Haiguste modelleerimine neeruorganoididega

Abstraktne:Neeruhaigusedsageli puudub optimaalne ravi, mis põhjustab igal aastal miljoneid surmajuhtumeid. Seega sobivate mudelisüsteemide väljatöötamine, mida uuridainimese neeruhaiguson ülimalt oluline. Mõned kõige lootustandvamad inimese neerumudelid on organoidid või väikesed elundit meenutavad koekollektiivid, mis on saadud inimese poolt indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest (hiPSC). Kuid need on rohkem sarnased esimese trimestrigaloote neerkui täiskasvanud neer. Seetõttu on nende küpsuse edendamiseks vaja uusi strateegiaid. Neil on suur potentsiaal haiguste modelleerimiseks ja lõpuks abiteraapiaks, kui nad jõuavad küpsekstäiskasvanud neer. Selles ülevaates käsitleme neerude organoidide praegust seisundit nende sarnasuse osas inimese neerudega ja siiani kasutamist haiguste modelleerimissüsteemina. Seejärel arutame võimalikke teid selle edendamiseksneerude küpsusorganoidid, mis sobivad täiskasvanu neeruga inimese haiguste täpsemaks modelleerimiseks.

Märksõnad: organoidid;neerud; arendamine; metanefros; kusejuha; tuubul; kiip; nefroloogia; haiguse modelleerimine

KLÕPSA SIIA, ET HANKIDA CISTANCHE KROONI RAVIKS

1. Sissejuhatus

Kuni viimase ajani on inimeste haigusi modelleeritud kahel viisil: loomadega või kahemõõtmelise rakukultuuriga. Loommudelid võimaldavad uurida haiguste teid ja ravimite väljatöötamist tervetes organismides, kuid need ei võta arvesse inimese geneetilist ja anatoomilist ülesehitust. Teisest küljest võimaldab inimese rakukultuur teadlastel uurida inimese spetsiifilisi haigusmehhanisme ja hinnata ravi suure ja täpse molekulaarse sügavusega. Siiski ei võta rakukultuur kokku elundi keerulist kolmemõõtmelist struktuuri ja füsioloogiat.

Inimese organoidid on inimorganite lihtsustatud versioonid, millel on realistlik kolmemõõtmeline mikroanatoomia ja elunditasandi funktsioonid (nt pisarate teke lakteaalorganoidides ja karvakasv naha organoidides) [1,2]. Iseorganiseerumisprotsesside kaudu saadakse need in vitro koerakkudest või pluripotentsetest tüvirakkudest. Takahashi ja Yamanaka 2008. aastal leiutatud indutseeritud pluripotentsed tüvirakud (iPSC-d) on organoidide moodustamiseks kõige populaarsemad rakud [3]. See on tingitud mitmetest kaalukatest eelistest, mida iPSC-d pakuvad. Esiteks pakuvad need piiramatut taastuvat rakuallikat ja võivad erineda mitmeks rakutüübiks. Veelgi olulisem on see, et need esindavad patsientide geneetilist koostist. Seega võib patsiendilt saadud inimese iPSC-sid (hiPSC-sid) kasutada haiguste uurimiseks organoidide kaudu individuaalsel tasandil, mis võimaldab isikupärastatud meditsiinis edusamme teha. Praeguseks on haiguste uurimiseks kasutatud erinevate inimorganite, näiteks südame ja aju organoidmudeleid. Selle ülevaate jaoks keskendume neerude organoididele ja arutame, kuidas neid saab kasutada inimese neerude ja sellega seotud haiguste modelleerimiseks, ravimite toksilisuse skriinimiseks ja võib-olla neerufunktsiooni täiendamiseks.

Neeruhaigus mõjutab 10% maailma elanikkonnast [4]. Hoolimata paljude neeruhaiguste vormide geneetilise põhjuse tuvastamisest, ei ole nende raviks optimaalseid ravimeetodeid. See kahetsusväärne olukord peegeldab in vitro mudelisüsteemide puudumist, mis koondaksid inimese neeruhaiguse sihipäraseks terapeutiliseks arendamiseks. Neeruorganoidid pakuvad inimesepõhist isikupärastatavat 3-D-uuringute platvormi geneetiliste neeruhaiguste, neerukahjustuste ja ravimite toksilisuse uurimiseks. Lisaks oma võimele toimida modelleerimissüsteemina on neeruorganoidil potentsiaal edendada siirdamismeditsiini. Seega, et maksimeerida oma potentsiaali mõlemas valdkonnas, peab neeruorganoid sarnanema täiskasvanud inimese neeru struktuuri ja funktsioonidega. Siin vaatleme pluripotentse rakust pärineva inimese neeruorganoidi hetkeseisu, selle võimalikke kasutusviise ja parendusvaldkondi.

2. Inimese neer vs. neeruorganoidid

HiPSC-d toimivad embrüonaalsete PSC-de puhverserveritena. Seega hõlmab hiPSC-dest neeru organoidi moodustamine inimese embrüonaalse neeru arengu replikatsiooni. Allpool uurime, kuidas neeru organoid areneb, ja võrdleme seda inimese neeruga.

2.1. Inimese neerude areng

Embrüonaalse arengu jooksul filtreeritakse verd kolmes erinevas faasis. Esimeses faasis areneb 4-nädala vanuses inimese embrüos pronefros-nimeline struktuur ja töötleb verd emakakaela piirkonnas kuni umbes 5. nädalani [5]. Järgmisena moodustub mesonefros embrüo rindkere piirkonnas ja filtreerib verd alates 5. nädala algusest kuni umbes 10. nädalani embrüo arengust. Sel ajal, kui mesonefros filtreerib verd, saab lõplikuks filtreerimissüsteemiks, millest lõpuks saabtäiskasvanud neer, hakkab moodustuma (joonis 1). See moodustub kahes järgmises osas: metanefriline mesenhüüm ja kusejuha pung. Metanefriline mesenhüüm moodustab kõik nefroni osad, välja arvatud kogumisjuha, samas kui kusejuha moodustab kogumiskanali. Need struktuurid läbivad vastastikuse induktsioonitsükli, kus metanefriline mesenhüüm ja kusejuha pungad stimuleerivad üksteise kasvu ja sulanduvad, moodustades struktuuri, mida nimetatakse metanefrosiks. Äsja moodustunud metanefroi filtreerib verd niude okstest alla vaagnapiirkonda. Samal ajal hargneb kusejuha pung ja jätkab hargnemist, moodustades neerus palju kogumiskanaleid [6,7]. Seejärel tõusevad need sulanud metanefrilised struktuurid embrüo arenedes kõhupiirkonda ja loovad verevarustust primitiivsest aordist. Need protsessid on kokku võetud joonisel 1. Oluline on märkida, et metanefrilised mesenhüümi- ja kusejuhade rakud on primitiivsed ja säilitavad seega multipotentse potentsiaali, samas kui täiskasvanud diferentseerunud neerurakud on pühendunud oma konkreetsele liinile [8].

Joonis 1. Inimese kuseteede areng 4. kuni 9. nädalani emakas.

2.2. Protokollid neeruorganoidide genereerimiseks

Neeru organoidid võivad moodustuda kudedest pärinevatest diferentseerunud rakkudest või pluripotentsetest tüvirakkudest. Neeru organoidi arendamiseks kudedest pärinevatest rakkudest võib diferentseerunud täiskasvanud rakud paigutada kolmemõõtmelisse ruumi ex vivo, et jäljendada inimese elundi arhitektuuri [9]. Kudest pärinevate diferentseeritud rakkude organoidprotokolle on käsitletud mujal. Selles ülevaates keskendume tüvirakkudest pärinevatele neeruorganoididele. Nende süsteemide loomiseks võivad teadlased kultiveerida pluripotentseid tüvirakke neeruspetsiifiliste endogeensete morfogeenide ja rakuväliste komponentide juuresolekul. Tüvirakud võivad seejärel ise koguneda neerutaolisteks struktuurideks, jäljendades embrüonaalse neeru arengut. Elundid, nagu sool, sisaldavad endogeenseid tüvirakkude populatsioone täiskasvanud kudedes, mille abil teadlased võivad luua organoide [10]. Kuna aga puuduvad selged tõendid selle kohta, et täiskasvanud inimese neer sisaldab tüvirakkude nišši, tuleb tüvirakkudest pärinevad neeruorganoidid valmistada pluripotentsetest tüvirakkudest (kas embrüonaalsetest või hiPSC-st) [11].

Tüvirakkudest pärinevad neeruorganoidid võib liigitada kahte kategooriasse: nefroni eellasorganoidid (NP) ja ureteri pungade (UB) organoidid. Mõlemat tüüpi organoidid on haiguste mudelitena hästi välja kujunenud. NP organoidid sarnanevad metanefrilise mesenhüümiga, mis sisaldab multipotentseid NP-rakke. Tegelikult võib üks metanefriline mesenhümaalne rakk tekitada kõik nefroni epiteelirakud, välja arvatud kogumiskanal [8]. HiPSC-st pärinevate NP-organoidide genereerimise metoodika hõlmab 2D-kultuuri koos järgneva agregatsiooniga poorsel transwell-plaadil (nt Takasato jt (2016), Morizane jt (2015)) või 3D-kultuuri hüdrogeelis (nt Freedman et al. (2015)) [12–14]. Need organoidid arendavad glomerulaarseid ja torukujulisi struktuure. Takasato ja Morizane'i kahest kõige populaarsemast NP-protokollist tuletatud NP-organoide võrreldi Wu jt ulatuslikus omikaanalüüsis. (2018) [15]. Nad leidsid, et kui Takasato protokoll genereerib umbes 11% podotsüütide-sarnaseid rakke ja 21% sihtmärk-väliseid rakke ühe organoidi kohta, siis Morizani protokoll genereerib umbes 28,5% podotsüütide-sarnaseid rakke ja 14,3% sihtmärk-väliseid rakke [15]. Takasato organoidid näivad arendavat ka väikeses koguses UB-sarnaseid piirkondi, kuid jäljendavad valdavalt metanefrilist mesenhüümi, klassifitseerides need seega NP organoidideks [12]. Lisaks Morizane et al. (2015) ja Takasato jt. (2016) protokollides puudub rakuväline hüdrogeeli keskkond, mis on olemas Freedmani jt (2015) töös [14]. Garreta et al. (2019) väidavad, et hüdrogeeli olemasolu organoidide moodustumisel parandab neerude struktuuri moodustumist ja suurendab varajaste IM-markerite, tagumiste IM-markerite ja eesmiste IM-markerite tootmist [16].

Erinevalt NP organoididest imiteerivad UB organoidid kusejuha, mis tekitab kogumiskanalite süsteemi. Hiljuti on välja töötatud UB organoidide genereerimise meetodid, mis hõlmavad embrüoidkehade kultiveerimist ja sellele järgnevat agregeerimist vähekleepuvatesse süvenditesse [17]. Nendel organoididel on torukujulised ja kogumiskanalid. Lõpuks on NP ja UB organoidid kombineeritud ka kõrgema järgu ühiskultuuri struktuuride loomiseks täiskasvanud inimese kokkuvõtmiseks.neeru fenotüübid[17]. Kõige populaarsemad protokollidneeru organoidmoodustamine on kokku võetud alloleval joonisel 2 [12–14,17–19].

Joonis 2. Kõige populaarsemate organoidide moodustumise protokollide kokkuvõte

2.3. Kuidas need kuhjuvad: neeruorganoidid vs. inimese neerud

Ülalkirjeldatud protokollid hõlmavad peamiselt hiPSC-de isemonteerimist organoidideks. Nad jäljendavad loote tingimusi, et indutseerida hiPSC-sid diferentseeruma neeruspetsiifilisteks liinideks ja moodustama neeruspetsiifilisi struktuure. Esimene loote seisund, mida nad kordavad, on primitiivne vöötsignaal. Primitiivne vööt on embrüo osa, mis areneb enne kolme idukihi eraldumist. Enamik protokolle teeb seda WNT signaali agonisti CHIR abil. Järgmiseks tuleb NP liini tuletamiseks esile kutsuda tagumine-intermediate mesoderm (PIM) ja UB liini puhul anterior-intermediate mesoderm (AIM) [17]. Huvitaval kombel Takasato et al. (2015) leidsid, et mida pikem oli CHIR-i manustamise periood, seda rohkem arenes välja tagumine mesoderm, samas kui mida lühem periood, seda rohkem arenes välja eesmine mesoderm [20]. Seega suurendab WNT signaalimise kestus rohkem glomerulaarset ja proksimaalset struktuuri ning vähenenud WNT signaali kestus põhjustab distaalsema struktuuri teket.

NP-protokolli täitmisel arenevad nii glomerulaarsete kui ka torukujuliste piirkondadega organoidid. Siiski on nad ebaküpsed. Uuringud on näidanud, et hiPSC-st pärinevad neeruorganoidid jäljendavad esimese trimestri loodet [20]. Ühe ulatuslikuma analüüsi sellel teemal viisid läbi Subramanian et al. (2019), kes kasutas RNA-seq-i, et võrrelda neerude organoide 8-nädala, 17-nädala ja täiskasvanud inimese neerudega. Nad jõudsid järeldusele, et neeru organoidid on loote 8. ja 17. nädalal sarnasemad inimese neerudega kui täiskasvanud neerudega [21]. Lisaks näitavad neeru organoidid primitiivsete multipotentsete markerite, nagu SIX2+, värvumist kogu neerus, samas kui täiskasvanu diferentseeritud inimese neer selliseid markereid ei ekspresseeri [22]. Seega, et kasutada neeruorganoidi täiskasvanud inimese neeru asendusnäitajana haiguse uurimiseks, peab see rasedusaeg edasi arenema.

Neeru organoidid ei pruugi mitte ainult paremini jäljendada varajast metanefroosi kui täiskasvanud inimese neer, vaid nad võivad isegi rohkem sarnaneda mesonefrosega kui metanefroosiga, kui morfogeeni kontsentratsioon on valesti reguleeritud [23]. Nende probleemidega tegeledes on Tsujimoto et al. (2020) uurisid in vitro hiPSC diferentseerumist mesonefrilisteks NP-deks, metanefrilisteks NP-deks ja UB-rakkudeks [24]. Selles uuringus tuvastati mitu tegurit, mis eristavad neid kolme põlvnemist ja mida võib seega rakendada nende kolme erineva süsteemi tulevases uuringus [24]. Muud olulised edusammud organoidide küpsemisel hõlmavad NP-UB interaktsioone ja vaskularisatsiooni. Mõned kõige tähelepanuväärsemad uuringud nende probleemide lahendamiseks viisid läbi Taguchi ja Nishinakamura (2017) ning Tsujimoto jt. (2020) [17,24]. Need uuringud genereerisid MM-UB kaaskultuuritud organoidid ja siirdasid need hiirtele, kus need vaskulariseeriti. Nende metanefriliste kõrgema järgu struktuuride loomine täiustas märkimisväärselt tüvirakkudest pärinevat neerustruktuuri sarnasust tegelike inimese neerudega. Kuid isegi need arenenud süsteemid ei suutnud kokku võtta ulatuslikumat UB hargnemist, mis toimub kogu teisel ja viimasel trimestril in vivo [24]. Need leiud rõhutavad vajadust korrata endogeenseid küpseid neerufunktsioone ja interaktsioone, mis praegustel organoididel puuduvad, näiteks vedeliku voolu.

3. Neeruorganoidid mudelisüsteemidena

Neerude organoidide sarnasus inimese neerudega muudab need sobivad haiguste modelleerimiseks ja ravimite sõeluuringuks. Neid võidakse valmistada vähem kui kuuga, isikupärastada ja toota hulgi [12–14, 17–19]. Lisaks võib neid kultiveerida in vitro või siirdada hiirtesse, rottidesse või tibude munadesse, et moodustada terviklikke in vivo mudeleid. Allpool uurime analüüsi, mida võib läbi viia neeruorganoididega, samuti neeruorganoidide praegust ja tulevast kasutust biomeditsiinilistes uuringutes.

3.1. Neeru organoidide analüüs

3.1.1. In vitro analüüsid

Neeru organoididega võib läbi viia mitmesuguseid füsioloogilisi, molekulaarseid ja funktsionaalseid analüüse. Molekulaarsete testide osas on neeruorganoidides edukalt läbi viidud erinevaid transkriptoomilisi analüüse [25]. Näiteks Takasato et al. (2015) ekstraheerisid organoididest RNA ning viisid läbi RNA sekveneerimise ja qRTPCR analüüsid [20].

Teised, nagu Wu et al. (2018) on lisaks DropSeg scRNA sekveneerimisele neeruorganoidides läbi viinud tuumade isoleerimise ja snRNA sekveneerimise. Lisaks RNA tasemetele on immunobloti abil kvantifitseeritud ja võrreldud neeru organoidlüsaadist saadud erinevaid valkude tasemeid (nt Cruz et al., 2017; Morais et al., 2022) [26,27]. Lisaks on spetsiifiliste nefronistruktuuride uurimiseks neeruorganoidides rutiinselt läbi viidud immunotsütokeemia analüüs. Seda tehakse sageli terve organoidvärvimisena; alternatiivselt on sondeerimiseks kasutatud ka koelõike (nt Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20, 26). Need uuringud on näidanud, et neeru organoididel on glomerulid, proksimaalsed tuubulid, distaalsed tuubulid, basaalmembraan ja kogumiskanali paigutus (20,27]). Alloleval joonisel 3 on näide Takasato jt (2016) protokolli abil genereeritud parafiiniga manustatud ja sektsioonidega inimese neeru organoididest (12)Lõige on värvitud glomerulaarse, proksimaalse tuubuli ja distaalse tuubuli jaoks tuubulite markervalgud ja neil on pidevad glomerulaarsed kuni distaalsed tuubulite nefroonilised struktuurid. Lisaks struktuuridele on teadaolevalt ka neeru organoididel veresoonkond. Siiski on see piiratud, kiiresti taanduv ja mitte organiseeritud nagu tüüpilises neerus (28]).

Neeru organoidides võib läbi viia ka mitmeid funktsionaalseid teste. Näiteks nagu on kirjeldanud Freedman et al. (2022), võib neeruorganoidide suhtes rakendada impulsi tagaajamise teste, kus enne uue fluorestseeruva söötmega asendamist võib söötmele lisada erinevaid fluorestseeruvaid molekule [29]. Seejärel võib organoide analüüsida nende molekulide omastamise suhtes ja saadud teavet saab kasutada kogunemise, turse, filtreerimise, endokriinsüsteemi või vigastuste kohta teabe tuletamiseks [29]. Üks selle testiga seotud probleeme organoidplatvormidel on aga see, et molekule võib viia suletud torukujulistesse struktuuridesse väljastpoolt, mitte läbi apikaalse pinna, nagu juhtuks in vivo. Seega võivad flfluorestseeruvad molekulid imenduda väliselt basolateraalselt membraanilt, kuna puudub võimalus kontrollida, kuhu need molekulid võivad jõuda, kui need jämedalt keskkonda sisestatakse. Lisaks saab molekulide transporti piirata difusiooniga organoidides, luues samas organoidis erinevaid akumuleerumissuundumusi.

Lisaks võib neerude paranemist hinnata ka organoidplatvormidel, võimaldades seeläbi saada ülevaadet neerukahjustuse pöördumise mehhanismidest ja geneetilisest alusest, mis võib soodustada patsientide neeruhaigust. Näiteks sellised uuringud nagu Gupta et al. (2022) on uurinud geeniradu, mis olid neeru organoidplatvormidel ühe- või mitmekordsel kokkupuutel tsisplatiiniga, neerukahjustuse molekuliga, ülesreguleeritud [30]. Lõpuks võib tsüstide moodustumist analüüsida organoidides, et uurida polütsüstilist neeruhaigust (PKD) cAMP aktiveerimise kaudu [26]. Seejärel võib tsüstid mõõta, kvantifitseerida ja käsitleda inimese neerutsüstide proksidena.

3.1.2. In vivo analüüs

In vitro neeruorganoidide mudelisüsteemina kasutamise oluline puudus on nende koostoime puudumine ülejäänud organismiga. Paljud tingimused, mis mõjutavad keha kaugemaid osi, võivad mõjutada neerusid ja vastupidi. Näiteks võivad vererõhu muutused drastiliselt muuta glomerulaarrõhku, mida neer saab omakorda reguleerida. Kuid in vitro organoidsüsteemid ei võta neid süsteemseid koostoimeid arvesse. Seega on uuritud siirdamismeetodeid, mis hõlmavad inimeselt saadud neeruorganoide hiirtel, rottidel ja tibude munades. Sellistes uuringutes eristatakse inimese ja looma kudesid inimese tuumaantigeeni immunovärvimise või Y-kromosoomi lugemise joondamise kaudu kombineeritud genoomi viitega [21]. Lisaks saab organoide siirdada karkassi (nt siidi) kaudu, et tagada suurem struktuurne terviklikkus [31]. See lähenemisviis võib võimaldada lihtsamaid organoidkoespetsiifilisi analüüse pärast siirdamist.

Neeruorganoidide siirdamise peamine eelis on see, et see võimaldab organoididel vaskulariseerida, küpseda ja isegi uriini filtreerida. Van den Berg et al. (2018) on näidanud, et pärast subkapsulaarset neerusiirdamist hiirtele küpsevad neeru organoidsed glomerulid ja tuubulid märkimisväärselt [32]. Teises uuringus Subramanian et al. (2019) on näidanud, et hiPSC-st pärinevate organoidide siirdamine hiirtele suurendab proksimaalsete ja distaalsete tuubulite küpsemist ning vähendab sihtmärk-rakupopulatsioonide esinemist organoidis [21]. Veelgi olulisem on see, et pärast siirdamist saavad neeru organoidid täita neeru ülimat funktsiooni, filtreerida verd. Pärast subkutaanset siirdamist hiirtele moodustasid neeruorganoidid uriini filtreerivad struktuurid, mida tõendab FITC-märgistatud dekstraani ülekanne [33]. Seega ei võimalda siirdamine mitte ainult uurida neeruorganoidi mutatsiooni mõjusid in vivo, vaid see parandab ka organoidi sarnasust inimese neeruga ja muudab selle mõneti funktsionaalseks süsteemiks.

Kuigi immuunpuudulikkusega hiiri kasutatakse sageli hiPSC neeru organoidide siirdamiseks, on kasutatud ka teisi peremeesorganisme, näiteks tibu koorioallantoicmembraane (CAM). CAM on loomulikult immuunpuudulikkusega ja soodustab organoidi vaskulariseerimist [16]. Sellel puuduvad aga tüüpilised imetajate organsüsteemid, mistõttu on neerude organoidid erinevalt hiirtest teistest süsteemidest lahti ühendatud. Vaatamata peremeesorganismiga seotud tagasilöökidele võimaldab kimääride genereerimine inimesest pärinevate neeruorganoididega inimese neeruhaiguse ulatuslikku in vivo uurimist väga mõjuval platvormil.

3.2. Seni läbi viidud haiguste modelleerimise uuringud

3.2.1. Neeruorganoidid kui geneetiliste haiguste mudelid

Neeruorganoide on kasutatud tubulaarsete ja glomerulaarsete geneetiliste neeruhaiguste uurimiseks [26,34,35]. Inimestel on kõige silmatorkavamateks tubulaarseteks haigusteks laste polütsüstiline neeruhaigus (PKD), mis tuleneb fibrotsüstilise geeni (PKHD1) autosomaalsetest retsessiivsetest mutatsioonidest, ja täiskasvanute PKD, mis tuleneb polütsüstiini autosomaalsetest domineerivatest mutatsioonidest-1 ja -2 geenid [36–38]. Neid mutatsioone võib kunstlikult sisestada hiPSC-desse geenide redigeerimise tehnoloogiate, näiteks CRISPR-Cas 9 süsteemi abil. Redigeeritud hiPSC-sid võib seejärel kasvatada PKD-d modelleerivateks inimese neeru organoidideks ja analüüsida valgu värvimise ja RNA profiilide koostamise abil. Näiteks Freedman et al. (2015) ja Cruz et al. (2017) on CRISPR/Cas9 süsteemi abil hiPSC liinidest välja löönud polütsüstiini geenid ja seejärel tuletanud organoidid, mis jäljendavad haigetel patsientidel in vivo leitud tsüstilist fenotüüpi [14,26]. Need uuringud näitavad, et neeruorganoide võib kasutada PKD uurimiseks kergesti jälgitavate, haigusega seotud platvormidena. Lisaks võimaldavad patsiendilt saadud rakuliinidest valmistatud organoidid mõista patsiendi spetsiifilisi mutatsioone ja haiguse arengu tõenäosust. Näiteks Low et al. (2019) töötasid välja neeruorganoidid, mis on saadud PKHD1 mutatsioonidega patsientidelt, ja võrdlesid neid metsiktüüpi organoididega [39]. Haigestunud organoididel tekkis oluliselt rohkem tsüstide moodustumist, näidates seega neeruorganoidide potentsiaali ennustada haiguse ilminguid genotüübi põhjal [39]. Teises uuringus on Hernandez et al. (2021) tuletasid hiPSC-d patsientidelt, kellel on mutatsioonid tuberoosskleroosi kompleksi -2 geenis, mis muudab patsiendi neerukasvajate tekkeks kalduvaks [40]. Seejärel parandasid nad patsiendi mutatsiooni CRISPR / Cas9 süsteemiga. Nende korrigeeritud isogeensete mutantsete liinide neeruorganoididel oli haigete organoididega võrreldes vähenenud tsüstide moodustumine ja taastatud geenirajad, näidates seega neeruorganoidide kasulikkust spetsiifiliste mutatsioonide allavoolu funktsionaalsete mõjude uurimisel isogeensetes organitaolistes süsteemides.

Teadlased on kasutanud ka patsientidest saadud organoide, et saada ülevaade glomerulit mõjutavatest geneetilistest haigustest. Näiteks Hale et al. (2018) keskendus NPHS1 (nefriini) geenile, mis mutatsiooni korral kutsub esile vigase podotsüütide jala protsessi moodustumise ja lekkiva uriini filtreerimise, mille tulemuseks on neeruhaigus [34]. Hale et al. (2018) kasutasid patsiendilt saadud mutantseid NPHS1 hiPSC-sid, et tuletada neeruorganoidid, mis modelleerisid neid vigaseid podotsüütide jalaprotsesse, sealhulgas podotsüütide-spetsiifiliste valkude, nefriini ja podotsiini taseme langust [34]. Samuti Freedman et al. (2015) lõi hiPSC-des välja glomerulaarse geeni PODXL ja leidis, et organoididel on vigane podotsüütide-podotsüüdi arhitektuur [14].

Neeruorganoidide üks suuresti kasutamata potentsiaal on nende võime modelleerida embrüonaalseid ja loote defekte. Praegu püüavad teadlased täiskasvanud inimese neeru modelleerida neeru organoidiga. Kuid praeguses esimese ja teise trimestri seisundis võib neeruorganoidi kasutada neerude arenguhäirete uurimiseks [41]. Kuseteede arenguhäired, nagu neerudüsplaasia, on ühed kõige levinumad ja raskemad arenguhäired [42]. Kuna paljusid neist haigustest võib avastada juba 11 nädala pärast, sobivad neeruorganoidid eriti hästi kaasasündinud neerupuude uurimiseks. Meie käsutuses on mitte ainult metanefrilised esimese ja teise trimestri neeruorganoidid, vaid meil on ka primitiivsed mesonefrilised neerurakuliinid (nt Tsujimoto et al., 2020), et uurida embrüonaalseid ja loote defekte [24]. Kuna vähesed süsteemid võimaldavad uurida ja manipuleerida areneva inimese neeruga, võimaldab neeru organoid tohutut potentsiaali loote geneetilisteks, toksikoloogilisteks ja arenguuuringuteks.

3.2.2. Neeruorganoidid muude haiguste mudelitena

Lisaks geneetilisele haigusele on neeruorganoide kasutatud inimese süsteemide reaktsiooni uurimiseks viirusinfektsioonile, vähile ja vigastustele. Näiteks Jansen et al. (2021) kasutasid neeru organoidplatvormi, et hinnata viirusliku SARS-CoV-2 mõju inimese neerudele [43]. See rühm avastas, et SARS-CoV{5}} nakkus suurendab kollageeni I ekspressiooni inimese neeru organoidides, andes seega mehaanilise seletuse neerukahjustuse ja fibroosi kohta, mis sageli kaasnevad raskete pikaajaliste COVID-i juhtudega-19 [ 43]. Vähiuuringute osas Hernandez et al. (2021) siirdasid immuunpuudulikkusega rottidele neeruorganoide, et modelleerida haruldasi geneetiliselt mõjutatud neerukasvajaid. Siin tekkisid patsiendilt saadud organoididel kasvajataolised kahjustused, mis koondasid kokku inimese neerukasvajad [40]. Lisaks kasutasid nad neeruorganoididel põhinevaid kasvajamudeleid poolfunktsionaalsete inimtekkeliste struktuuridena ning testisid ravimeid ja nanoosakestel põhinevaid ravimeetodeid. Lõpuks on hiljutised uuringud näidanud, et neeru organoide võib kasutada neerukahjustuse vastuse testimiseks. Näiteks Prezpiorski et al. (2022) näitasid, et neeru organoidid tekitavad oksüdatiivse kahjustuse markereid ja suurendavad vigastuse markerite ekspressiooni, manustades neeruorganoididele vigastusmolekuli hemiini koos biosensoriga [44].

3.2.3. Neeruorganoidid ravimite hindamisel

Lisaks haigustest ülevaate andmisele on neeruorganoide kasutatud ravimite sõelumiseks. Eelkõige on neeruorganoide kasutatud ravimitest põhjustatud neerukahjustuse (DIKI) uurimiseks, mis on ägeda neerukahjustuse peamine põhjus [45]. Tsisplatiini kõrvaltoimete hindamisel on Czerniecki et al. (2018) näitasid, et neeruorganoidid on kasulikud suure läbilaskevõimega mudelitena uute ravimite uurimisel inimgeneetika erinevates valdkondades [46].

Teised, nagu Wu et al. (2018) on lisaks DropSeg scRNA sekveneerimisele neeruorganoidides läbi viinud tuumade isoleerimise ja snRNA sekveneerimise. Lisaks RNA tasemetele on immunobloti abil kvantifitseeritud ja võrreldud neeru organoidlüsaadist saadud erinevaid valkude tasemeid (nt Cruz et al., 2017; Morais et al., 2022) [26,27]. Lisaks on spetsiifiliste nefronistruktuuride uurimiseks neeruorganoidides rutiinselt läbi viidud immunotsütokeemia analüüs. Seda tehakse sageli terve organoidvärvimisena; alternatiivselt on sondeerimiseks kasutatud ka koelõike (nt Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20, 26). Need uuringud on näidanud, et neeru organoididel on glomerulid, proksimaalsed tuubulid, distaalsed tuubulid, basaalmembraan ja kogumiskanali paigutus (20,27]). Alloleval joonisel 3 on näide Takasato jt (2016) protokolli abil genereeritud parafiiniga manustatud ja sektsioonidega inimese neeru organoididest (12)Lõige on värvitud glomerulaarse, proksimaalse tuubuli ja distaalse tuubuli jaoks tuubulite markervalgud ja sellel on pidevad glomerulaarsed kuni distaalsed tuubulite nefroonilised struktuurid. Lisaks struktuuridele on teadaolevalt ka neeru organoididel veresoonkond, kuid see on piiratud, taandub kiiresti ega ole organiseeritud nagu tüüpilises neerus (28]).

Joonis 4. Kokkuvõte viisidest, kuidas neeruorganoide saab haiguse modelleerimiseks kasutada. Kokkuvõte viisidest, kuidas neeruorganoide saab kasutada di modelleerimiseks