-DNA insertsiooni EIJ1 kolmandas eksonis (joonis 3, A ja B). Kvantitatiivne RT-PCR analüüs näitas, et EIJ1 ekspresseeriti selles eij1 T-DNA sisestusmutandis halvasti; seetõttu panime sellele EIJ1 alleelile nimeks eij{{10}} (joonis 3C). Seejärel hindasime 3-nädala vanuste eij1-1 mutantsete taimede ja Arabidopsis (A. thaliana) ökotüübi Columbia (Col-0; metsiktüüpi) taimede haigusresistentsuse fenotüüpi inokuleerimise teel Pst DC3000. Nakatunud lehtede hindamine 5 päeva pärast inokuleerimist (dpi) näitas, et eij1-1 lehtedel on vähem nekrootilisi kahjustusi kui Col-0 lehtedel (joonis 3D). Järjekindlalt näitasid eij1-1 lehed 5 dpi juures oluliselt madalamat bakterite tiitrit kui Col-0 lehed, kuigi bakterite tiiter ei näidanud erinevust Col-0 ja eij1-1 lehtede vahel. 0 dpi (joonis 3E). Järgmisena genereerisime eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA komplementatsiooniliinid, transformeerides EIJ1 genoomse fragmendi, mis on liidetud 6xHA märgisejärjestusega, eij1-1 taustaks. Komplementatsiooniliinid päästsid täielikult eij1-1 patogeeniresistentsuse fenotüübi (joonis 3E), kinnitades, et eij1-1 on funktsiooni kadumisega mutant. Et määrata EIJ1 mõju apoplastilisele immuunsusele, hinnati nende komplementatsiooniliinide haigusresistentsuse fenotüüpi ka Pst DC3000 surveinfiltratsiooniga ja saadi sarnased tulemused (täiendav joonis 4A). EIJ1 funktsiooni kinnitamiseks tuvastasime seejärel teise Arabidopsise mutandi eij1-2 (WiscDsLox343G09), mis sisaldas T-DNA insertsiooni EIJ1 promootori piirkonnas (täiendav joonis 5, A ja B). EIJ1 transkriptid olid eij1-2 mutandis vaevu tuvastatavad, mis näitab, et eij1-2 on EIJ1 nullalleel. Sarnaselt eij1-1-ga näitasid bakterite kasvutestid, et eij1-2 esines oluliselt madalama bakteritiitri juures kui Col-0 (täiendav joonis 5, D ja E). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et EIJ1 mängib taime immuunvastuses olulist repressiivset rolli.

Joonis 1 EIJ1 interakteerub EDS1-ga in vitro ja in planta. (A) Skemaatiline diagramm, mis näitab EIJ1, EDS1 leitud domeene ja nende kärbitud versioone. (B) Pärmi kahe hübriidanalüüsid näitavad koostoimeid EIJ1, EDS1 ja nende kärbitud versioonide vahel. Transformeeritud pärmirakke kasvatati SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade ja SD/-Trp/-Leu söötmel. Tühjad, ainult vektori juhtnupud; AD, aktiveerimisdomeen; BD, DNA-d siduv domeen. (C) Allatõmmatav test, mis näitab otsest koostoimet His-EIJ1 ja GST-EDS1 sulandvalkude vahel in vitro. His-EIJ1 valke inkubeeriti immobiliseeritud GST või GST-EDS1 valguga. Immunosadestatud fraktsioonid tuvastati vastavalt anti-His ja anti-GST antikehadega. (D) Co-IP, mis näitab EIJ1 ja EDS1 koostoimet Arabidopsise lehtedes. 3-Nädala vanustest 35Spro: EIJ1-6HA (genotüübi kontrolliks) ja 35Spro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG lehtedest ekstraheeritud koguvalgud immunosadestati kas anti-FLAG antikeha või preimmuunseerum (IgG). Koimmunosadestatud valgud tuvastati vastavalt anti-FLAG ja anti-HA antikehade abil. Punktis (B – D) esitatud tüüpilisi tulemusi korrati sõltumatult kolm korda.

Vesinikperoksiidi (H2O2), teatud tüüpi reaktiivsete hapnikuliikide tootmine on patogeenide eduka äratundmise ja järgneva taimekaitsereaktsioonide, sealhulgas HR-ga seotud programmeeritud rakusurma, tunnuseks (Lam et al., 2001; Torres et al. al., 2006; Nanda et al., 2010). Seetõttu jälgisime H2O2 taset 3-nädala vanuste patogeenidega inokuleeritud Col-0, eij1-1 ja eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA taimed, kasutades 3,3-diaminobensidiini (DAB) värvimismeetodit. Tulemused näitasid, et H2O2 kogunes nakatunud taimedes kõrgele tasemele, kuid seda ei tuvastatud inokuleerimata (pilt) taimedes (joonis 3F). Eij1-1 lehtedes tuvastati kõrgem H2O2 tase kui Pst DC3000-ga nakatatud Col- 0 lehtedes ja komplementatsiooniliinides (joonis 3F). Peale selle, kuigi trüpaansinisega värvimine näitas, et rakusurm (microHR, Alvarez et al., 1998) toimus eij1-1 lehtedes 24-h pärast inokuleerimist (HPI) Pst DC3000-ga, kuid mitte. microHR täheldati Col-0 ja eij1-1 EIJpro1:EIJ1-6HA taimedes (joonis 3G). Inokuleerimine avirulentse Pst DC3000-ga (AvrRps4) põhjustas suurema H2O2 akumulatsiooni ja rohkem mikroHR-i, kuigi nende kolme genotüübi vahel ei täheldatud nähtavat erinevust (joonis 3, F ja G). Need tulemused viitasid EIJ1 olulisele rollile põhiresistentsuses patogeenide suhtes.

Joonis 2 EIJ1 mRNA ja valgu ekspressioonimuster. (A) EIJ1 kloroplasti ja tuuma lokaliseerimine. EIJ1-mCherry liitvalku ekspresseeriti ajutiselt N. benthamiana lehtedes ja analüüsiti konfokaalse mikroskoopiaga. DAPI fluorestsents näitab tuuma. Klorofülli fluorestsents on näidatud rohelise värvina. Baar=10 lm. (B) GUS-värvimine, mis näitab EIJ1 ekspressiooni juurtes, vartes, rosettlehtedes, lilledes, silikides ja 10-päevastes seemikutes (vasakult paremale). Riba=1 mm. (C) EIJ1 ekspressioonimuster Col taimede erinevates kudedes, kaasa arvatud juured, varred, rosetti lehed, lilled ja siliikud, nagu tuvastati qRT-PCR abil. Suhteline ekspressioon arvutati, normaliseerides uuritud geeni transkriptsioonitaseme ACTIN2 omaga (sama, mis allpool). Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD. Väikesed tähed tähistavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01; 1. täiendav andmekogum). (D) EIJ1 ekspressioonianalüüs, kasutades 3-nädalaseid Col-taimi, mis on inokuleeritud Pst DC3000 (OD600=0.1) või pihustatud 0,05 mM SA-ga. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD (täiendav andmekogum 1). (E – G) GUS-värvimine näitab EIJ1 ekspressiooni indutseerimist patogeenide poolt. Kolme nädala vanused pEIJ1:EIJ1-GUS taimed inokuleeriti (10 mM MgCl2; E) või inokuleeriti Pst DC3000-ga (OD600=0.1; F). Riba=1 mm. Suurendatud pilt näitab, et EIJ1-GUS koondub trihhoomi piirkonda (G). Baar=100 lm. Lehed 4 hpi juures koguti ja inkubeeriti GUS-i värvimislahusega. (H) ja (I) EIJ1 ekspressioonimuster pärast Pst DC3000 või SA töötlemist. Koguvalgud ekstraheeriti 3-nädala vanustest 35Spro: EIJ1-6HA taimedest, mis olid inokuleeritud Pst DC3000-ga (OD600=0.1; H) või pihustati 0,05 mM SA-ga (I), ja tuvastati HA-vastase antikeha abil. Alumised paneelid näitavad Coomassie Brilliant Blue (CBB) värvimist laadimiskontrollina. Punktides (H) ja (I) esitatud immunoblotanalüüse korrati sõltumatult kolm korda.

Joonis 3 Arabidopsis EIJ1 muteeritud alleeli eij1-1 identifitseerimine. (A) Skemaatiline diagramm, mis näitab T-DNA sisestuskohta eij1-1-s (SALK_142975). Eksonid on tähistatud kastide ja intronitega kastidevaheliste joontega. Mustad kastid tähistavad EIJ1 kodeerivaid piirkondi ja valged kastid tähistavad tõlkimata piirkonda. Kolmnurk näitab T-DNA sisestuskohta. (B) Genoomse DNA PCR amplifikatsioon kinnitab, et eij1-1 on homosügootne insertsioonimutant. Kasutatud praimerid (P1, P2) on näidatud (A). LB tähistab T-DNA vasaku piiri praimerit ja M tähistab DNA molekulaarseid markereid. (C) EIJ1 ekspressiooni qRT-PCR analüüs. Kogu RNA ekstraheeriti 3-nädala vanustest eij1 ja Col lehtedest. EIJ1 suhteline ekspressioon eij1-1-s määrati väärtusele 1. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD (täiendav andmekogum 1). (D) Col, eij1-1 ja kahe tüüpilise EIJ1 komplementatsiooni transgeense liini eij1 EIJ1pro haigusresistentsuse fenotüüp: EIJ1-6HA. Kolme nädala vanused taimed inokuleeriti Pst DC3000-ga (OD600=0.05). Kuvatud lehed on pildistatud eraldusvõimega 5 dpi. Vardad=5 mm. (E) Pst DC3000 bakterite kasv punktis (D) kirjeldatud taimedel 0 ja 5 dpi juures. cfu/g, kolooniaid moodustavaid ühikuid värske massi grammi kohta. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD. Väikesed tähed näitavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01, 1. lisaandmekogum). (F) H2O2 taseme uurimine Coli lehtedes,

EIJ1 vahendab taimede immuunsust, represseerides EDS1 aktiivsust

EDS1 ja EIJ1 vahelise geneetilise seose mõistmiseks genereerisime eij1-1 eds1-22 topeltmutandiliinid, ristades eij1-1 mutandi eds1-22-ga, mis on funktsiooni mutantne alleel EDS1-90 (AT3G48090; Col-0 taust), millel on kahjustatud patogeeniresistentsus (Yang ja Hua, 2004). Normaalsetes kasvutingimustes ei täheldatud mutantsete taimede eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22 vahel morfoloogilisi erinevusi (joonis 4, A ja B). Pärast Pst DC3000 inokuleerimist näitasid eij1-1 mutantsed taimed 5 dpi juures tugevamat resistentsust kui Col-0 taimed (joonis 4, A ja B). Kuid eij1-1 eds1-22 topeltmutandil esines märkimisväärseid nekrootilisi kahjustusi ja kõrge bakteriaalne tiiter, mis on võrreldav eds1-22 üksikmutandiga, mis näitab, et eij1-1 alleel ei olnud võimeline. et päästa haigusele vastuvõtlik eds-de fenotüüp1-22 (joonis 4, A ja B). Haigusresistentsust hinnati ka pärast Pst DC3000 rõhuinfiltratsiooni ja saadi sarnased tulemused (täiendav joonis 4B). Lisaks kasutasime EDS1 nullalleeli, eds1-2; Col-0 taust; Bartsch et al., 2006), et genereerida geneetiliseks analüüsiks eij1-1 eds1-2 topeltmutantsed taimed. Sarnaselt eij1-1 eds1-22-ga näitasid eij1-1 eds1-2 topeltmutantsed taimed ka märkimisväärseid nekrootilisi kahjustusi ja kõrgemat bakteritiitrit kui eij1-1, mis oli võrreldav eds1-2 üksiku mutandiga (täiendav joonis 6). Need geneetilised tõendid viitavad sellele, et EDS1 on EIJ1 suhtes epistaatiline. Kooskõlas ülaltoodud tähelepanekutega kogunes H2O2 kõrgele tasemele eij1-1 lehtedes, kuid madalal tasemel eds1- 22 ja eij1-1 eds1-22 lehtedes, võrreldes Col{{ 53}} lehed Pst DC3000 inokuleerimisel (joonis 4C). Lisaks pärssis eij{56}} mikroHR selgelt EDS1 funktsiooni kadu 24 hpi juures Pst DC3000 või avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4; joonis 4D) korral. Kooskõlas selle tulemusega olid ICS1 ja PR1 ekspressioonitasemed eij1-1 eds1-22 ja eds1-22 taimedes võrreldavad, kuid oluliselt madalamad kui eij1-1 ja Col{ {71}} taimed (joonis 4E). Need tulemused kinnitavad, et EIJ{73}vahendatud kaasasündinud immuunvastus sõltub EDS1-st. Et uurida EIJ1-EDS1 interaktsiooni rolli taime immuunvastuses, teostasime eij1-1, eds1-22 ja Col-0 lehtede RNA-seq analüüsi 24 hpi juures Pst DC3000-ga ; inokuleerimata Col-0 lehtedega kasutati näidisravina. Col{87}}Pst DC3000 versus Col_mock, eij1-1_Pst DC3000 versus Col{92}} tuvastati kokku 2762, 923 ja 622 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG). Pst DC3000 ja eds1-22_Pst DC3000 versus Col_Pst DC3000 võrdlused. Neid geene nimetatakse edaspidi vastavalt patogeenidele reageerivateks, EIJ{99}}reguleeritud ja EDS{100}reguleeritud geenideks (täiendav joonis 7A ja andmekogum 2). Nendest geenidest reguleeris EIJ1 471 geeni; 396 olid reguleeritud EDS1-ga (joonis 4F; täiendav andmekogum 2); ja 124 olid kaasreguleeritud EIJ1 ja EDS1 poolt (joonis 4F). Klastrianalüüs näitas, et 93,5% (116) kaasreguleeritud geenidest (124) oli EDS1 ülesreguleeritud ja EIJ1 allareguleeritud (joonis 4F; täiendav joonis 7B ja andmekogum 2), mis toetab EIJ1 repressiivset rolli EDS1 funktsioon. Geeni ontoloogia (GO) analüüs näitas lisaks, et enamik EIJ1 ja EDS1 poolt antagonistlikult reguleeritud geene on peamiselt seotud stressireaktsioonide ja kaasasündinud immuunvastustega (joonis 4G; täiendav tabel S1). Need analüüsid viitavad sellele, et EIJ1 ja EDS1 reguleerivad patogeeniga nakatumise ajal resistentsusega seotud geene kontrastsel viisil. Märkimisväärne osa EDS{135}}reguleeritud geenidest (272/396) ei olnud EIJ1 poolt reguleeritud, tõenäoliselt EDS1 väiksema kordse muutuse (52) või EIJ{140}sõltumatu funktsiooni tõttu.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

EIJ1 interakteerub tsütoplasmas EDS1-ga ja pärsib EDS1 tuumakaubandust

EIJ1 paikneb lehtrakkude kloroplastis ja tuumas (joonis 2A), samas kui EDS1 valgul on nukleotsütoplasmaatiline jaotusmuster, mis esineb mõlemas kohas (Garcı´a et al., 2010). Et uurida, kus ja kuidas EIJ1 interakteerub EDS1-ga taimes, teostasime Arabidopsise protoplastide abil mööduvaid ekspressioonianalüüse. Huvitav on see, et kuigi EIJ1 säilitas rohelise fluorestseeruva valgu (GFP; kontroll) juuresolekul oma algse subtsellulaarse lokalisatsioonimustri kloroplastis ja tuumas, hajus kloroplastis lokaliseeritud EIJ1-mCherry tsütoplasmas, kui seda ekspresseeriti koos EDS-iga. {9}}GFP protoplastides (joonis 5A, vt koopiaid 2. lisafailist). See nähtus leidis kinnitust N. benthamiana epidermise rakkudes, milles EIJ1-mCherry ekspresseeriti ajutiselt koos kas EDS1-GFP või GFP kontrolliga (täiendav joonis 8, vt koopiaid 2. lisafailist) . Need tähelepanekud näitavad, et EDS1 üleekspressioon võib viia EIJ1 subtsellulaarse ümberpaiknemiseni. Järgmiseks, et määrata subtsellulaarne asukoht, kus EDS1 ja EIJ1 interakteeruvad, teostasime allatõmmetesti, kasutades rekombinantset glutatioon-S-transferaasi (GST)-EDS1 sulandvalku (sööta) ja koguvalgu ekstrakti, tuumade ammendunud fraktsioone ja tuumasid. 35Spro rikastatud fraktsioonid: EIJ1-HA transgeensed liinid (saakvalgud). Meie tulemused näitasid, et EDS1 immunosadestus EIJ1-HA-ga, kui kasutati valgu koguekstrakti ja 35Spro: EIJ1-HA lehtede tuumadest vaesestatud fraktsioone, kuid tuumadega rikastatud fraktsioonide kasutamisel see ei juhtunud (joonis). 5B), mis viitab sellele, et EIJ1 ja EDS1 vaheline interaktsioon toimub tsütoplasmas.

Joonis 4 EIJ1 ja EDS1 reguleerivad vastupidiselt taimede resistentsust patogeenide suhtes. (A) Col, eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22 haigusresistentsuse fenotüüp. Kolme nädala vanused taimed inokuleeriti Pst DC3000-ga (OD600=0.05). Kuvatud lehed on pildistatud eraldusvõimega 5 dpi. Riba=5 mm. (B) Pst DC3000 bakterite kasv punktis (A) kirjeldatud taimedel 0 ja 5 dpi juures. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD. Väikesed tähed näitavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01, 1. lisaandmekogum). (C) H2O2 taseme uurimine taimedes Col, eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22. Kolme nädala vanused taimed inokuleeriti Pst DC3000 või Pst DC3000-ga (AvrRps4; OD600=0.1) ja värviti seejärel DAB-ga 24 hpi juures. Baar=500 lm. (D) Col, eij1-1, eds1-22 ja eij1-1 eds1-22 taimede rakusurma analüüs. Kolme nädala vanused taimed dipinokuleeriti Pst DC3000 või Pst DC3000-ga (AvrRps4; OD600=0.1) ja värviti seejärel trüpaansinisega 24 hpi juures. Baar=500 lm.

Arvestades, et EIJ1 reguleerib negatiivselt taime immuunvastust EDS1-sõltuval viisil (joonis 4), uurisime järgmisena patogeenide mõju EIJ1 ja EDS1 interaktsioonile. Üllataval kombel suurendas Pst DC3000 infektsioon EDS1-EIJ1 interaktsiooni pigem tsütoplasmas kui nii kloroplastis kui ka tuumas (joonis 5C, vt koopiaid täiendavas failis 2). See leid koos EDS1 nukleotsütoplasmaatilise jaotusmustri ja EDS1 tuuma lokaliseerimise rolliga patogeeniresistentsuse tugevdamisel transkriptsiooni tasemel (Garcı´a et al., 2010) sundis meid uurima EIJ1 rolli EDS1 subtsellulaarne kaubitsemine patogeeniga nakatumise ajal. Kui ekspresseerisime ajutiselt EDS1-3FLAG-i Arabidopsise protoplastides, mis olid eraldatud eij1-1, EIJ1 üleekspressiooni ja Col-0 taimedest, surus EIJ1 märkimisväärselt maha EDS1 kaubitsemise tuuma (täiendav joonis 9) . Lisaks näitas immunoblotanalüüs vähe erinevusi kogu EDS1 valgu arvukuses eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS{{30} }FLAG transgeensed taimed (joonis 5D, vt koopiaid lisafailist 2). Võrreldes eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgeensete taimedega, näitas Pst DC3000- inokuleeritud eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS13FLAG taimede arv märgatavat kasvu tuumadega rikastatud EDS1 valgu tasemes ja tsütoplasmas lokaliseeritud EDS1 taseme languses (joonis 5D, vt koopiaid täiendavas failis 2), mis kinnitab EIJ1 repressiivset rolli EDS1 tsütoplasmast tuuma kaubitsemises. Järgmisena testisime, kas see EIJ1-EDS1 interaktsiooni vahendatud ümberjaotusprotsess mõjutas taimede resistentsusega seotud geenide transkriptsioonilist regulatsiooni. Efektorkonstruktid 35Spro: EIJ1-mCherry ja 35Spro: EDS1-3FLAG transformeeriti eraldi või koos reporterkonstruktidega N. benthamiana lehtede epidermaalseteks rakkudeks (joonis 5E). 24 hpi juures Pst DC3000-ga aktiveeris EDS1 PR1 ja ICS1 ekspressiooni (joonis 5F), samas kui EIJ1 inhibeeris märkimisväärselt EDS{65}}indutseeritud geeniekspressiooni (joonis 5F). Erinevalt täispikast EIJ1-st ei suutnud EIJ1 valgu N-ots, mida eij1-1 ei mõjuta, inhibeerida EDS1--indutseeritud PR1 ekspressiooni (täiendav joonis 10, A ja B ), mis näitab, et EIJ1 puutumatu valgu struktuur on vajalik selle repressiivseks funktsiooniks. Need tulemused kinnitavad koos, et EIJ1 toimib olulise repressorina EDS{77}vahendatud resistentsusreaktsioonis, reguleerides EDS1 nukleotsütoplasmaatilist kaubitsemist. Kuna EIJ1 valk lagunes Pst DC{80}}inokuleeritud või SA-ga töödeldud taimedes pärast kiiret esialgset induktsiooni järk-järgult (joonis 2, H ja I), uurisime, kas EDS1 omakorda käivitab EIJ1 lagunemise valgu-valgu interaktsioon. Rakuvabad lagunemistestid ja in vivo valgu tuvastamise testid, kasutades eds1-22 35Spro: EIJ1-HA transgeenseid taimi, näitasid, et EDS1 puudumine ega olemasolu ei mõjutanud EIJ1 lagunemist (täiendav joonis 11), mis viitab sellele, et EDS1 ei osale EIJ1 patogeeni poolt põhjustatud lagunemises.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

Patogeeni infektsioon muudab EIJ1 subtsellulaarset lokaliseerimist

EIJ1 ja EDS1 vaheline tõhustatud interaktsioon tsütoplasmas patogeeni inokuleerimisel (joonis 5, B ja C) tähendas EIJ1 võimalikku patogeeni poolt põhjustatud ümberpaiknemist taimerakkudes. Selle võimaluse testimiseks uurisime EIJ1 subtsellulaarset lokaliseerimist N. benthamiana lehtedel, millele oli nakatatud Pst DC3000. Nakatamata tingimustes paiknes EIJ1-mCherry kloroplastis ja tuumas. Kuid 24 dpi juures vähenesid fluorestsentssignaalid kloroplastides oluliselt ja tsütoplasmas suurenesid (joonis 6A). Et edasiseks kindlaks teha, kas patogeenid vallandavad EIJ1 disassotsiatsiooni kloroplastist lehtede tsütoplasmasse, viidi läbi EIJ1 valgu immunoblotanalüüs, kasutades transgeenseid taimi 35Spro: EIJ1-6HA. Koguvalgud, kloroplasti valgud ja tsütoplasmaatilised valgud eraldati 35Spro: EIJ1-6HA transgeensetest taimedest 0 ja 4 hpi juures Pst DC3000-ga. EIJ1 arvukus suurenes märkimisväärselt tsütoplasmaatilises fraktsioonis, kuid vähenes kloroplasti fraktsioonis 24 dpi juures (joonis 6B, vt koopiaid täiendavas failis 2), mis näitab negatiivset korrelatsiooni EIJ1 valgu taseme vahel kloroplastis ja tsütoplasmas.

Joonis 5 EIJ1 interakteerub EDS1-ga tsütoplasmas, et vahendada EDS1 tuumakaubandust. (A) Mööduva ekspressioonianalüüs, mis näitab EDS1 ja EIJ1 lokaliseerimist Arabidopsise protoplastides. Baar=10 lm. (B) EIJ1 ja EDS1 vahelise interaktsiooni allatõmmatav test. 3-nädala vanustest eij1-1 35Spro: EIJ1-6HA transgeensetest taimedest ekstraheeritud koguvalgud, tuumade vaesestatud fraktsioonid ja tuumadega rikastatud fraktsioonid inkubeeriti immobiliseeritud GST-EDS1 või GST valkudega , vastavalt. IP-d tuvastati anti-HA või anti-GST antikehade abil. PEPC ja histooni H3 kasutati vastavalt tsütoplasmaatiliste ja tuumamarkeritena. Tärnid näitavad GST-EDS1 valkude ribasid. (C) Pst DC3000 infektsioon suurendab EDS1 ja EIJ1 valkude interaktsiooni tsütoplasmas. Koguvalgud, tuumade vaesestatud fraktsioonid, tuumadega rikastatud fraktsioonid ja kloroplasti valgud ekstraheeriti 3-nädala vanustest EIJ1pro: EIJ1-6HA 35Spro: EDS1-3FLAG taimedest, mis olid inokuleeritud Pst DC3000 (OD600=0.1) või nakatatud 4 hpi juures ja immunosadestatud, kasutades kas anti-FLAG antikeha või preimmuunseerumit (IgG). Kaasimmunosadestatud valgud tuvastati anti-HA ja anti-FLAG antikehade abil. N-vaesestatud, tuumadeta fraktsioonid; N-rikastatud, tuumadega rikastatud fraktsioonid. PEPC ja histooni H3 kasutati vastavalt tsütoplasmaatiliste ja tuumamarkeritena. (D) Immunoblotanalüüs näitab, et EIJ1 vahendab EDS1 tsütoplasmaatilist ja tuuma jaotust. Koguvalgud, tuumade vaesestatud fraktsioonid ja tuumadega rikastatud fraktsioonid ekstraheeriti 3-nädala vanustest väljaannetest1-22 EDS1pro: EDS1- 3FLAG ja eij{58}} väljaannetest{{59 }} EDS1pro: EDS1-3FLAG-i transgeensed taimed, mis on inokuleeritud Pst DC3000-ga (OD600=0.1) või nakatatud 4 hpi juures ja tuvastatud FLAG-vastase antikehaga. Eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG-i valkude suhteline intensiivsus, kui nakatamistöötluse imitatsioon on seatud väärtusele 1. M, näidis; P, Pst DC3000. PEPC ja histooni H3 kasutati vastavalt tsütoplasmaatiliste ja tuumamarkeritena. Punktides (A), (C) ja (D) esitatud tulemusi korrati sõltumatult kolm korda (täiendav fail 2). (E) ja (F) EIJ1 ja EDS1 reguleeritud PR1 ja ICS1 promootori aktiivsuse mööduv analüüs. Erinevad ajutiste ekspressioonianalüüsides kasutatud konstruktid on näidatud (E). PR1pro: GUS või ICS1pro: GUS kotransformeeriti efektoritega või tühja vektoriga (Control) N. benthamiana lehtedeks, mida steriliseeriti Pst DC3000 (OD600=0.1) 24 tunni jooksul. Suhteline GUS aktiivsus (GUS / lutsiferaas), mis näitab PR1 ja ICS1 ekspressioonitaset, mida reguleerivad erinevad efektorid, on näidatud (F). Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD (täiendav andmekogum 1). Väikesed tähed näitavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01).

Patogeeni poolt käivitatud EIJ1 dissotsiatsioon kloroplastist viitab EIJ1 potentsiaalsele funktsioonile tsütoplasmas. Selle võimaluse testimiseks immobiliseerisime EIJ1 valgu kloroplastidele, kinnitades kloroplasti sihtiva järjestuse (CTS; Lee et al., 2008) EIJ1-mCherry reportergeeni N-otsa. Seejärel ekspresseeriti CTS-EIJ1-mCherry fusioon N. benthamiana lehtedes natiivse promootori kontrolli all. Fluorestsentsi tuvastati ainult kloroplastides, kuid mitte Pst DC3000- nakatatud N. benthamiana lehtede tsütosoolis ja tuumas (täiendav joonis 12A). See tähelepanek kinnitas, et CTS-märgistatud EIJ1 säilis kloroplastis ja seda ei sundinud patogeeni infektsioon tsütoplasmasse. Seejärel lõime EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA transgeensed Arabidopsis liinid, et hinnata CTS-EIJ1 bioloogilist funktsiooni taime immuunvastuses. Ootuspäraselt ei näidanud eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA liinid eij1-1 EIJ1pro: CTS-EIJ1-6HA patogeenide suhtes resistentsuses olulist erinevust võrreldes eij1-1, mis näitab, et kloroplasti immobiliseeritud EIJ1 ei suuda päästa eij1-1 haigusresistentsuse fenotüüpi (joonis 6C). Kooskõlas selle tähelepanekuga püsis PR1 ekspressioon eij1-1 EIJ1pro: CTSEIJ1-6HA transgeensetes taimedes kõrgel tasemel, sarnaselt eij1-1-ga (täiendav joonis 12B). Lisaks näitas CTS-EIJ1 vähem võimet represseerida EDS1 transkriptsiooni aktiivsust kui EIJ1 (joonis 6, D ja E). Need tulemused viisid meid järeldusele, et peremeesorganismi varajane vastus patogeeni infektsioonile käivitab EIJ1 subtsellulaarse ümberpaiknemise, mis omakorda moduleerib immuunvastust, represseerides EDS1 kaubitsemist tuuma.

EIJ1 reguleerib virulentsuse efektori poolt käivitatud vastust

TIR-NB-LRR retseptor RPS4 tunneb ära P. syringae efektorvalgu AvrRps4, mida sekreteerib III tüüpi sekretsioonisüsteem, et algatada ETI, mis sõltub EDS1-st (Gassmann et al., 1999; Wirthmueller et al., 2007; Heidrich et al., 2012). Inokuleerisime eij1-1 lehti avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4) või virulentse Pst DC3000-ga, et hinnata, kas EIJ1 on seotud ETI-ga. Eij1-1 lehed näitasid virulentse Pst DC3000 suhtes suuremat resistentsust kui Col-0 lehed (joonis 7A). Siiski ei täheldatud olulist erinevust Col-0 ja eij1-1 lehtede vahel resistentsuses avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4) suhtes, kuigi mõlemad genotüübid näitasid suuremat resistentsust avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4) kui Pst DC3000 suhtes ( Joonis 3, F ja G; joonis 7, A), mis näitab, et EIJ1 ei pruugi olla vajalik RPS4-indutseeritud ETI korral. Samuti määrasime kindlaks taimede resistentsuse Pst DC3000 hrcC suhtes, millel on defektne III tüüpi sekretsioonisüsteem ja mis ei suuda PTI pärssimiseks peremeesrakkudesse efektoreid süstida (Gassmann et al., 1999; Gloggnitzer et al., 2014). Nii eij1-1 mutandi kui ka Col-0 lehed näitasid sarnast resistentsust Pst DC3000 hrcC suhtes (täiendav joonis 13), mis viitab sellele, et EIJ1 ei osale PTI-s.

Arvestades, et EDS1 tuumaakumuleerumine on hädavajalik kaitsegeeni ekspressiooni ja resistentsuse TIR-NB-LRR-indutseeritud ümberprogrammeerimiseks (Garcı´a et al., 2010), uurisime, kas EIJ1 reguleerib subtsellulaarset jaotust. EDS1 vastuseks ETI-le. 3-Nädala vanuste taimede1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij1-1 eds1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG taimede lehed nakatati kas Pst DC3000 või Pst DC3000 (AvrRps4) ja tuumade vaesestatud ja tuumadega rikastatud fraktsioonid ekstraheeriti 0 ja 4 hj juures. Kooskõlas eelmise uuringuga (Garcı´a et al., 2010) täheldati Pst DC3000 (AvrRps4) nakatatud FLAG-i taimedes EDS1 tuuma lokaliseerumise suurenemist. kuid mitte Pst DC3000-ga nakatatud. EIJ1 funktsiooni kadumine ei mõjutanud aga EDS1 ETI-indutseeritud tuumaakumulatsiooni (joonis 7B; vt koopiaid täiendavas failis 2). See viitab sellele, et avirulentne Pst DC3000 (AvrRps4) kas käivitab EDS1 kaubitsemise tuuma, minnes EIJ1-st mööda, või kaotab EIJ1 funktsiooni teadmata viisil. Nende võimaluste testimiseks uurisime avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4) mõju EIJ1 tasemele. Sarnaselt tulemustele, mis saadi EIJ1 üleekspressiooniliinidega (joonis 2H), näitasid eij1-1 EIJ1pro:EIJ1-6HA taimed Pst DC3000-ga nakatatud EIJ1 akumuleerumist nakkuse varases staadiumis, kuigi EIJ1 muutus järk-järgult lagunenud pärast 8 hpi (joonis 7C; vt koopiaid lisafailist 2). EIJ1 akumuleerumine on piisav, et vältida Pst DC{58}}käivitatud EDS1 kaubitsemist tuumasse nakkuse varases staadiumis (joonised 5, D ja 7, B). Kooskõlas selle tulemusega kiirendas EIJ1 funktsiooni kadumine EDS1 tuuma translokatsiooni nakatunud taimedes (täiendav joonis 14). Seevastu Pst DC3000 (AvrRps4) kaotas EIJ1 funktsiooni, indutseerides kiiresti EIJ1 valgu lagunemist, kuid mitte represseerides EIJ1 geeni transkriptsiooni (joonis 7C; täiendav joonis 15), soodustades seega EDS1 suuremat tuuma translokatsiooni nakatumise varases staadiumis (joonis 7B). ). Seda hüpoteesi toetab tähelepanek, et Pst DC3000-ga nakatatud eij1-1 taimede resistentsus oli võrreldav avirulentse Pst DC3000 (AvrRps4) nakatatud Col-0 ja eij1-1 taimede omaga. See võib vähemalt mingil määral selgitada, miks avirulentne tüvi, kuid mitte virulentne tüvi, suudab tugevdada resistentsust ETI vastuse vallandamiseks. Seetõttu viitavad need tähelepanekud sellele, et EIJ1 osaleb peremeesrakkude virulentsuse efektori poolt käivitatud vastuses.

Joonis 6 EIJ1 ümberpaigutamine tsütoplasmasse on vajalik EDS1-sõltuva resistentsuse jaoks. (A) Pst DC3000 infektsioon muudab EIJ1 subtsellulaarset lokaliseerimist. EIJ1-mCherry ekspresseeriti ajutiselt N. benthamiana lehtedes, mida steriliseeriti Pst DC3000-ga (OD600=0.1) või inokuleeriti 24 tunni jooksul. Baar=10 lm. (B) Pst DC3000 infektsioon käivitab EIJ1 disassotsiatsiooni kloroplastist. Koguvalgud, tsütoplasmaatilised valgud ja kloroplastilised valgud ekstraheeriti 3-nädala vanustest EIJ1pro: EIJ1-6HA taimedest, mis olid inokuleeritud Pst DC3000 (OD600=0.1) või imitatsiooniga. 4 hpi juures ja tuvastati HA-vastase antikehaga. PEPC, histooni H3 ja RbcL kasutati vastavalt tsütoplasmaatiliste, tuuma- ja kloroplastiliste markeritena. Näidistöötlusega valkude suhteline intensiivsus on seatud väärtusele 1. (A) ja (B) esitatud tulemusi korrati sõltumatult kolm korda (täiendav fail 2). (C) Immobiliseeritud EIJ1 kloroplastides ei suuda taastada eij1-1 resistentsust. Kolme nädala vanused taimed inokuleeriti Pst DC3000-ga (OD600=0.05). Määrati Pst DC3000 bakteritiiter 0 ja 5 dpi juures. CTS, kloroplasti lokaliseerimise signaalid. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD (täiendav andmekogum 1). (D) ja (E) EIJ1, CTS-EIJ1 ja EDS1 reguleeritud PR promootori aktiivsuse mööduv analüüs. Erinevad ajutiste ekspressioonianalüüsides kasutatud konstruktid on näidatud (D). PR1pro: GUS transformeeriti koos efektorite või tühja vektoriga (Control) N. benthamiana lehtedeks, mida steriliseeriti 24 tunni jooksul Pst DC3000-ga (OD{47}}.1). Suhteline GUS aktiivsus (GUS / lutsiferaas), mis näitab PR1 ekspressioonitaset, mida reguleerivad erinevad efektorid, on näidatud (E). Vearibad tähistavad kolmekordsete sõltumatute proovide standardhälvet. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD. Väikesed tähed näitavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01, 1. lisaandmekogum).

Joonis 7 EIJ1 ja EDS1 moduleerivad taime basaalresistentsust. (A) Col ja eij1-1 mutandi bakterite kasv. Kolmenädalased taimed inokuleeriti Pst DC3000 või Pst DC3000-ga (AvrRps4; OD600=0.05). Määrati Pst DC3000 bakteritiiter 0 ja 5 dpi juures. Andmed on kolme bioloogilise korduse keskmine ± SD. Väikesed tähed näitavad olulisi erinevusi (ühesuunaline ANOVA, P 5 0.01, 1. lisaandmekogum). (B) EIJ1 ei mõjuta peaaegu Pst DC3000 (AvrRps4) poolt käivitatud EDS1 akumuleerumist tuumades. Tuumadeta fraktsioonid ja tuumadega rikastatud fraktsioonid ekstraheeriti 3-nädala vanustest väljaannetest1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG ja eij1-1 väljaannetest1-22 EDS1pro: EDS1-3FLAG transgeensed taimed, mis on nakatatud Pst DC3000 (OD600=0.1), Pst DC3000 (AvrRps4; OD600=0.1) või imitatsiooniga nakatatud 4 hpi juures ja tuvastatud kasutades anti-FLAG-i antikeha. PEPC ja histooni H3 kasutati vastavalt tsütoplasmaatiliste ja tuumamarkeritena. Taimedest pärinevate valkude suhteline intensiivsus näidistöötlusega määrati väärtusele 1. M, pilkamine; P, Pst DC3000; R, Pst DC3000 (AvrRps4). (C) Pst DC3000 (AvrRps4) infektsioon soodustab EIJ1 valgu lagunemist. Koguvalgud ekstraheeriti 3-nädala vanustest eij1-1 EIJ1pro: EIJ1-6HA taimedest, mis olid inokuleeritud Pst DC3000 või Pst DC3000-ga (AvrRps4; OD600=0.1). ja tuvastati HA-vastase antikeha abil. Alumine paneel näitab Coomassie Brilliant Blue (CBB) värvimist laadimiskontrollina. Punktides (B) ja (C) esitatud representatiivseid tulemusi korrati sõltumatult veel kaks korda ja sondeeriti laadimiskontrollina anti-ACTIN-i antikehaga (täiendav fail 2). (D) EIJ1 hüpoteetiline mudel, mis reguleerib EDS{67}}sõltuvat taime basaalresistentsust. Kui taimed tungivad patogeenide poolt, vabaneb EIJ1 kiiresti kloroplastist tsütoplasmasse, kus see interakteerub EDS1-ga. EIJ1-EDS1 interaktsioon takistab EDS1 kandumist tsütoplasmast tuuma ja piirab seega EDS1 tuumaresistentsust, võimaldades moduleerida EDS{74}}vahendatud immuunvastuseid. Nooled ja nüri jooned näitavad vastavalt aktiveerimist ja represseerimist.

Arutelu

Ellujäämise maksimeerimiseks on taimed välja töötanud täpse mehhanismi kasvu optimeerimiseks ja sissetungivate patogeenide vastu kaitsmiseks, kuigi paljud nende mehhanismide üksikasjad jäävad ebaselgeks. EDS1 on taime kaasasündinud immuunsuse signaalivõrgus võtmepositsioonil, kuna see reguleerib resistentsust biotroofsete ja hemibiotroofsete patogeenide suhtes (Wiermer et al., 2005). Selles uuringus tuvastasime geeni EIJ1, mis kodeerib chaperone DnaJ valku, ja näitas, et EIJ1 reageerib varajasele patogeeniga nakatumisele ja mängib rolli taimede kaasasündinud immuunsuses, suheldes otseselt EDS1-ga. Nende leidude põhjal pakume välja EIJ1 regulatiivse mudeli (joonis 7D). Kui taimed tungivad patogeenide poolt, vabaneb EIJ1 kiiresti kloroplastist tsütoplasmasse, kus see interakteerub EDS1-ga. See EIJ1-EDS1 interaktsioon takistab EDS1 kandumist tsütoplasmast tuuma ja see piirab EDS1 tuumaresistentsust, võimaldades moduleerida EDS{13}}vahendatud immuunvastuseid, nagu SA biosünteesi indutseerimine ja resistentsuse ekspressioon. - seotud geenid. Kui taimed kannatavad sissetungivate patogeenide poolt pidevate stiimulite all, laguneb EIJ1 järk-järgult, mis viib EDS1 suurenenud tuumakuhjumiseni resistentsuse tugevdamiseks. Need leiud illustreerivad EIJ1 olulist repressiivset rolli patogeeni invasiooni varajases peremeesreaktsioonis, täites lünga meie arusaamises sellest, kuidas EDS1 rakusisese lokaliseerimise reguleerimine on resistentsus.

Järjestuse analüüs näitas, et EIJ1 on DnaJ valk. Arabidopsise genoom kodeerib seitset erinevat klassikalist tüüpi DnaJ valke (Pulido ja Leister, 2018). Varasemad uuringud näitavad, et DnaJ valgud mängivad taimede immuunsuses olulist ja selget rolli. Näiteks sojauba (Glycine max) GmHSP40 reguleerib positiivselt rakusurma ja resistentsust haigustele (Liu ja Whitham, 2013). Seevastu riisi (Oryza sativa L.) Os-DjA6 valk reguleerib negatiivselt taime kaasasündinud immuunsust ubikvitinatsiooni vahendatud proteasoomide lagunemise raja kaudu (Zhong et al., 2018). P. syringae-spetsiifiline Hopl1 virulentsuse efektor, mis sisaldab J domeeni, on suunatud kloroplastile, kus see interakteerub taime stressireaktsiooni masinatega (Jelenska et al., 2007). Need uuringud näitavad, et DnaJ valgud mängivad taimekaitsevastuses erinevat rolli. Tsip1, N. tabacum DnaJ valk, mis on homoloogne EIJ1-ga, reguleerib Tsi{13}}vahendatud geenide transkriptsioonilist aktivatsiooni vastuseks stressile (Ham et al., 2006). Tsi1 kodeerib APETALA2 (AP2)-tüüpi transkriptsioonifaktorit, mis toimib olulise regulaatorina nii N. tabacum'i biootilises kui ka abiootilises stressireaktsioonis (Park et al., 2001). SA käivitab Tsip1 ümberpaigutamise kloroplastist tsütoplasmasse, mis hõlbustab Tsip1 ja Tsi1 vahelist koostoimet ning sellele järgnevat Tsip1-Tsi1 kompleksi sisenemist tuuma, et aktiveerida stressiga seotud geenide transkriptsioon (Ham et al., 2006) . Erinevalt Tsip1-st lokaliseeriti EIJ1 selles uuringus normaalsetes tingimustes kloroplasti ja tuuma külge. Näitasime, et patogeeniga nakatumine käivitab EIJ1 ümberpaiknemise kloroplastist tsütoplasmasse ning et EIJ1 ja EDS1 vaheline interaktsioon tsütoplasmas pärsib EDS{32}}vahendatud tuumaresistentsust. Kooskõlas selle leiuga näitas funktsiooni kadumisega eij1mutant tugevamat resistentsust patogeenide suhtes kui metsiktüüp (Col-0). See kinnitab, et EIJ1 mängib taime kaasasündinud immuunsuses negatiivset rolli. Varasemate uuringute kohaselt on EDS1 koordineeritud tuuma- ja tsütoplasmaatiline aktiivsus taimede jaoks hädavajalik, et viia lõpule kaasasündinud immuunvastus patogeenidele (Garcı´a et al., 2010; Heidrich et al., 2011). EDS1 tuuma lokaliseerimine on vajalik TNL-i indutseeritud resistentsuse transkriptsiooni ümberprogrammeerimiseks, et kutsuda esile SA-ga seotud ja muid taimekaitsereaktsioone (Wirthmueller et al., 2007). Tsütoplasmaatilist EDS1 kogumit säilitatakse ka nakkusprotsessi ajal, et tagada täielik resistentsus patogeenide suhtes (Garcı´a et al., 2010). Need tähelepanekud tekitavad märkimisväärset muret selle üle, kuidas taimed täpselt reguleerivad EDS1 jaotamist tsütoplasma ja tuuma vahel, et tagada patogeeni nakatumise korral korralik kaitsereaktsioon. Siin näitame, et EDS1 täpset jaotamist erinevatele subtsellulaarsetele sektsioonidele reguleerib osaliselt EIJ1 valgu ja valgu interaktsiooni kaudu. EIJ1 funktsiooni kaotuse mutatsioon soodustas märkimisväärselt EDS1 kaubitsemist tuuma (joonised 5, D ja 7, B), mis viis suurenenud haigusresistentsuseni.

Kuna EIJ1 indutseeriti kiiresti patogeense infektsiooni varases staadiumis ja seejärel lagunes haiguse arengu ajal, oletame, et EIJ1 on oluline immuunsuse negatiivne regulaator, mis võimaldab taimedel oma optimaalset kaitset täpsustada. EIJ1-vahendatud EDS1 aktiivsuse represseerimine võib takistada tarbetute immuunvastuste esilekutsumist lühiajalisele stimulatsioonile, näiteks patogeensete bakterite juhuslikule rünnakule. Alternatiivina võivad patogeensed bakterid manipuleerida peremeesorganismi immuunsusega, käivitades EIJ1 disassotsiatsiooni kloroplastist, tõenäoliselt virulentsete efektorite sekreteerimise teel. Me ei saanud välistada võimalust, et EIJ1 täidab kloroplastis tundmatut funktsiooni. Nagu me teame, biosünteesitakse biotroofsete patogeenide suhtes resistentsusega seotud taimehormoon ja signaalmolekul SA peamiselt kloroplastis ja eksporditakse seejärel tsütoplasmasse mitme ravimi ja toksiinide transportija EDS5 abil (Serrano et al., 2013). EIJ1 on tõenäoliselt SA akumulatsiooni negatiivne regulaator, kuna see reguleeris patogeeni inokuleerimisel SA biosünteetilise geeni ICS1 ekspressiooni (joonis 4E). Lisaks EIJ1-vahendatud transkriptsioonilisele repressioonile interaktsiooni kaudu EDS1-ga on võimalik, et EIJ1 mängib ka otsest rolli SA biosünteesis või SA transpordis kloroplastist identifitseerimata viisil. Poleks üllatav, kui tulevases uuringus leitakse, et EIJ1 ja SA biosünteesiprotsess on omavahel seotud. Huvitav on see, et EIJ1 lokaliseeriti ka tuumas. Kuigi EIJ1 ei interakteerunud tuumas EDS1-ga, tõenäoliselt oluliste kofaktorite või modifikatsioonide puudumise tõttu, väärib tuuma lokaliseeritud EIJ1 funktsioon edasist uurimist.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Patogeensed bakterid toodavad rakusiseseid efektoreid, et õõnestada peremeesorganismi PTI-d, sihtides patogeeniresistentseid valke, nagu PRR-id, samas kui taime tsütoplasmaatilised NOD-sarnased retseptorid tajuvad neid efektoreid ETI algatamiseks (Dou ja Zhou, 2012; Khan et al., 2016). Varasemad uuringud ja meie tulemused näitasid, et avirulentne Pst DC3000 (AvrRps4) soodustab tsütoplasmaatilise EDS1 kaubitsemist tuuma (Garcı´a et al., 2010). Lisaks ei näidanud meie tulemused olulist erinevust Pst DC3000 (AvrRps4) poolt põhjustatud EDS1 tuumakuhjumise ja sellele järgneva patogeeniresistentsuse Col-0 ja eij1-1 mutantsete taimede vahel (joonis 7, A ja B). . Lisaks oli eij1-1 mutandi resistentsus võrreldav III tüüpi sekretsioonisüsteemi defektse Pst DC3000 hrcC tüvega nakatatud Col-0 taimede resistentsusega (täiendav joonis 12). Veelgi enam, EIJ1 akumuleerumine oli märkimisväärselt madalam taimedes, mida oli inokuleeritud avirulentse Pst DC3000-ga (AvrRps4), kui virulentse Pst DC3000-ga nakatatud taimedes (joonis 7C), mis näitab, et EIJ1 on virulentsuse efektor-käivitatud immuunvastuse oluline regulaator peremeesrakkudes. Kuna Pst DC3000-inokuleeritud eij1-1 taimed jäljendasid Pst DC3000 (AvrRps4) inokuleeritud Col-0 taimede resistentsuse fenotüüpi (joonised 3, F, G, 4, C, D ja 7, A), EIJ1 võib toimida barjäärina, et vältida ETI esilekutsumist virulentsete tüvede poolt. Kokkuvõtteks oleme tuvastanud EIJ1, chaperone DnaJ valgu, ja näidanud, et see osaleb varases immuunvastuses taimepatogeenidele. EIJ1 ja EDS1 vaheline interaktsioon pärsib EDS1 tuumaga kaubitsemist, tõenäoliselt kas selleks, et vältida lühiajalist stimuleerimist tarbetute taimede immuunvastuste poolt, hõlbustada patogeense sissetungi manipuleerimismehhanismi abil või mõlemat. Olenemata aluseks olevast mehhanismist võib EIJ1 alleeli kasutada tõhusa potentsiaalse sihtmärgina taime kaasasündinud immuunsuse muutmisel haigusresistentsuse aretamisel. Kuna EIJ1 ei mõjuta taimede normaalset kasvu, võib EIJ1 funktsiooni nõrgenemine genoomi redigeerimise kaudu märkimisväärselt tõsta põllukultuuride haigusresistentsuse taset, millel on vähe mõju kasvule.

Viited

Alvarez, ME, Pennell, RI, Meijer, PJ, Ishikawa, A, Dixon, RA, Lamb, C (1998) Reaktiivsed hapniku vaheühendid vahendavad süsteemset signaalivõrku taime immuunsuse loomisel. Cell 92: 773-784

An, C, Mou, Z (2011) Salitsüülhape ja selle funktsioon taimede immuunsuses. J Integr Plant Biol. 53: 412–428

Armbruster, U, Carrillo, LR, Venema, K, Pavlovic, L, Schmidtmann, E, Kornfeld, A, Jahns, P, Berry, JA, Kramer, DM, Jonikas, MC (2014) Ion antiport kiirendab fotosünteesi aklimatiseerumist kõikuvas valguses keskkondades. Nat Commun 5: 5439

Bartsch, M, Gobbato, E, Bednarek, P, Debey, S, Schultze, JL, Bautor, J, Parker, JE (2006) Salitsüülhappest sõltumatu TÕHENDATUD HAIGUSTE TUNDLUS1 signaaliülekannet Arabidopsise immuunsuse ja rakusurma korral reguleerib monooksügenaas FMO1 ja Nudixi hüdrolaas NUDT7. Plant Cell 18: 1038–1051

Ben Rejeb, K, Lefebvre-De Vos, D, Le Disquet, I, Leprince, AS, Bordenave, M, Maldiney, R, Jdey, A, Abdelly, C, Savoure´, A (2015) NADPH oksüdaaside poolt toodetud vesinikperoksiid suurendab proliini kogunemist soola või mannitooli stressi ajal Arabidopsis thaliana. New Phytol 208: 1138–1148

Bukau, B, Weissman, J, Horwich, A (2006) Molecular chaperones and protein quality control. Cell 125: 443-451

Caplan, J, Padmanabhan, M, Dinesh-Kumar, SP (2008) Taimsed NB-LRR-i immuunretseptorid: äratundmisest transkriptsioonilise ümberprogrammeerimiseni. Peremeesraku mikroob 3: 126–135 10.1016/j.chom.2008.02.010

Dodds, PN, Rathjen, JP (2010) Taimede immuunsus: taimede ja patogeenide interaktsioonide integreeritud vaate suunas. Nat Rev Genet 11: 539–548

Dou, D, Zhou, JM (2012) Fütopatogeenide efektorid, mis õõnestavad peremeesorganismi immuunsust: erinevad vaenlased, sarnane lahinguväli. Cell Host Microbe 12: 484–495

Du, Y, Zhao, J, Chen, T, Liu, Q, Zhang, H, Wang, Y, Hong, Y, Xiao, F, Zhang, L, Shen, Q (2013) I tüüpi J-domeeni NbMIP1 valgud on vajalik nii tubaka mosaiikviiruse infektsiooni kui ka taime kaasasündinud immuunsuse jaoks. PLoS Pathog 9: e1003659

Fan, H, Hu, Y, Tudor, M, Ma, H (1997) Spetsiifilised interaktsioonid AG K-domeenide ja AGL-ide vahel, mis on DNA-d siduvate valkude MADS-domeeniperekonna liikmed. Plant J 12: 999–1010

Feys, BJ, Moisan, LJ, Newman, MA, Parker, JE (2001) Arabidopsise haigusresistentsuse signaalvalkude EDS1 ja PAD4 vaheline otsene interaktsioon. EMBO J 20: 5400–5411

Garcı´a, AV, Blanvillain-Baufume´, S, Huibers, RP, Wiermer, M, Li, G, Gobbato, E, Rietz, S, Parker, JE (2010) EDS1 tasakaalustatud tuuma- ja tsütoplasmaatiline aktiivsus on vajalik. täielik taime kaasasündinud immuunvastus. PLoS Pathog 6: e1000970

Gassmann, W, Hinsch, ME, Staskawicz, BJ (1999) Arabidopsis RPS4 bakterite resistentsuse geen on TIR-NBS-LRR haigusresistentsuse geenide perekonna liige. Plant J 20: 265–277

Gloggnitzer, J, Akimcheva, S, Srinivasan, A, Kusenda, B, Riehs, N, Stampfl, H, Bautor, J, Dekrout, B, Jonak, C, Jime´nez-Go´mez, JM (2014) Nonsense- vahendatud mRNA lagunemine moduleerib immuunretseptorite taset, et reguleerida taime antibakteriaalset kaitset. Cell Host Microbe, 16: 376–390

Ham, BK, Park, JM, Lee, SB, Kim, MJ, Lee, IJ, Kim, KJ, Kwon, CS, Paek, KH (2006) Tobacco Tsip1, DnaJ-tüüpi Zn-sõrmevalk, on värvatud ja võimendab Tsi1-vahendatud transkriptsiooniline aktiveerimine. Plant Cell 18: 2005–2020

Heidrich, K, Blanvillain-Baufume´, S, Parker, JE (2012) NB-LRR retseptori signaalimise molekulaarsed ja ruumilised piirangud. Curr Opin Plant Biol. 15: 385–391

Heidrich, K, Wirthmueller, L, Tasset, C, Pouzet, C, Deslandes, L, Parker, JE (2011) Arabidopsis EDS1 ühendab patogeeni efektori äratundmise raku sektsiooni spetsiifiliste immuunvastustega. Science 334: 1401–1404

Hu, Y, Zhou, L, Huang, M, He, X, Yang, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X (2018) Gibberelliinid mängivad olulist rolli Arabidopsise hilises embrüogeneesis. Nat Plants 4: 289–298

Huang, M, Hu, Y, Liu, X, Li, Y, Hou, X. (2015) Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 vahendab postembrüonaalset arengut interaktsioonis PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR4-ga. Plant Cell 27: 3099–3111

Jelenska, J, Yao, N, Vinatzer, BA, Wright, CM, Brodsky, JL, Greenberg, JT (2007) Pseudomonas syringae AJ domeeni virulentsuse efektor remodelleerib peremeesorganismi kloroplaste ja pärsib kaitsevõimet. Curr Biol. 17: 499-508

Jones, J, Dangl, J (2006) Taimede immuunsüsteem. Nature 444: 323–329

Khan, M, Subramaniam, R, Desveaux, D (2016) Kaitsjad, peibutusvahendid, söödad ja püünised: patogeeni tajumine taimedes III tüüpi efektorandurite abil. Curr Opin Microbiol, 29: 49–55

Kinkema, M, Fan, W, Dong, X (2000) PR geeniekspressiooni aktiveerimiseks on vajalik NPR1 tuuma lokaliseerimine. Plant Cell 12: 2339–2350

Koch, E, Slusarenko, A (1990) Arabidopsis on vastuvõtlik hahkhallituse seente nakatumisele. Plant Cell 2: 437–445

Lam, E, Kato, N, Lawton, M (2001) Programmeeritud rakusurm, mitokondrid ja taime ülitundlik reaktsioon. Nature 411: 848–853

Lee, DW, Kim, JK, Lee, S, Choi, S, Kim, S, Hwang, I (2008) Arabidopsise tuumaga kodeeritud plastiidi transiitpeptiidid sisaldavad mitut järjestuse alarühma, millel on iseloomulikud kloroplasti sihtivad järjestuse motiivid. Plant Cell 20: 1603–1622