Ehhinakosiid pöörab tagasi müokardi ümberkujunemise ja parandab südame tööd

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstraktne

Müokardi remodelleerimine on südamepuudulikkuse oluline patoloogiline alus, mitokondriaalne oksüdatiivne stress on müokardi hüpertroofia, fibroosi ja apoptoosi soodustaja. ECH on traditsioonilise hiina meditsiini Cistanches Herba peamine aktiivne komponent, paljud uuringud näitavad, et sellel on tugev antioksüdantne võime närvirakkudes ja kasvajates, see pärsib mitokondriaalset oksüdatiivset stressi, kaitseb mitokondriaalset funktsiooni, kuid konkreetne mehhanism on ebaselge. SIRT1 / FOXO3a / MnSOD on oluline antioksüdantide telg, uuringus leitakse, et ECH seostub kovalentselt SIRT1-ga ligandina ja reguleerib SIRT1 ekspressiooni ajurakkudes. Hüpoteesime, et ECH võib muuta müokardi ümberkujunemise ja parandada HF-i südamefunktsiooni, reguleerides SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signaalitelge ja pärssides mitokondriaalset oksüdatiivset stressi kardiomüotsüütides. Siin indutseerime esmalt oksüdatiivse stressi rakumudeli ISO abil AC-16 rakkudega ja eeltöötleme ECH-ga, määrame mitokondriaalse ROS-i, mtDNA oksüdatiivse kahjustuse, MMP, karbonüülitud valgu, lipiidide peroksüdatsiooni, rakusisese ROS-i ja apoptoos tuvastatakse, kinnitavad ECH mõju mitokondriaalsele oksüdatiivsele stressile ja funktsioonile in vitro. Seejärel loome ISO indutseeritud HF roti mudeli ja eeltöötleme ECH-ga. Mõõdetakse südamefunktsiooni, müokardi remodelleerumise, mitokondriaalse oksüdatiivse stressi ja funktsiooni indekseid, SIRT1/FOXO3a/MnSOD signaalitelje ekspressiooni, andmed näitavad, et ECH parandab südame tööd, pärsib müokardi hüpertroofiat, fibroos ja apoptoos suurendab SIRT1/FOXO3a/ ekspressiooni. MnSOD signaali telg, vähendab mitokondriaalseid oksüdatiivseid kahjustusi, kaitseb mitokondriaalset funktsiooni. Me järeldame, et ECH pöörab ümber müokardi ümberkujunemise ja parandab südamefunktsiooni SIRT1 / FOXO3a / MnSOD telje ülesreguleerimise ja mitokondriaalse oksüdatiivse stressi pärssimise kaudu HF-rottidel.

MÄRKSÕNASehinakosiid, südamepuudulikkus, mitokondriaalne oksüdatiivne stress, müokardi ümberkujunemine

värsked ürdid cistanchejuurdemitokondriaalne oksüdatiivne stress

1|SISSEJUHATUS

Südamepuudulikkus (HF) on enamiku kõrge esinemissageduse ja halva prognoosiga südame-veresoonkonna haiguste lõpptulemus ning elanikkonna vananemise süvenemise tõttu suurenes haiglaravi ja kroonilisest südamepuudulikkusest (CHF) tingitud suremus järsult kogu maailmas.1 Viimase 20 aasta jooksul on südamepuudulikkuse ravimravi teinud suuri edusamme, kuid mõju on väga piiratud, mistõttu on kiiresti vaja uusi ravimeid. Müokardi ümberkujunemine on südamepuudulikkuse oluline patoloogiline alus ja seda iseloomustavad müokardi hüpertroofia, apoptoos, interstitsiaalne fibroos, müokardi rakud on desorganiseeritud ja põhjustavad väljutusfraktsiooni (LVEF) vähenemist, vasaku vatsakese lõpp-diastoolsete ja süstoolsete mõõtmete suurenemist. (LVIDd ja LVID) ja vasaku vatsakese fraktsionaalse lühenemise (LVFS) vähenemine.2 Kuid selle aluseks olevad mehhanismid ei olnud ikka veel täielikult teada. Viimastel aastatel on arvukad uuringud kinnitanud, et oksüdatiivne stress on oluline müokardi ümberkujunemise soodustaja.3-7

Oksüdatiivne stress on seisund, mille korral tekivad liigselt reaktiivsed hapniku liigid (ROS) või vabad radikaalid, mis põhjustavad rakukomponentide oksüdatiivset kahjustust, mis omakorda põhjustab raku talitlushäireid.8 Mitokondrid on rakusisese ROS-i peamine allikas. leke hingamisteede elektronide transpordiahelast ja mitokondrid on ROS-i mõjude suhtes kõige tundlikumad.9 Kõrgkõrgsageduse uuringud tuvastasid suurenenud ROS-i teket hingamisahela I kompleksist.8 Suurenenud ROS-i tootmine ründab esmalt mitokondriaalseid komponente ja põhjustab liigset oksüdatiivset stressi. , mis avaldub valkude karbonüülimises, lipiidide peroksüdatsioonis ja DNA kahjustuses10 ning mitokondrite düsfunktsioonina, mis omakorda põhjustab ROS-i liigset moodustumist8, moodustab nõiaringi. On tõestatud, et püsiv oksüdatiivne stress võib põhjustada müokardi hüpertroofiat ja müokardi fibroosi11-13 ning põhjustada müokardirakkude apoptoosi mitokondritest sõltuva apoptoosi aktiveerimise kaudu, mis on tingitud mitokondriaalse membraani valkude karbonüülimisest ja mitokondriaalse membraani potentsiaali kadumisest.14 Seega. , arvatakse, et mitokondriaalse oksüdatiivse stressi pärssimine võib olla uus strateegia müokardi remodelleerumise ja isegi südamepuudulikkuse vältimiseks.15-17

Ehhinakosiid (ECH), looduslik fenüületanoidglükosiid, on traditsioonilise hiina meditsiini Cistanches Herba peamine aktiivne komponent. Viimastel aastatel on ECH-d närvisüsteemis ja kasvajates põhjalikult uuritud ning on teatatud, et sellel on mitmesugused farmakoloogilised toimed, nagu antioksüdantsed, põletikuvastased, apoptoosivastased ja kasvajavastased omadused.18,19In närvirakud, ECH suurendab märkimisväärselt antioksüdantide võimet, vähendab ROS-i tootmist, parandab mitokondriaalse membraani potentsiaali (MMP) ja suurendab rakkude elujõulisust,20 avaldab kaitsvat toimet mitokondriaalsele funktsioonile ja pärsib mitokondriaalset oksüdatiivset stressi, kaitseb oksüdatiivsete vigastuste eest ja parandab mälu, lõpuks hoiab ära neurodegeneratsioon.21,22 ECH suurendab ka SOD aktiivsust ja mängib kaitsvat rolli ajukoes ja võrkkesta koes,19,23 kuid selle antioksüdantse toime spetsiifiline mehhanism on ebaselge.

SIRT1 on tihedalt seotud oksüdatiivse stressiga ja SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signaali telg on kõige olulisem antioksüdantide telg ja vastutab mitokondriaalse oksüdatiivse stressi pärssimise eest, MnSOD levib laialdaselt mitokondrites ja vastutab peamiselt mitokondriaalse ROS-i puhastamise eest, seega oksüdatiivset stressi inhibeerivad ühendid, mis aktiveerivad seda antioksüdantset telge, võivad pärssida oksüdatiivset stressi.24,25 Hiljutised uuringud on näidanud, et ECH avaldab oma farmakoloogilist toimet, reguleerides mitut signaaliülekande rada, nagu p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beeta 1/Smads. ja SIRT1 signaalirada.{10}} Uues uuringus leitakse, et ECH seostub kovalentselt SIRT1 kui ligandiga ja reguleerib üles SIRT1 ekspressiooni ajurakkudes.26 See viitab sellele, et ECH võib pärssida mitokondriaalset oksüdatiivset stressi kardiomüotsüütides ja pöörata müokardi südamelihases. ümberkujundamine. ECH mõjude uuringud on aga keskendunud närvisüsteemile või kasvajale, ECH mõju ja mehhanismid mitokondriaalsele oksüdatiivsele stressile kardiomüotsüütides ja müokardi remodelleerumisele jäävad teadmata. Siin indutseerime kõigepealt ISO abil oksüdatiivse stressi rakumudeli ja kinnitame ECH mõju mitokondriaalsele oksüdatiivsele stressile ja funktsioonile in vitro . Seejärel loome ISO-ga indutseeritud HF roti mudeli ja demonstreerime, et ECH pöörab ümber müokardi ümberkujunemise ja parandab südamefunktsiooni, reguleerides SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signaalitelge ja pärssides mitokondriaalset oksüdatiivset stressi HF-rottidel. Tulemused on mõeldud andma eksperimentaalseid tõendeid uute südamepuudulikkust ennetavate ravimite väljatöötamiseks.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Rakukultuur ja ravi

AC16 rakud ostetakse ettevõttest Bena Culture Collection. Rakke hoitakse kõrge glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA), mis sisaldab 10 protsenti veise loote seerumit (10 protsenti FBS; Gibco) T-75 kolbides (Corning Glassworks, Corning, NY, USA). Tingimusi hoitakse 37 kraadi juures niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5 protsenti CO2. Kui rakud saavutavad 70% -80% konfluentsuse, inkubeeritakse ISO (Sigma, USA) rühma rakke 10 uM ISO (Sigma, USA) sisaldava söötmega 24 tundi, ECH rühma rakke töödeldakse eelnevalt 50 uM ECH-ga (MCE). , USA) 30 minutit enne ISO-säritust. Kontrollrakke (Ctrl) ei töödelda midagi.

müüa tsistancheväljavõte

2.2|Mitokondriaalse ROS taseme tuvastamine luminooli kemoluminestsentsi abil

Mitokondrid eraldatakse ja puhastatakse AC-16 rakkudest, kasutades Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) vastavalt tootja juhistele. Valgukontsentratsioonid määratakse BCA valguanalüüsi komplekti (Biotech) abil. Mitokondriaalne ROS-i tase tuvastatakse Elisa komplekti kasutades luminaali (3-aminoftaalhüdrasiid 5-amino-2, 3-dihüdro-1, 4-ftalasiindioon). (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), reageerib see ROS-iga ja põhjustab footonite emissiooni, mis on ribaspekter, mille tipp on umbes 460 nm, ja suhteline valgusühik (RLU) tuvastatakse kemoluminestsentsmõõteriistaga ja muundatakse RLU/ug-ks. mitokondriaalne valk.

2,3|8-OHdG-d kasutatakse mitokondriaalse DNA oksüdatiivse kahjustuse hindamiseks

Mitokondriaalse DNA oksüdatiivset kahjustust hinnatakse 8-hüdroksü-2-deoksüguanosiini (8-OHG) sisalduse tuvastamisega. Puhastatud mitokondrid rakkudes isoleeritakse ülaltoodud mitokondrite isoleerimiskomplekti (Sigma) abil. Valgukontsentratsioonid määratakse BCA valguanalüüsi komplekti (Biotech) abil. Seejärel eraldatakse need 8-OHdG taseme määramiseks Elisa komplekti (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) abil vastavalt tootja juhistele. Värvimuutuse neeldumist mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 450 nm. Seejärel määratakse 8-OHdG kontsentratsioon proovides, võrreldes proovide OD-d standardkõveraga ja teisendatakse ühikuteks ng/ml.

2.4|MMP mõõtmine JC poolt-1

Mitokondrid eraldatakse ja puhastatakse AC-16-st ning valgu kontsentratsioon määratakse ülalmainitud viisil. Seejärel resuspendeeritakse mitokondrid kontsentratsiooniga 1 mg/ml, MMP mõõdetakse JC-1 testikomplekti abil vastavalt tootja juhistele. Fluorestsentsi intensiivsust mõõdetakse ergastuse lainepikkusel: 490 nm, pilu 5 nm, emissiooni lainepikkusel: 590 nm, pilu 5 nm spektrofotomeetriga,30 tulemused on esitatud kui FLU/ugP.

2,5|Apoptootiliste rakkude tuvastamine voolutsütomeetria abil AC-16 rakkudes

Voolutsütomeetriat kasutatakse raku apoptoosi hindamiseks. Apoptootiliste ja nekrootiliste rakkude tuvastamiseks vastavalt tarnija juhistele kasutatakse anneksiin V-FITC/PI apoptoosi tuvastamise komplekti (CWBIO, Hiina). Varajases staadiumis apoptoos, hilises staadiumis apoptoos või nekroos, rakujäägid ja elujõulised rakud on identifitseeritud anneksiin V (pluss)/PI (-), anneksiin V (pluss)/PI (pluss), anneksiin V (-)/PI. ( pluss ) ja anneksiin V (−)/PI (−). Fluorestsentsi intensiivsust analüüsitakse voolutsütomeetriga (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Iga katset korratakse 3 korda.

2,6|Hinnati intratsellulaarset ROS-i voolutsütomeetriga

Pärast töötlemist rakud trüpsiinitakse, pestakse kaks korda PBS-ga. Seejärel resuspendeeritakse rakud PBS-is, värvitakse DCFH-DA-ga (Beyotime, Hiina) lõppkontsentratsioonil 1 µM ja inkubeeritakse 1 tund 37 kraadi juures CO2-ga inkubaatoris ning seejärel testitakse voolutsütomeetris 488 nm ergastuse juures. . Fluorestsentsi intensiivsus tähistab rakusisese ROS-i taset.

2,7|Katsetage karbonüülvalgu sisaldust AC-16 rakkude mitokondrites

Pärast töötlemist eraldatakse puhastatud mitokondrid ja töödeldakse ultraheliga jääl ning töödeldakse mitokondriaalsete nukleiinhapete sadestamiseks 1% streptomütsiinsulfaadiga, määratakse valgu kontsentratsioon. Karbonüülvalgu sisaldust testitakse Elisa komplekti (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) abil, mis põhineb karbonüülrühma derivatiseerimisel dinitrofenüülhüdrasiiniga (DNPH), vastavalt komplekti juhistele mõõdetakse OD mikroplaadilugejaga ja konverteeritakse nmol/ mg valku, võrreldes standardkõveraga.

2,8|Lipiidide peroksüdatsiooni taseme määramine AC-16 rakkude mitokondrites

Pärast töötlemist rakud kogutakse ja lüüsitakse, mitokondrid eraldatakse ja puhastatakse ning krakitakse ultraheliga, valgu kontsentratsioon määratakse BCA valguanalüüsi komplektiga (Biotech), lipiidide peroksüdatsioon määratakse malondialdehüüdi (MDA) tasemega TBARS-testi abil. , kasutades komplekti (Nan jing Jian cheng, Hiina) ja MDA taset mõõdetakse tootja protokolli järgi. OD tuvastatakse 586 nm juures mikroplaadilugejaga ja muudetakse standardkõveraga võrreldes μmol/g valguks.

2,9|Loomad ja ravi

Noored isased Sprague-Dawley rotid, kes kaaluvad 120-140 g, on saadud Xi'an Jiao tongi ülikooli laboriloomade keskusest (Shaanxi, Hiina). Uurimine on kooskõlas USA riikliku terviseinstituudi poolt välja antud laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendiga (NIH väljaanne nr.{2}}, muudetud 1996. aastal) ja katseprotokollid on heaks kiidetud kohalike võimude poolt ( Xi 'a Jiao Tongi ülikooli meditsiiniosakonna biomeditsiinilise eetika komitee). HF-i roti mudel loodi nii, nagu me varem kirjeldasime.31 Lühidalt, isoproterenooli (10 mg/kg) manustatakse üks kord päevas intraperitoneaalse süstina 2 nädala jooksul (määratletud kui HF-rühm), ECH-d manustatakse koos 20 ug/g üks kord päevas intraperitoneaalse süstina 30 minutit enne ISO töötlemist (defineeritud kui ECH rühm) ja manustamine kestab 2 nädalat. Kontrollloomadele manustati 0,9% NaCl (defineeritud kui Ctrl-rühm). Südame funktsiooni hindamiseks tehakse ehhokardiograafia mõõtmised.

2.10|Ehhokardiograafilised mõõtmised

Loomad anesteseeritakse intraperitoneaalse 300 mg/kg kloraalhüdraadi süstiga. Ehhokardiograafiliste uuringute tegemiseks kasutatakse ultrahelisüsteemi SONOS-2500 7,5 MHz ultrahelianduriga (HP, USA). Vasaku vatsakese väljutusfraktsioon (LVEF), vasaku vatsakese fraktsionaalne lühenemine (LVFS), vasaku vatsakese lõpp-diastoolsed mõõtmed (LVIDd), vasaku vatsakese lõpp-süstoolsed mõõtmed (LVID), südame löögisagedus (HR), vatsakestevahelise vaheseina paksus diastoolis (IVSTd) ), mõõdetakse vasaku vatsakese tagumise seina paksust diastoolis (LVPWTd) nii, nagu oleme eelnevalt kirjeldanud.32

JOONIS 1 50μmol ECH inhibeerib tõhusalt 10 μmol/L ISO poolt indutseeritud AC-16 rakkude mitokondriaalset oksüdatiivset stressi ning kaitseb mitokondriaalset funktsiooni ja vähendab apoptoosi.

2.11|Mõõdetakse südame ja kehamassi suhet (HW/BW).

Rott kaalutakse enne tuimastamist, värske süda isoleeritakse ja pestakse veri välja 0,1 mol/L PBS-iga, lõigatakse ära veresooned ja muu üleliigne kude ning süda kaalutakse, seejärel määratakse HW/BW(mg/100g) arvutatud.

2.12|Histoloogiline värvimine

Rottide südamed lõigatakse lahti ja fikseeritakse 4-protsendilises paraformaldehüüdis, sisestatakse parafiini ja lõigatakse 5 μm paksusteks viiludeks. Patoloogiliste muutuste jälgimiseks kasutatakse hematoksüliin-eosiini (HE) värvimist ja rottide müokardikoe kollageenkiudude hindamiseks Massoni trikroomi. Südame kollageeni mahufraktsiooni (CVF) ja kardiomüotsüütide ristlõikepindala mõõdetakse Image-Pro Plus 6-ga.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2,13|TUNEL värvimine

Müokardi kude vasakust vatsakesest kogutakse ja TUNELi test viiakse läbi nii, nagu me varem kirjeldasime32

2,14|Transmissioonelektronmikroskoop

Värske südamekude fikseeritakse 2,5% glutaaraldehüüdis 4 kraadi juures, kude lõigatakse seejärel 1 mm3 suuruseks ja fikseeritakse uuesti 2,5% glutaaraldehüüdis 4 kraadi juures 2 tunniks, seejärel pestakse 0,1 mol/L PBS-ga, fikseeritakse. 1-protsendilises osmionhappes, mis on dehüdreeritud atsetooniga ja sisestatud epoksüvaikuga, tehakse üliõhukesed viilud, mis on õhukesed umbes 800 nm, värvitakse uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga ning seejärel vaadeldakse transmissioonielektronmikroskoobiga (H{). {13}}, Hitachi Limited, Jaapan). ECH kaitsva toime kvantifitseerimiseks mitokondriaalses morfoloogias analüüsitakse Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA) abil statistiliselt mitokondriaalset keskmist ümbermõõtu, keskmist mitokondri ristlõike pindala, degeneratsiooni protsenti ja vakuoliseerumise protsenti mitokondrites.

2,15|Kvantitatiivne PCR

Kogu RNA valmistatakse vasaku vatsakese koest Trizoli reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA sünteesimiseks kasutatakse TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Jaapan). Kollageeni spetsiifilised praimerijärjestused, mida kasutasin reaalajas PCR-i jaoks, on järgmised: edasi: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, tagurpidi: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH edasi 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', tagurpidi 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Reaalajas kvantitatiivne PCR (qPCR) teostatakse SYBRPremix Ex-ga Taq (täiuslik reaalajas) (Takara, Jaapan). MRNA suhteline tase arvutatakse GAPDH-ga normaliseerimise teel 2-ΔΔCT meetodil.

2,16|SIRT1, FOXO3a, MnSOD valgu ekspressiooni Western blot analüüs

Vasaku vatsakese koe kogu valk ekstraheeritakse jääl, kasutades külma RIPA puhvrit (BioRad, USA) koos proteaasi inhibiitori kokteiliga (Sigma-Aldrich). Kontsentratsioon määratakse BCA meetodil. Western blot protseduure on kirjeldatud eelnevalt.33 Lühidalt, valguproov fraktsioneeritakse 15% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelidel, kantakse üle PVDF membraanidele (BioRad, USA), blokeeritakse 5% lõssi ja inkubeeritakse hiire MYH antikehaga. (lahjendatud 1:200, Santa Cruz, USA). Seejärel inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse hiire antikehaga (lahjendatud 1:2, 000, Santa Cruz, USA). Valgu suhteline tase arvutatakse, normaliseerides keskmise kiirguse väärtuse -aktiiniks. Valguribad tuvastatakse kemoluminestsentssüsteemiga (ChemiDoc XRS, BioRad).

2,17|Mitokondriaalse oksüdatiivse stressi mõõtmine roti müokardis

Roti müokardi puhastatud mitokondrid isoleeritakse Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) abil vastavalt tootja juhistele, mitokondriaalne ROS, MMP, mtDNA oksüdatiivne kahjustus, karbonüülitud valgu sisaldus ja lipiidide peroksüdatsiooni tase mitokondrites tuvastatakse samade meetoditega nagu. eespool kirjeldatud rakukatsed. Tähelepanuväärne on, et ROS müokardi koes tuvastatakse DCFH-DA fluorestsentssondidega, fluorestsentsi intensiivsus tuvastatakse ensüümi märgistamise mõõteriistaga, tulemused on esitatud kui RLU / ug mitokondriaalne valk.

2,18|Statistiline analüüs

Kõik andmed on esitatud keskmistena ± SEM. Mitme rühma erinevuste võrdlemiseks kasutatakse ühesuunalist ANOVA-d, millele järgneb Tukey post hoc olulisuse test. Kogu statistika määratakse tarkvara SPSS15.{2}} abil (SPSS Inc, IL, USA). Tõenäosusväärtust P < 0,05="" peetakse="">

3|TULEMUSED

3.1|50 µM ECH inhibeerib tõhusalt mitokondriaalset oksüdatiivset kahjustust ja apoptoosi AC-16 rakkudes

Töötlemata rakud määratakse Ctrl-rühmana. Esiteks, nagu näitab joonis 1A, inhibeerib ECH ISO poolt indutseeritud mitokondriaalset ROS-i. ISO-ga töödeldud rakud näitavad mitokondriaalse ROS-i olulist suurenemist võrreldes Ctrl-ga ja seda tõusu nõrgendab oluliselt eeltöötlus 50 μM ECH-ga. Teiseks võib ECH pärssida ISO poolt indutseeritud mtDNA oksüdatiivset kahjustust. 8-OHdG arvatakse olevat üks levinumaid oksüdatiivsest stressist tulenevaid DNA kahjustusi ning see on oksüdatiivse DNA kahjustuse ja paranemise biomarker. Nagu jooniselt 1B on näha, tuvastatakse 8-OHdG sisaldus AC-16 rakkude puhastatud mitokondrites, tulemused näitavad, et 8-OHdG tase ISO-ga töödeldud rakkude mitokondrites tõusis dramaatiliselt. kuid muutus tühistati 50 μM ECH võrra. Kolmandaks kaitseb ECH tõhusalt MMP-d, mida ISO kahjustab. Fluorestsentsi intensiivsus on ISO-ga töödeldud rakkudes oluliselt vähenenud võrreldes Ctrl-rakkudega, samas kui eeltöötlus 50 μM ECH-ga nõrgendab märkimisväärselt MMP vähenemist, nagu näitab joonis 1C. Neljandaks kaitseb ECH mitokondriaalse valgu oksüdatiivse kahjustuse eest AC-16 rakkudes. Nagu joonisel fig 1D on näha, on ISO-ravirakkude mitokondrites karbonüülvalgu sisaldus oluliselt suurenenud ja ECH nõrgendab efekti. Viiendaks inhibeerib ECH ka mitokondriaalse lipiidide peroksüdatsiooni AC-16 rakkudes, mida indutseerib ISO. Nagu näitab joonis 1E, on lipiidperoksiidide tase ISO-rakkude mitokondrites ilmselgelt kõrgem kui Ctrl-rakkudes, samas kui 50 μM ECH-eeltöötlus vähendab seda suurenemist oluliselt. Lõppkokkuvõttes pärsib ECH rakusisese ROS-i akumuleerumist. Nagu joonisel fig 1F on näha, on rakusisese ROS-i tase ISO rakkudes märkimisväärselt suurenenud ja ECH-ga eeltöödeldud rakkudes märgatavalt vähenenud. Joonisel fig 1G on näidatud, et AC-16 rakkude apoptoosikiirus on pärast 24-tunnist inkubeerimist 10 µM ISO-ga võrreldes Ctrl-rakkudega oluliselt suurenenud, samas kui 50 µM ECH-ga eeltöödeldud rakud vähendavad oluliselt ISO-indutseeritud apoptoosi.

JOONIS 2 HF-rottide ISO-ga indutseeritud südamehüpertroofia leevendub ja südamefunktsioon paraneb oluliselt ECH-raviga.

3.2|ECH pöörab ümber müokardi ümberkujunemise ja parandab ISO-indutseeritud HF rottide südamefunktsiooni

Nagu on näidatud joonisel fig 2A, on HF-rottide südamed ilmne hüpertroofia ja need pöörduvad ECH-ga töötlemisel. Nagu joonised 2B-D ja L näitavad, vähendab ECH HW/BW. Ehhokardiograafia tulemused näitavad, et LVEF ja LVFS on HF rühmas oluliselt vähenenud, LVIDd, LVID ja IVSTd on HF rühmas oluliselt suurenenud. Kuid ECH vähendab oluliselt LVIDd-d, LVID-sid, IVSTd-d ning parandab LVEF-i ja LVFS-i, kolme rühma vahel ei ole olulist erinevust HR-is, LVPWTd suureneb HF-i korral, kuid puudub erinevus ECH-i ja Ctrl-i või ECH-i ja HF-i vahel. Joonisel fig 2E-K on näidatud. HE-värvimise tulemused näitavad, et südamelihase hüpertroofia, korrastatud häire või degeneratsiooninekroos, põletikuliste rakkude infiltratsioon ja interstitsiaalne hüpereemia ja tursed HF-rottidel ning ECH leevendab neid kahjustusi oluliselt, müokardi hüpertroofia ja korrastatud häire leevendub, degeneratsiooninekroos ja põletikuline infiltraat vähenevad, nagu on näidatud joonisel 3A. Mõõdetakse kardiomüotsüütide ristlõike pindala, see on oluliselt suurenenud pärast ISO ja vähenenud ECH-ga ravitud rühmas, nagu on näidatud joonisel 3E. Kollageeni ladestumise hinnangud Massoni värvimisega näitavad, et vasaku vatsakese kollageeni sisaldus HF-rottidel on pärast ECH-ga töötlemist ilmselt suurenenud ja ilmselt vähenenud, mis ilmselt vähendab CVF-i. Reaalajas PCR analüüs näitab, et prokollageeni tüüpi Ⅰ transkriptid on ISO rottidel ülesreguleeritud ja ECH rottidel alla reguleeritud, need tulemused on üksteisega kooskõlas, nagu näitavad joonised 3B ja FG, andmed näitavad, et ECH vähendab tõhusalt kollageeni ladestumist. . TUNEL-positiivsete rakkude arv kardiomüotsüütides on HF-rottidel Ctrl-ga võrreldes oluliselt suurenenud, ECH vähendab märkimisväärselt müokardirakkude apoptoosi ja joonisel 3C-D on kujutatud TUNEL-positiivsete rakkude tüüpiline pilt vastavalt väikese ja suure võimsusega väljadel ning joonisel fig. 3H näitab müokardirakkude apoptoosi kiirust. Need tulemused näitavad, et ECH muudab tõhusalt müokardi hüpertroofiat, müokardi interstitsiaalset fibroosi ja apoptoosi ning parandab südamefunktsiooni ISO poolt indutseeritud HF-rottidel.

JOONIS 3 Histoloogilise värvimise tulemused näitavad, et ECH pöörab ümber HF-rottide vasaku vatsakese remodelleerumise, mis on indutseeritud ISO-ga.

3,3|ECH kaitseb müokardi ultrastruktuuri HF-rottidel

Ülekandeelektronmikroskoopide tulemused näitavad, et ECH võib müokardi ultrastruktuuri kahjustusi nõrgendada, nagu on näidatud joonistel 4A-B. Müofibrillid on vertikaalselt asetsevad, sarkomeeride struktuur on ilmne, müofibrillid on korralikult paigutatud ja Z-joon on selge. Mitokondrid on Ctrl-rottidel korralikult paigutatud ja struktuur on selge. Müofibrillid on aga desorganiseerunud, rebenevad ja lahustunud, sarkomeeride struktuur on hägune, Z-joone puudumine, müokardi kontraktsioonitsoon on nähtav, mitokondrite arv ja maht on suurenenud, mitokondrid on erineva kuju ja suurusega, paiknevad häireteta, struktuur on ebaselge, turse ja kristallide killustumine, kokkuvarisemine või kokkutõmbumine ja lahustatud vakuoolis HF-rottidel. ECH ilmselgelt nõrgendab neid muutusi, suurem osa südamelihaskiududest on korralikult paigutatud ja müokardi filamendid on selged, Z-joon on olemas, kuigi filamentide mõningane lahustumine on ilmne, sarkomeeride struktuur on selge, mitokondrite tihedus on vähenenud, kujud ja suurused leevenevad, on paigutatud kenamalt, mitokondrite turse ja kristallide killustumine, kokkuvarisemine või kokkukleepumist ning vakuoliseerumist vähendavad ilmselt ECH võrreldes HF-ga. Mitokondrite turse ja kristallide killustumine, kokkuvarisemine või kokkutõmbumine ning osaline vakuolisatsioon on määratletud kui mitokondriaalne degeneratsioon. Tulemused näitavad, et ECH kaitseb tõhusalt müokardi ultrastruktuuri ja kaitseb eriti mitokondriaalset morfoloogiat HF-rottidel, nagu näitab joonis 4C-F.

JOONIS 4 ECH kaitseb ISO poolt indutseeritud HF-rottide kardiomüotsüütide ultrastruktuuri ja mitokondriaalset morfoloogiat.

3,4|ECH reguleerib üles SIRT1, FOXO3a ja MnSOD valgu ekspressiooni

Western Blot analüüs näitab, et SIRT1, FOXO3a ja MnSOD valgu ekspressioonitase on HF-rottidel oluliselt alla reguleeritud, kuid ECH reguleerib ilmselgelt vähenenud valgu ekspressiooni. Immunoblotanalüüsi ja statistilise analüüsi tulemuste tüüpilised valguribad on näidatud joonisel 5. Andmete osa näitab, et ECH suurendab SIRT1, FOXO3a ja MnSOD valgu ekspressiooni.

3,5|ECH pärsib mitokondriaalset oksüdatiivset stressi vasaku vatsakese müokardi koes

Selles osas mõõdetakse mitokondriaalset ROS-i, MMP-d, mitokondriaalse DNA oksüdatiivset kahjustust, karbonüülvalgu sisaldust ja lipiidide peroksüdatsiooni taset mitokondrites rottide vasaku vatsakese müokardi koes ning tulemused on kooskõlas rakukatsetega, st. ECH vähendab mitokondriaalset ROS-i, kaitseb MMP-d, leevendab mtDNA kahjustusastet, vähendab karbonüülvalgu sisaldust ja lipiidide peroksüdatsiooni mitokondrites, nagu on näidatud joonisel 6.

JOONIS 5 ECH reguleerib üles SIRT1, FOXO3a ja MnSOD valgu ekspressioonitaset, mis on HF-rottidel alla reguleeritud.

4|ARUTELU

See uuring näitab, et ECH mängib tõhusat rolli müokardi remodelleerumise ennetamisel ja südamefunktsiooni parandamisel SIRT1 / FOXO3a / MnSOD signaalitelje ülesreguleerimise ja mitokondriaalse oksüdatiivse stressi pärssimise kaudu.

Mitokondrid on oksüdatiivse fosforüülimise kõrvalsaadusena ROS-i tekke peamine koht, kuna nad on ROS-i läheduses, arvatakse, et mitokondriaalsed valgud, lipiidid ja mtDNA on oksüdatiivsete kahjustuste peamised sihtmärgid pärast mitokondriaalse ROS-i liigset emissiooni, 34, 35. see kahjustus stimuleerib ROS-i edasist tootmist, nõiaring jätkub, ROS ja oksüdatiivne stress võivad mitmete signaaliradade aktiveerimise kaudu põhjustada müokardi hüpertroofiat, apoptoosi, interstitsiaalset fibroosi ja HF-i.35 Seega näib, et ravimid, mis on suunatud mitokondriaalse oksüdatsiooni pärssimisele. stress on tõhus müokardi remodelleerumise ennetamisel. ECH on looduslik fenüületanoidglükosiid, traditsioonilise hiina ürdi Cistanche tubulosa komponent. seda on laialdaselt uuritud ja viimastel aastatel on tõestatud, et sellel on mitmesuguseid farmakoloogilisi toimeid, nagu kasvajavastane, apoptoosivastane, vananemisvastane, neuroprotektiivne toime jne. Uuringud on tõestanud, et ECH farmakoloogilised toimed sõltuvad peamiselt selle antioksüdantse ja põletikuvastase toime omadusest,18,21 ja ECH vähendab mitokondriaalset ROS-i ja kaitseb mitokondriaalset funktsiooni närvirakkude oksüdatiivsete kahjustuste eest.20,22 Siin näitasime kõigepealt, et ECH vähendab kardiomüotsüütide mitokondriaalset ROS-i, parandades seega MMP-d, vähendades mtDNA, valgu ja lipiidide oksüdatiivseid kahjustusi, inhibeerides tõhusalt mitokondriaalseid oksüdatiivseid kahjustusi ja vähendades apoptoosi in vitro ja in vivo, seega pöörab see ümber müokardi ümberkujunemise ja parandab südamefunktsiooni. See tähendab, et ECH on potentsiaalne uus ravim müokardi remodelleerumise ja südamepuudulikkuse ennetamiseks.

Normaalsetes tingimustes puhastab mitokondriaalne ROS peamiselt MnSOD-ga, mis jaotub mitokondrites ja kaitseb mitokondriaalse oksüdatiivse kahjustuse eest. Ang II vähendab oluliselt MnSOD ekspressiooni kardiomüotsüütides ja indutseerib müokardi hüpertroofiat, kuid resveratrool võib suurendada MnSOD ekspressiooni ja pärssida Ang II poolt indutseeritud müokardi hüpertroofiat.36 HF-i korral on MnSOD aktiivsus oluliselt vähenenud ja mitokondriaalse ROS teke suureneb .37,38 Südamespetsiifilistel MnSOD geenist väljalülitatud hiirtel ei saanud mitokondriaalset ROS-i puhastada ja ROS on suurenenud kardiomüotsüütides, mis viis mitokondriaalse düsfunktsiooni ja progresseeruva südame laienemiseni, mis lõpuks viib südamepuudulikkuseni.39 Käesolevas uuringus kinnitame, et et MnSOD ekspressioon on oluliselt vähenenud, mida ECH-ravi nõrgestab, ja seega väheneb mitokondriaalne ROS ja inhibeeritakse mitokondriaalne oksüdatiivne stress. See tähendab, et ECH kaitseb kardiomüotsüüte oksüdatiivsete kahjustuste eest MnSOD ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu, uurime täiendavalt nende mõjude aluseks olevaid molekulaarseid mehhanisme.

MnSOD ekspressiooni reguleerib FOXO3a, mis on transkriptsioonifaktor ja seondub MnSOD geenipromootori piirkonnas ning soodustab geeni transkriptsiooni.40 SIRT1 on FOXO3a ülesvoolu molekul ja see võib deatsetüülimise teel aktiveerida FOXO3a. SIRT1/FOXO3a/MnSOD signaalitelg mängib olulist rolli kaitses oksüdatiivse stressi eest teatud tüüpi rakutüüpides, signaalitelje aktiveerimine östradiooli poolt pärsib oksüdatiivset stressi ja avaldab südamekaitset24; Signaaltelje aktiveerimine resveratrooli poolt pärsib oksüdatiivsest stressist põhjustatud rakusurma40; Vastasel juhul inhibeerib angiotensiin II SIRT1/FoxO3a/MnSOD rada ja indutseerib mitokondriaalset oksüdatiivset stressi, mtDNA kahjustusi osteoblastides,41tüüpi 5 adenülüültsüklaas suurendab oksüdatiivset stressi, pärssides MnSOD ekspressiooni Sirt1/FoxO3a raja kaudu. SIRT1, FoxO3a ja MnSOD ekspressioon on HF-rottidel märkimisväärselt vähenenud ning mitokondriaalne ROS on tõusnud ja oksüdatiivne stress suureneb, kuid ECH muudab muutused ümber. Uued uuringud näitavad, et ECH seob otseselt SIRT1 ligandina ja moodustab 9 kovalentse sidemega kompleksi ning reguleerib üles SIRT1 ekspressiooni närvirakkudes.26 Kooskõlas selle uuringuga näitab käesolev uuring, et ECH reguleerib üles ka närvirakkude ekspressiooni. SIRT1 kardiomüotsüütides reguleerib seejärel MnSOD geeniekspressiooni FoxO3a kaudu ja inhibeerib mitokondriaalset ROS-i ja oksüdatiivset stressi.

Pikaajaline krooniline isheemia võib põhjustada müokardi hibernatsiooni, nendel hiberneerivatel müokardirakkudel esineb tavaliselt kontraktiilsete filamentide kadu, tsütosoolis on liigseid glükogeenigraanuleid, sarkoplasmaatiline retikulum ja põikituubulid,43 samuti esineb kõrvalekaldeid mitokondrite suuruses ja kujus. , reaktiivne müokardi hüpertroofia ja interstitsiaalne fibroos, mis on sekundaarne müotsüütide kadumisel.44 Ülaltoodud muutusi täheldasime ka oma uuringus HF-rottidel, samas kui ECH leevendab neid muutusi märkimisväärselt, kuna viimases uuringus teatati südamefunktsiooni taastumisest pärast isheemilist stressi. Müokardi hibernatsiooni45 tunnuse tõttu mõõdetakse ka müokardi glükogeeni taset, näitavad tulemused, et kolme rühma vahel ei ole olulist erinevust, nagu on näidatud joonisel 7J.

Eelmises uuringus tuvastati ka müokardi hibernatsioon mitteisheemilise südamepuudulikkuse sigade mudelis, stimuleerides LV vaba seina kõrgsagedusega,46 kuna mikrovaskulaarne obstruktsioon mängib olulist rolli müokardi talveunes ja sellest tulenevas kontraktiilses düsfunktsioonis ning see paraneb märgatavalt, kui mikrovaskulaarset obstruktsiooni tühistab ravim.47 Praegu on mõnedes uuringutes jõutud järeldusele, et revaskularisatsiooniteraapia on efektiivne müokardi hibernateerimisel,43 kasutades HE ja Massoni värvimist, täheldame, et müokardi kapillaaride ja arterioolide tihedus on HF-rottidel ilmselgelt vähenenud ja oluliselt leevenenud. ECH abil, nagu on näidatud joonistel 7A-H. Varasemad uuringud on näidanud, et teised looduslikud ühendid, nagu odra beeta-glükaan, avaldavad kardioprotektiivset toimet, suurendades MnSOD ekspressiooni, 48, 49 ja MnSOD tõus on seotud suurenenud müokardi kapillaaride tiheduse ja VEGF ekspressiooniga. VEGF ekspressiooni tuvastamiseks teostasime RT-PCR, andmed on kooskõlas histoloogilise värvumise leiduga, mis tähendab, et ECH võib soodustada angiogeneesi ja suurendada müokardi kapillaaride tihedust VEGF ekspressiooni reguleerimise kaudu, nagu on näidatud joonisel 7I. Käesolevas uuringus leitakse, et ECH võib kaitsta ja suurendada müokardi kapillaare ja arterioole SIRTI / FOXO3a / MnSOD raja ja VEGF ekspressiooni ülesreguleerimise kaudu, pärssides seeläbi talveunevat müokardi ja aidates kaasa südamefunktsiooni parandamisele.

Cistanche aitab kaasajuurdesüdame funktsiooni parandamine.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

Tuleb märkida, et kardiomüotsüütide apoptoos on teadaolevalt oluline südamepuudulikkuse patoloogiline muutus ja käesolev uuring kinnitab tõepoolest, et suur hulk apoptootilisi rakke HF-rottidel ja ECH-s vähendab oluliselt apoptoosi, reguleerides SIRTI / FOXO3a / MnSOD rada ja inhibeerides. mitokondriaalne oksüdatiivne stress, nagu eespool mainitud.

Eelkõige pöörab ECH ümber müokardi ümberkujunemise ja parandab südamefunktsiooni SIRT1 / FoxO3a / MnSOD signaalitelje ülesreguleerimise kaudu, pärssides seega mitokondriaalset oksüdatiivset stressi ja vähendades hibernatsiooni müokardi teket. Seega tehakse ettepanek, et ECH on potentsiaalne ravim müokardi remodelleerumise ja südamepuudulikkuse ennetamiseks või raviks.