Kuidas Cistanche ehhinakosiid suurendab androgeenide taset endoteelirakkude kaudu?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktne.

Ehhinakosiid (ECH) on looduslik ühend, millel on endoteelist sõltuv vasodilateeriv toime. Lämmastikoksiid (NO) on oluline vasorelaksant, mis vabaneb endoteelirakkudest. Selleks et uurida ECH-indutseeritud NO tootmise molekulaarset mehhanismi endoteelirakkudes, uuriti käesolevas uuringus androgeeniretseptori (AR) ja fosfatidüülinositooli 3-kinaasi (PI3K) / proteiinkinaasi B (Akt) raja osalust. endoteeli lämmastikoksiidi süntaasi (eNOS) fosforüülimine inimese nabaveeni endoteelirakkudes (HUVEC). Fluorestsentssondi DAF-FM kasutamisel leiti, et NO tootmine on oluliselt suurenenud ja eNOS fosforüüliti Ser1177 juures kontsentratsioonist sõltuval viisil 0.01-10 µM ECH-ravi ajal HUVEC-ides. Lisaks vähenes ECH poolt indutseeritud NO tootmine ja eNOS-i fosforüülimine, kui seda töödeldi AR antagonisti nilutamiidiga või transfekteeriti AR väikeste segavate RNA-dega. Lisaks tühistas 5 uM wortmanniini (PI3K inhibiitor) ECH-indutseeritud Akt fosforüülimise Ser473 juures. Need andmed näitasid, et ECH stimuleeris NO tootmist eNOS-i AR-sõltuva aktiveerimise kaudu HUVEC-ides ja et PI3K / Akt rada võib olla seotud ECH poolt indutseeritud eNOS-i fosforüülimisega.

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Cistanche Hoffman. Et Link on mitmeaastane parasiittaim, mis kuulub perekonda Orobanchaceae. HerbaCistanche, tüviCistanche deserticolaYC MA jaCistanche tubulosa(Schenk). Cistanche on toniseeriv ravimtaim, mida on kasutatud raviksneerupuudulikkus, impotentsus, haiguslik leukorröa ja seniilne kõhukinnisus (1), mis võib olla tingitud selle androgeenitaolisest või suguhormoonide reguleerivast toimest (2). Ehhinakosiid (ECH; C35H46O20; molekulmass 786,73; joonis 1) on üks fenüületanoidglükosiididest (PhG), mis on eraldatud Herba vartest.Cistancheja sellel on mitmeid bioloogilisi omadusi, sealhulgas antioksüdantne, vananemisvastane, põletikuvastane, hepato- ja neuroprotektiivne toime (3). Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et Herba erinevad koostisosadCistanche, sealhulgas ECH,akteosiid, kankaanoos, Lanka pool F jatsistanosiidF, neil on vasorelaksantne toime (4).

Endoteel on veresoonte kriitiline regulaator ja lämmastikoksiid (NO) on oluline lõõgastav tegur, mida vabastabendoteelirakud.Silelihasrakkudesse difundeerudes aktiveerib NO guanülaattsüklaasi, suurendab tsüklilise guanosiinmonofosfaadi (cGMP) taset ja seejärel aktiveerib cGMP-sõltuvad proteiinkinaasid (PKG-d), et soodustada silelihaste lõdvestumist (5). Varem on näidatud, et 350-400 µM ECH mõjutab otseselt veresoonte silelihaseid ja inhibeerib hüpoksiast põhjustatud proliferatsiooni roti kopsuarteri silelihasrakkudes (6), samas kui 30-300 µM ECH põhjustas endoteelis ägeda vasorelaksatsiooni. terved rõngad kontsentratsioonist sõltuval viisil ja suurenenud cGMP tootmine fenüülefriini poolt kokkutõmbunud aordirõngaste corpus cavernosum silelihastes (7). Avades NO-cGMP-PKG-BKCa kanalid silelihasrakkudes, pärssis 100 või 300 µM ECH noradrenaliinist põhjustatud kontraktsiooni rottide kopsuarterites, eriti endoteeli katmata rõngastes (8).Endoteelirakudon südame-veresoonkonna funktsiooni peamised regulaatorid ja mitmel juhul on leitud, et endoteelist sõltuv lõõgastus oli tingitud endoteelist vabanevast ülekantavast ainest, nagu NO (9). Kuid ECH-indutseeritud NO tootmise ülesvoolu molekulaarne mehhanism veresoontesendoteelirakudnõuab edasist uurimist. Vaskulaarses endoteelis vahendab NO teket peamiselt endoteeli NO süntaas (eNOS). Mitmed rühmad on näidanud, et fosfatidüülinositooli 3-kinaasi (PI3K) rada aktiveerib seriin-treoniini proteiinkinaasi B (Akt), mis põhjustab otsest eNOS-i fosforüülimist seriinil 1177 (Ser1177) (10). Androgeeniretseptor (AR) on tuumaretseptorite alamperekonna s3 liige, mis muudab kanooniliselt geeniekspressiooni. AR lokaliseerimine rakumembraani koobastesse on seotud endoteelirakkude funktsiooni või geeniekspressiooni mittegenoomse reguleerimisega, käivitades c-Src/PI3K/Akt kaskaadi, mille tulemuseks on lõpuks eNOS-i fosforüülimine ja NO tootmine (11). Inimese aordisendoteelirakud, on teatatud, et testosteroon aktiveerib PI3K/Akt signaaliülekande ja indutseerib kiiresti NO tootmist AR ja PI3K p85 subühiku otsese interaktsiooni tõttu kardiovaskulaarsüsteemis (12). Teatati, et ECH süvendab hormoonpuudulikkusega seotud sümptomeid ja avaldab androgeenitaolist mõju testosterooni asemel konkureeriva seondumise tõttu AR-ga (2). Seetõttu püstitati käesolevas uuringus hüpotees, et PI3K / Akt rada võib olla seotud NO tootmisega ECH poolt indutseeritud AR-sõltuva eNOS-i fosforüülimise kaudu. Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata järgmisi ECH mõjusid: i) NO tootmise ja eNOS-i fosforüülimise indutseerimine; ii) AR osalemine eNOS-i fosforüülimises ja iii) PI3K/Akt raja aktiveerimine inimese nabaväädi endoteelirakkudes (HUVEC), mis on hästi tuntud eksperimentaalne mudel endoteelirakkude funktsioonide reguleerimise ja angiogeneesi uurimiseks (13).

materjalid ja meetodid

Kemikaalid ja reaktiivid. ECH (puhtus, 92,5 protsenti) saadi riikliku toidu- ja ravimikontrolli instituudi riiklikest ravimite võrdlusstandarditest. Antikehad p-Akt (Ser473; kat. nr ab8805), Akt (kat. nr ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. nr ab184154) ja eNOS (kat. nr ab76198) vastased osteti ettevõttelt Abcam . Nilutamiidi ja ICI 182780 inhibiitorid saadi firmalt Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME osteti ettevõttelt Adamas-Beta, Ltd. ja wortmannin osteti ettevõttelt Pribolab.

Rakukultuur ja ravimite ravi.

HUVEC-id saadi ettevõttest ScienCell Research Laboratories Inc. ja neid kultiveeritiendoteelirakksööde (ECM; ScienCell Research Laboratories) 5% (maht/maht) veise loote seerumiga (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) ja 1% endoteelirakkude kasvulisandiga (ECGS) temperatuuril 37 °C (5% CO2 ja 95 protsenti niiskust) (14). Konfluentsuse saavutamisel lõigati rakud trüpsiiniga ja plaaditi 1% FBS-i ja 1% EKGS-iga ECM-i. Kõikide katsete jaoks plaaditi HUVEC-id kontsentratsiooniga 1x104/ml ja kasvatati kuni ühinemiseni. Enne ECH või muude stimulaatoritega töötlemist inkubeeriti rakke 6 tundi fenoolpunasevabas ECM-is ilma FBS-i ja EKG-deta, et kutsuda esile kasvu peatamine. Inhibeerimiskatsetes eelinkubeeriti HUVEC-e erinevate antagonistide või inhibiitoritega, sealhulgas 10 µM nilutamiidi, 10 µM ICI 182780, 0,5 mM L-NAME või 5 µM wortmanniiniga, 30 minutit koos ECH-ga või ilma, temperatuuril 37˚C. Kõigis rühmades, sealhulgas kontrollrühmas, kasutati DMSO-d lahustina võrdsetes kontsentratsioonides 0,001 protsenti.

Intratsellulaarse NO tootmise mõõtmine.

Tsütosoolse NO kontsentratsiooni suhtelisi muutusi HUVEC-des jälgiti fluorestseeruva NO-sondi DAF-FM (Cayman Chemical Company) abil, nagu varem teatatud (12). Lühidalt, rakud laaditi 5 uM DAF-FM diatsetaadiga 20 minutiks temperatuuril 37 ˚C mustale mikrotiiterplaadile ja loputati mitu korda PBS-ga (pH 7,4). Fluorestsents määrati ergastuse ja emissiooni lainepikkustel vastavalt 495 ja 515 nm, kasutades fluorestseeruvat mikroplaadilugejat (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) ja kompaktset pöördmikroskoopi (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Western blot analüüs.

Nagu varem teatatud (15), pesti rakkude konfluentseid monokihte kaks korda jääkülmas PBS-is ja lüüsiti RIPA puhvriga (P0013D; Beyotime Institute of Biotechnology). Valgu kontsentratsiooni supernatandis mõõdeti bitsinhoniinhappe analüüsimeetodil (16). Seejärel laaditi igale rajale 30 µg valku, eraldati 10% polüakrüülamiidgeelidega ja kanti polüvinülideendifluoriidmembraanidele. Membraanid blokeeriti 5% lõssisisaldusega 1 tund temperatuuril 25 °C. Pärast inkubeerimist monoklonaalsete antikehadega Akt (lahjendus 1:1, 000), p-Akt (lahjendus 1:500), eNOS (lahjendus 1:2, 000) või p-eNOS (1) vastu :1,000 lahjendus) temperatuuril 4 ˚C üleöö, pesti membraane TBST-ga (sisaldab 0,1 protsenti Tween-20) 4 korda umbes 15 minutit pesu kohta temperatuuril 25 ˚C. Seejärel inkubeeriti membraane mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (lahjendus 1:5, 000; hiirevastane antikeha, kat. nr A0216 või küülikuvastane antikeha, kat. nr A0208, Beyotime Institute of Biotechnology) 1 tund temperatuuril 25 ˚C ja tuvastati täiustatud kemoluminestsentskomplekti (kat. nr 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.) abil. Riba intensiivsused kvantifitseeriti, kasutades Image J geelianalüüsi tarkvara versiooni 1.8.0_112 (National Institutes of Health).

Väikese segava (si) RNA ettevalmistamine ja transfektsioon.

Pikad kaheahelalised RNA-d sünteesiti AR-i ja östrogeeniretseptori (ER) sihtmärk-mRNA-ga tabelis I näidatud järjestustega. SiRNA katkestamise tingimused hõlmasid HUVEC-de transfekteerimist 70-protsendilise konfluentsuse juures, mida säilitati mittemikroobsetes ainetes. kultiveerimissöödet 60 mm kollageeniga kaetud kultuuritassides. 5 nM AR-siRNA või 10 nM ER-siRNA transfektsioon Lipofectamine 3000 reagendiga (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) viidi läbi eraldi vastavalt tootja protokollidele. Transfektsiooni efektiivsust hinnati pöördtranskriptsiooni kvantitatiivse PCR analüüsiga (RT-qPCR), nagu varem teatatud (17). Termotsükli tingimused olid järgmised: 10 min temperatuuril 95 °C; 40 tsüklit 95 ˚C 5 sekundit ja 60 ˚C 1 min ning sulamiskõver 95 ˚C 15 s, 60 ˚C 1 min ja 95 ˚C 15 s; iga proovi jaoks viidi läbi kolm sõltumatut bioloogilist kordust. Järgmised katsed viidi läbi 48 tundi pärast transfektsiooni. Praimerite paarid kujundati tarkvara Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) abil järgmiste järjestustega: AR edasi, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' ja tagurpidi, 5'-GACTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER edasi, 5'-CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' ja tagurpidi, 5'-TCACAGGACCACAGATCCATAA-3'; ja GAPDH edasi, 5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' ja tagurpidi, 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

Statistiline analüüs.

Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve. Rühmade statistilised võrdlused viidi läbi Kruskal-Wallise testi või kahesuunalise ANOVA abil koos Tukey post hoc testiga mitme võrdluse jaoks. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Tulemused

ECH indutseerib NO tootmist ja eNOS-i fosforüülimist.

Nagu on näidatud joonistel 2A ja B, suurendas 1 uM ECH oluliselt rakusisest NO tootmist HUVEC-des võrreldes negatiivsete kontrollrakkudega, samas kui ECH stimuleeriv toime nõrgenes L-NAME-ga eeltöötlemisel kontrolltasemeni. Optimaalse kontsentratsiooni saamiseks testiti eNOS-i fosforüülimist 60 min pärast töötlemist ECH-ga kontsentratsioonidel 0, 0.{11}}1, 0. 1, 1 ja 10 uM. Tulemused näitasid, et ECH kontsentratsioonidel 0,01–10 µM võib kontsentratsioonist sõltuval viisil oluliselt indutseerida eNOS-i fosforüülimist Ser 1177 juures, kusjuures maksimaalset eNOS-i fosforüülimist täheldati 10 µM ECH induktsiooni juures (joonis 2C ja D). Lisaks uuriti eNOS-i fosforüülimist Ser1177 juures Western blot analüüsiga 0, 5, 15, 30, 60 ja 120 minutit pärast inkubeerimist 1 uM ECH-ga. Täheldati, et ECH käivitas eNOS-i fosforüülimise kiiresti 5 minuti pärast ja see suurenes kuni 30-minutise inkubatsioonini (joonis 2E ja F). Seejärel jäi eNOS-i fosforüülimise suhteline ulatus vaatamata ECH-ravile stabiilseks alates 30 minutist; seetõttu ei mõjutanud ECH kogu eNOS-i ekspressiooni (joonis 2C ja E).

AR vahendab ECH-indutseeritud NO tootmist ja eNOS-i fosforüülimist.

RT-qPCR test näitas, et AR-siRNA-1 ja ER -siRNA-2 segavad mõjud olid käesolevas uuringus kõige edukamad AR-i ja ER-i ekspressiooni pärssimisel HUVEC-ides (joonis 3). ). Seejärel kasutati AR-i funktsioonide inhibeerimise analüüsi antagonisti ja AR-funktsiooni kadumise analüüsi jaoks siRNA-d, et hinnata AR-i osalust ECH-indutseeritud eNOS-i aktiveerimises ja NO tootmises. Nagu on näidatud joonisel 4A, suurendas 1 uM ECH oluliselt NO tootmist HUVEC-ides (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktiveerib PI3K/Akt raja.

Käesolevas uuringus testiti Akt fosforüülimist Ser473 juures 60 min pärast ECH inkubeerimist kontsentratsioonidel 0, 0.01, 0.1 , 1 ja 10 uM. Tulemused näitasid, et ECH (0.{10}} µM) võib märkimisväärselt indutseerida Akt fosforüülimist. P-Akt suhtelised ekspressioonitasemed saavutasid haripunkti 1 ja 10 uM ECH-ravi juures (joonised 5A ja B). Lisaks uuriti Akt fosforüülimist Western blot analüüsiga 0, 5, 15, 30, 60 ja 120 minutit pärast 1 uM ECH lisamist HUVEC kultuuridele. Nagu on näidatud joonistel 5C ja D, suurendas ECH pärast 5-minutilist inkubeerimist kiiresti Akt fosforüülimist ja p-Akt maksimaalset valgu taset täheldati 60 minuti pärast. Seevastu ECH ei mõjutanud kogu Akt ekspressiooni (joonised 5A ja C). Veelgi enam, et uurida PI3K raja võimalikku mõju eNOS-i fosforüülimisele, töödeldi HUVEC-e enne ECH pealekandmist PI3K inhibiitori wortmanniiniga. Leiti, et Wortmannin vähendab ECH-indutseeritud NO tootmist algtasemeni (joonis 5E). Sarnast nähtust täheldati fluorestsentsmikroskoopiat kasutades, kui uuriti ECH-indutseeritud DAF-FM fluorestsentsi (joonis 5F). Lisaks võib wortmanniinil olla võime kaotada HUVEC-ides kiire eNOS-i fosforüülimine (joonis 5G ja H). Eespool nimetatud tulemused viitavad sellele, et ECH võib aktiveerida eNOS-i fosforüülimist ja NO tootmist PI3K / Akt raja kaudu.

Arutelu

ECH on Herbast eraldatud looduslik ühendCistanche, millel on erinevad farmakoloogilised omadused. Varem on näidatud, et ECH avaldas endoteelist sõltuvat veresoonte lõdvestavat toimet, avades veresoonte silelihasrakkudes NO-cGMP-PKG-BKC-kanalid (7, 8). Praegused leiud annavad tõendeid selle kohta, et ECH avaldas eNOS-i AR-sõltuvat aktiveerimist, et kutsuda esile NO tootmine, kaasates PI3K / Akt signaaliraja veresoontesendoteelirakud.

Veresoonte seina sisemise kihina suudab endoteel kiiresti tajuda ja reageerida muutustele verevoolus, mille tulemuseks on omakorda signaali edastamine aluseks olevatele silelihasrakkudele, et reguleerida veresoonte toonust (18). On laialdaselt teatatud, et on olemas mitmeid endoteeli päritolu vasodilateerivaid ühendeid, millel on kõige prototüüpsem aine

on NO, mis moodustub eNOS-i endoteeli isovormist, mille tulemuseks on fosforüülimine (19). Tavatingimustes jääb eNOS passiivseks, kui see on seotud caveoliiniga, ja aktiveeritakse järgmiste sündmustegaendoteelirakud: i) eNOS dissotsieerub caveoliinist-1 ja seostub Ca2 pluss /CaM-ga; ii) kuumašoki valk (HSP)90 soodustab eNOS-i.

Lisaks on üha rohkem uuringuid näidanud, et AR-i väljendatakseendoteelirakudpaljudes inimkudedes, mis viitab androgeenide ja nende analoogide potentsiaalsele rollile, mis toimivad AR-vahendatud protsesside kaudu inimese endoteelirakkude homöostaasi moduleerimisel (21). Mitteklassikalise PI3K/Akt raja korral võib AR aktiveerida PI3K, suheldes vahetult PI3K regulatoorse alaühikuga p85 (22). Käesolev uuring näitas, et AR antagonist või AR siRNA vähendas HUVEC-ides ECH poolt indutseeritud NO tootmist ja eNOS-i fosforüülimist. Varem on teatatud, et östrogeenid indutseerivad eNOS-i fosforüülimist ja stimuleerivad NO tootmist klassikalise ER-i aktiveerimise kaudu endoteelirakkudes (23) ning ECH manustamine suurendab oluliselt ER-i ekspressiooni emakas (24). Kuid käesolevas uuringus oli AR-i mõju ECH-indutseeritud eNOS-i aktiveerimisele ja NO tootmisele silmatorkavam võrreldes ER-i mõjuga. Lisaks täheldati, et ECH põhjustas mõne minuti jooksul ägeda NO tootmise AR-ga seotud eNOS-i aktiveerimise kaudu HUVEC-ides, mis on kooskõlas endoteelirakkude vastuse mittegenoomse olemusega. AR on tsütoplasmas seotud karkassvalkudega, sealhulgas HSP90, HSP70 ja kinaas Src, ning seda saab transportida AR-kompleksist membraanile 5 minuti jooksul pärast testosterooniravi (23). "Sihtpüügi" strateegia põhjal tuvastati HSP90 kui PhG-dega seotud sihtmärk, mis näitas, et ECH võib hõlbustada AR-i dissotsiatsiooni tellingute valkudest (25). Teine uuring näitas, et hüpotalamuses võib ECH ühineda AR-taskuga aminohapete Met-894 ja Val-713 juures ning pärssida tsütoplasmaatilise AR-i transporti tuuma (26). Siiski vajab edasist uurimist alusmehhanism, mille kaudu ECH vahendab tsütoplasmaatilist AR-i translokatsiooni membraanile. Seetõttu on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada välja mehhanism, mille kaudu ECH saavutab AR-sõltuva eNOS-i aktiveerimise ja kuidas seda võib seostada HSP90-ga seondumisega veresoonte endoteelirakkudes.

PI3K/Akt rada on üks olulisemaid signalisatsioonikaskaade, mille aktiveerimise indutseerib fosfatidüülinositool-3,4,5-trifosfaat, mis seob Ser/-i N-terminaalse pleckstriini homoloogia domeeni. Thr kinaas Akt. See hõlbustab Akt värbamist plasmamembraanile (27). PI3K / Akt rada võib mängida olulist rolli ECH poolt indutseeritud NO-sõltuva lõõgastuse kontrollimisel. Käesolev uuring näitas, et ECH-indutseeritud NO tootmine vähenes oluliselt, kui rakke inkubeeriti PI3K inhibiitori wortmanniiniga. Eelmine aruanne näitas, et 15 mg/kg ECH aktiveeris PI3K/Akt signaaliraja 5-fluorouratsiili supresseeritud luuüdi rakkudes (28). Käesolevas uuringus vähendasid PI3K inhibiitorid märkimisväärselt ECH-indutseeritud eNOS-i fosforüülimist Ser1177 juures. Veelgi enam, Akt aktiivsust reguleerisid valdavalt ülesvoolu reguleerivad rajad, eriti PI3K-sõltuv fosforüülimine Ser473 juures (20). Käesolevas uuringus indutseeris ECH annusest sõltuval viisil Ser473 juures Akt fosforüülimise; samamoodi näitas eelmine uuring, et 5, 10 või 20 µM ECH avaldas annusest sõltuval viisil kardioprotektiivset toimet anoksia/reperfusiooniravi vastu, suurendades potentsiaalselt p-Akt ja SLC8A3 (29). Akt geeni transkriptsiooniline regulatsioon jääb suures osas teadmata (30); seetõttu keskendus käesolev uuring ECH transkriptsioonijärgsele regulatiivsele mõjule Akt-le. Võttes arvesse ülalnimetatud leide, järeldati, et ECH rakendamine HUVEC-idele võib viia PI3K / Akt raja aktiveerimiseni, mis fosforüülib eNOS-i ja suurendab seejärel NO tootmist.

Kokkuvõtteks võib öelda, et ECH on looduslik toode, mis on peamiselt isoleeritudHerba Cistanche. Võimalik mehhanism, mis on aluseks ECH-indutseeritud NO tootmiseleendoteelirakudvõib sisaldada järgmist (joonis 6): i) ECH toimib AR funktsionaalse ligandina, mis paikneb rakumembraani koobastes; ii) PI3K seondub Ser473 juures oleva Akt hüdrofoobse domeeniga ja hõlbustab Akt värbamist rakumembraanile; iii) PI3K/Akt kaskaadide värbamine käivitab AR-sõltuva eNOS-i fosforüülimise ja iv) NO teket vahendab eNOSendoteelirakud. Tähelepanu, et ECH indutseerib NO tootmist eNOS-i AR-sõltuva fosforüülimise kaudu PI3K / Akt raja kaasamisega, võib aidata kaasa ECH vasorelaksantsete mõjude edasisele mõistmisele. Lisaks võib endoteelist pärinevatele NO radadele suunatud ECH olla tingitud mittegenoomilistest mõjudest. Seetõttu võib käesolev uuring aidata selgitada mehhanisme, mille kaudu ECH avaldab oma farmakoloogilist toimet südame-veresoonkonna haiguste ennetamiseks.

Autor:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU ja XIN LIU

Riikliku Haridusministeeriumi Toidu- ja Tervishoiu Tehnikauuringute Keskus, Maaülikool,

Sun Yat-seni ülikool, Guangzhou, Guangdong 510275, PR Hiina

Saabunud 1. mail 2019; Vastu võetud 10. detsembril 2019

Viited

1. Hiina farmakopöa komisjon:Cistanche Herba. In: Pharmacopoeia of the People's Republic of China 1. chin. Med. Sci. Press, Peking, lk 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X ja Zhang X:ehhinakosiidjaCistanche tubulosa(Schenk) R. wight leevendab bisfenool A-indutseeritud munandite ja sperma kahjustusi rottidel sugunäärmetelje reguleeritud steroidogeensete ensüümide kaudu. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B ja Ma X:ehhinakosiid, hindamatu loodustoode neuroloogiliste ja muude häirete ravis. Molekulid 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S ja Muraoka O: fenüületanoidaminoglükosiidid ja atsüülitud oligosuhkrud, millel on vasorelaksantne toimeCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S ja Murad F: lämmastikoksiid aktiveerib guanülaattsüklaasi ja suurendab guanosiini 3':5'-tsüklilise monofosfaadi taset erinevates koepreparaatides. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wren TN, Lu dX, Zhou Y ja Ge RL: proliferatsioonivastane toimeehhinakosiidroti kopsuarteri silelihasrakkudel hüpoksia all. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ ja Tu PF:ehhinakosiidkutsub NO-cGMP raja kaudu esile endoteelist sõltuva lõõgastuse roti aordirõngastes. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y ja Ge RL:ehhinakosiidkutsub esile roti kopsuarteri vasorelaksatsiooni, avades NO-cGMP-PKG-BKca kanalid ja vähendades intratsellulaarset ca^{2 pluss}tasemed. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y ja Higashi Y: Endoteelist sõltumatu vasodilatatsiooni hindamine: metoodikast kliiniliste perspektiivideni. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J ja ding Q: uudse sünteetilise elemendi derivaadi kaitsvad mõjud inimese nabaveenileendoteelirakudoksüdatiivsest stressist põhjustatud vigastuste vastu: antioksüdatsiooni ja PI3k / Akt / eNOS / NO signaaliradade kaasamine. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y ja Okabe T: Src kinaasi poolt vahendatud androgeeni retseptorist sõltuv signaaliülekandekaskaadi mittegenoomne aktiveerimine, mis viib endoteeli lämmastikoksiidi süntaasini . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y ja Okabe T: endoteeli lämmastikoksiidi süntaasi androgeeni retseptorist sõltuv aktiveerimine veresoontesendoteelirakud: Fosfatidüülinositooli 3-kinaasi/Akt raja roll. Endokrinoloogia 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F ja Reno F: NO-sõltuv proliferatsioon ja migratsioon, mis on põhjustatud d-vitamiinist HUVEc-s. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X ja Xu X: lahtiühendava valgu 2 üleekspressioon inhibeerib inimese nabaveeni kõrge glükoosisisaldusega indutseeritud apoptoosiendoteelirakud. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z ja Bing S: Icariin lükkab homotsüsteiinist põhjustatudendoteeli rakulinevananemine, mis hõlmab PI3K / AKT-eNOS signaaliraja aktiveerimist. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ ja Klenk dc: valgu mõõtmine, kasutades bitsinhoniinhapet. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H ja Liu X: Triterpenoidide biosüntees ja lämmastikoksiidi poolt esile kutsutud transkriptsioonivastus sukeldatud käärivas Ganoderma lucidum'is.Protsess Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY ja Gutterman dd: Endoteeli päritolu hüperpolarisatsioon ja koronaarne vasodilatatsioon: epoksüeikosatrieenhapete, vesinikperoksiidi ja vaheühenduste mitmekesised ja integreeritud rollid. Mikrotsirkulatsioon 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK ja Gutterman dd: kommunikatsioon on võtmetähtsusega: rakkudevahelise signaaliülekande mehhanismid vasodilatatsiooni korral. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, B-st ja arutelust R: Endoteeli mikrokeskkonna tuvastamine, mis viib lämmastikoksiidi vahendatud vasodilatatsioonini: närvi- ja biomehaaniliste signaalide ülevaade. Lämmastikoksiid 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS ja Smith GJ: androgeeni retseptor inimeselendoteelirakud. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H ja Gui YT: androgeenide mittegenoomilist toimet vahendab androgeeniretseptorite kiire fosforüülimine ja reguleerimine. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP ja Ghedini Pc: östrogeeni retseptorite poolt vahendatud PI3K/Akt raja aktiveerimine. indutseeritud cGMP signaaliülekande veresoonte aktiveerimine. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z ja Li P: osteoporoosivastane toimeehhinakosiidmunasarjade eemaldatud rottidel. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y ja Tu PF: fenüületanoidglükosiidide farmakoloogiliste sihtmärkide tuvastamine ja tõhususe analüüsCistanchesHerba, mis põhineb sihtpüügi strateegial. lõug Tradit Taimsed ravimid 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM ja Zhang X:ehhinakosiidsuurendab spermatosoidide kogust rottidel, suunates hüpotalamuse androgeeni retseptori. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. Coffer PJ, Jin J ja Woodgett JR: Proteiini kinaas B (c-Akt): fosfatidüülinositooli 3- kinaasi aktiveerimise multifunktsionaalne vahendaja. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y ja Qian J:ehhinakosiidparandab hematopoeetilist funktsiooni 5-FU-indutseeritud müelosupressiooniga hiirtel. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W ja Zhou H: kaitsvad mõjudehhinakosiidanoksia / reperfusioonikahjustuse vastu H9c2 rakkudes p-AKT ja SLc8A3 ülesreguleerimise kaudu. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P ja Su Y: Akt kriitiline roll kardiovaskulaarses funktsioonis. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.