Sphingolipiid metaboliseerivate ensüümide diferentsiaalne ekspressioon spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel: võimalik substraat vastuvõtlikkuseks aju- ja neerukahjustustele
Feb 24, 2022
Abstraktne: Muutused sphingolipiidide ainevahetuses, bioloogiliselt aktiivsete molekulide klass rakumembraanides, millel on otsene mõju vaskulaarsele homöostaasile, tunnistatakse üha enam oluliseks määrajaks erinevates vaskulaarsetes häiretes. Siiski ei ole selge, kas sphingolipids on seotud hüpertensiooniga seotud tserebrovaskulaarse janeerukahjustused. Selles uuringus hindasime võimalike kõrvalekallete olemasolu, mis on seotud sphingolipid ainevahetusega ajus jaNeerkahest hästi valideeritud spontaanselt hüpertensiivse roti tüvest, insuldile kalduvast (SHRSP) ja insuldikindlast (SHRSR) mudelist, võrreldes normotensiivse Wistar Kyoto (WKY) roti tüvega. Meie tulemused näitasid ülemaailmset muutust sphingolipiidide ainevahetuses nii ajus kui kaNeeru mõlema hüpertensiivse tüve koed võrreldes normotensiivse rotiga. Siiski tuvastati shrsp-s ainult mõned defektid, näiteks sphingosine-1-fosfaadi ainevahetuses/katabolismis ja de novo biosünteetilistes radades osalevate ensüümide vähenenud ekspressioon. Kuigi nende leidude tähtsuse täielikuks mõistmiseks on vaja täiendavaid uuringuid, viitavad need sellele, et spetsiifiliste lipiidide molekulide ja / või nendega seotud metaboolsete radade defektid võivad tõenäoliselt kaasa aidata hüpertensiivse sihtorgani kahjustuse patogeneesile ja võivad lõpuks olla tulevased terapeutilised sihtmärgid hüpertensiooni vaskulaarsete tagajärgede vähendamiseks.
Märksõnad:sphingolipids; insult; aju; neer; SHR; WKY
SissejuhatusHüpertensioon on suur terviseprobleem, mis põhjustab spetsiifilisi elundikahjustusi ja dramaatilisi kliinilisi tagajärgi, mis toob kaasa surma ja puude suurenemise Lääne ühiskondades [1–3]. Hüpertensiivsete tüsistuste koormuse vähendamiseks on vaja põhjalikumat arusaamist aluseks olevatest etiopatogeneetilistest mehhanismidest. Loomamudelite kättesaadavus, mis võivad inimese patoloogiat tihedalt jäljendada ja samal ajal lihtsustada inimpopulatsioonide uurimise keerukust, võib selles võistluses olla äärmiselt kasulik. Praegu insult-kalduvus spontaanselt hüpertensiivne rott (SHRSP), mis näitab suurt eelsoodumust aju janeerukahjustused, eriti kui toidetakse kõrge soola / madala kaaliumisisaldusega dieediga, on ideaalne mudel. Hüpertensioon ja toitumistegurid käituvad nii rottide kui ka inimeste jaoks soodustavate riskiteguritena [4,5]. SHRSP näitab jaapani stiilis dieediga (JD) toidetud insuldi kõrgemat sagedust kui selle rangelt seotud kontroll, insuldikindel (SHRSR), hoolimata sarnasest vererõhu tasemest [6]. Pange tähele, etneerukahjustused alati eelneb insuldi sündmustele [6]. Kuigi aluseks olevaid molekulaarseid mehhanisme ei mõisteta täielikult, näitavad tõendid, et sellest tulenev vaskulaarne düsfunktsioon ja sellest tulenevad struktuursed kahjustused soodustavadneerukahjustusedja insuldi areng.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Viimastel aastatel on mõned tserebrovaskulaarsete janeerukahjustusedshrsp mudelis [7–12] on tuvastatud esinemine. Siiski on veel palju avastada. Sphingolipids, sealhulgas Ceramides (Cer), sphingosine ja selle fosforüleeritud vorm Sphingosine-1-fosfaat (S1P), esindavad bioloogiliste membraanide peamisi lipiidide koostisosi ja moduleerivad mitmeid olulisi funktsioone neuronaalsete ja mitteneuroniaalsete rakkude populatsioonide jaoks [13]. Kuid mitte vähem oluline on nende keskne roll veresoonte moodustumisel ja funktsioonil [13–15], samuti vere aju barjääri (BBB) terviklikkuse reguleerimisel tihedate ühendusvalkude modulatsiooni kaudu [16]. Sellega seoses näitavad tõendid, et sphingolipiidide de novo süntees on endoteelirakkude funktsioonide säilitamisel otsustava tähtsusega[17,18], mis tõenäoliselt aitab kaasa veresoonte terviklikkusele ja homöostaasile. On kirjeldatud, et defektne sphingolipiid metabolism on erinevate kardiovaskulaarsete seisundite aluseks [19,20]. Siiski ei ole veel esitatud otseseid tõendeid sphingolipiidide põhjusliku rolli kohta hüpertensiivse sihtorgani kahjustuse patogeneesis. Vaatamata mehhanistlike detailide puudumisele on bioaktiivse lipiidi S1P rada osutunud isheemia ajal neuroprotektiivseks [21,22] ja selle retseptorite stimuleerimine põhjustab kasulikku mõju insuldi loomamudelis [23]. Seega on mõeldav, et insultide ja sphingolipiidide vahel on tihe koostoime. Selles uuringus uurisime aju jaNeerumitmete molekulide ekspressioon, mis on seotud sphingolipid radadega nii SHRSP kui ka SHRSR tüvedes normotensiivse WKY tüve suhtes. Meie leiud rõhutavad esimest korda sphingolipiidide hälbivat ainevahetust kas mõlema hüpertensiivse loomamudeli ajus või neerudes. Oluline on see, et mõned defektid avastati ainult SHSRP tüves. Need tõendid viitavad sellele, et muutused konkreetsetes lipiidide molekulides ja / või nende spetsiifilistes radades võivad potentsiaalselt kaasa aidata hüpertensiooni ja hüpertensiivse sihtorgani kahjustuse patogeneesile.
Tulemused
S1P-metaboliseerivate ensüümide tase on SHRSP-s häiritudEt teha kindlaks, kas shrsp ja SHRSR-tüvedes oli võimalik tuvastada sphingolipid metabolismi võimalikke häireid, uurisime kõigepealt S1P sünteesi ja lagunemise radadega seotud molekulide ekspressiooni (skematiseeritud joonisel 1). Selleks hindasime SPHK1 ja 2 ning SGPL1 taset ajus jaNeerumõlema spontaanselt hüpertensiivse roti koed võrreldes WKY tüvega. Nagu joonisel 2 märgitud, iseloomustas SHRSP rotte SPHK2 ja SGPL1 märkimisväärne vähenemine ajus võrreldes nii WKY kui ka SHRSR-iga. Ei ole vahetNeeruKolme rotitüve hulgas tuvastati kõigi ensüümide ekspressioon.
S1P retseptorite tase on spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel hälbivTõendid näitavad, et S1P retseptorite modulatsioon võib isheemilistes mudelites olla kasulik [23]. Siin, et teha kindlaks, kas nende ekspressiooni muutusi saab lõpuks seostada haiguse fenotüüpidega, hindasime kolme roti tüve kõige rikkalikumate retseptorite S1PR1-3 [24] valgusisaldust. Immunoblotting analüüs näitas kõigi kolme retseptori ekspressiooni varieerumist koest sõltuval viisil. Huvitav on see, et S1PR1 oli ainus retseptor, mille ekspressioon suurenes nii SHRSR-i ajus kui ka neerudes (joonis 3A,3B). Seevastu SHRSP kudede analüüs ei näidanud kõigi retseptorite ekspressiooni varieerumist, välja arvatud S1PR3, mille tase ajus suurenes, sarnaselt SHRSR-is avastatud (joonis 3E) tuvastatud andmetega.
Ceramide Synthases'i ekspressioon on shrsp- ja SHRSR-mudelite mitmes koes defektneVarasemad tõendid näitavad, et keramiidi tase suureneb nii insuldi prekliinilistes mudelites kui ka inimpatsientidel [25–27]. Siin, et hinnata, kas keramiidi ainevahetust võib mõjutada spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel, mille tulemuseks on keramiidi suurenenud tase, uurisime keramiidi süntaaside ekspressiooni, mis on teadaolevalt kõige rikkalikumad ajus (CerS1 ja CerS2) jaNeerud(CerS2 ja CerS4) [28]. Nagu joonisel 4 märgitud, näitas qPCR-analüüs süntaaside ekspressiooni üldist segadust, kusjuures kahe spontaanselt hüpertensiivse tüve vahel oli mõningaid erinevusi. SHRSP näitas CerS1 mRNA suurenenud taset ajus võrreldes WKY või SHRSR-iga (joonis 4A) ja CerS6 taseme vähenemistNeerud, sarnaselt SHRSR-is (joonis 4D) täheldatud näitajaga. Seevastu SHRSR-i iseloomustas CerS2 mRNA vähenenud ekspressioon nii ajus kui ka neerudes (joonis 4B,4C).
SPTLC1 ekspressioon väheneb SHRSP kudedesHiljutised uuringud on osutanud sphingolipiidide de novo biosünteesi võimalikule kaasamisele hüpertensiooni ja vaskulaarsete haiguste korral [29,30]. Et uurida võimalikku seost de novo sphingolipid radade ja insuldi vahel, hindasime SPTLC1 ja 2 valgu ekspressiooni profileerimist, spt kahte alaühikut, kiirust piiravaid ensüüme sphingolipiidide de novo biosünteesis [13] nii ajus kui kaNeeruKudede. Nagu on teatatud joonisel 5A, B, iseloomustas SHRSP rotte SPTLC1 märkimisväärne vähenemine nii ajus kui kaNeerud.Huvitav on see, et SPTCL2 vähenes ka SHRSP ajus võrreldes SHRSR-iga (joonis 5C).
3-keto-dihüdrosfingosiini reduktaasi ekspressioon väheneb nii spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel kui ka spontaanselt hüpertensiivsetel rottidelSphingolipiidide de novo biosünteesi muutust võimendas veelgi ensüümide 3-keto dihüdrosphingosine reduktaas (KDSR) ja keramiidde desaturaasi (DES) analüüs, mis tavaliselt osalevad sphingolipiidide de novo sünteesis [13]. qPCR-analüüs näitas KDSR-i mRNA ekspressioonitaseme olulist vähenemistNeerudnii SHRSP kui ka SHRSR (joonis 6B). Rohkem muudatusi ei täheldatud.
Joonis 2. S1P metaboliseerivate ensüümide ekspressioon on SHRSP ajukoes defektne. SPHK1 (sphingosine kinase 1) (A,B), SPHK2 (sphingosine kinase 2) (C,D) ja SGPL1 (S1P-Lyase) (E,F) esindaja kärbitud immunoblottings ja densitomeetriline analüüs WKY, SHRSP ja SHRSR aju- ja neerukudedes. Igas immunoblottingus viidi kõik proovid läbi samal geelil. Külgnevad proovid eraldatakse musta joonega. Andmed on esitatud keskmise ± SD, n = 6/7 iga rottide rühma kohta. * p< 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" (one-way="" anova,="" tukey="" post-test).="" the="" raw="" date="" for="" generating="" the="" fifigure="" are="" reported="" in="" the="" supplementary="" material="" table="">
Arutelu
Hoolimata põhi- ja kliiniliste teadlaste tohututest teadusuuringutest, hüpertensiivsetest tüsistustest, nagu insult jaNeeruhaigused on endiselt peamised peamised surmapõhjused kogu maailmas [1–3]. Seega on vaja teadmisi alternatiivsete patogeensete radade ja uute ravimite sihtmärkide kohta, et säilitada tserebrovaskulaarsed ja neerud. Sphingolipiidide ainevahetuse uurimine, rakumembraanide bioloogiliselt aktiivsete molekulide klass, mis mängib vaskulaarse homöostaasi võtmerolli, võib sillutada teed uue mõistmise horisondi poole. Kuigi ilmnevad tõendid näitavad, et muutused sphingolipiidide metabolismis, nagu S1P ja keramiidid, võivad mängida rolli vaskulaarsetes häiretes ja hüpertensioonis[31], jääb endiselt ebaselgeks, kas need on seotud hüpertensiivsete elundikahjustuste patogeneesiga. Selles uuringus püüdsime saada mõningaid teadmisi sphingolipiidide ainevahetusest SHRSP ja SHRSR roti tüvedes, mis on kaks spontaanselt hüpertensiivset prekliinilist mudelit, millel on erinev vastuvõtlikkusNeeruja tserebrovaskulaarse kahjustuse areng. Eelkõige viisime uuringu läbi 8-nädalastel rottidel, vanuses, mil nad muutuvad hüpertensiivseks, kuid on endiselt vabad sihtorgani kahjustustest. Selle lähenemisviisi kaudu püüdsime tuvastada mis tahes "sphingobiological" allkirja, mis võib olla seotud hüpertensiivse haiguse erineva tulemusega kahes roti mudelis. Normotensiivne roti tüvi oli sobiv kontroll. Meie tulemused näitasid esimest korda, et mõlemat hüpertensiivset rotimudelit iseloomustas sphingolipid ainevahetuse globaalne häirimine, kuid vähesed muutused olid spetsiifilised kas SHRSP või SHRSR tüvega. Eelkõige vähenes oluliselt nii SPHK2 kui ka SGPL1 ekspressioon ainult SHRSP ajus. SPHK2 tasemete vähendamisel võib olla äärmiselt kahjulik mõju ajus, kus see on eriti rikkalik mikrovaskulaarsetes endoteelirakkudes ja avaldab kaitsvat rolli hüpoksilise eeltingimusega indutseeritud isheemia vastu [32]. Teisest küljest võib SGPL1 vähendamine olla potentsiaalselt toksiline neuronaalsete rakkude funktsioonide jaoks [33].
Seda silmas pidades on mõeldav, et S1P-metaboliseerivate ensüümide tasakaalustamatus koos sellest tuleneva defektse S1P biosaadavusega võib põhjustada veresoonte suurenenud kahjustusi. S1P võimalik kaasamine insuldiga potentsiaalselt seotud molekulaarsete mehhanismide reguleerimisse tulenes tõenditest, et shrsr-kudedes suurenes S1PR1 tase, mis on hiljuti tuvastatud SHRSP soolatundlikkuse positsioonilise kandidaatgeenina[22]. Need tulemused viitavad S1P võimalikule topeltrollile vaskulaarse kahjustuse määramisel ja sellest tuleneva insuldi korral. Tegelikult võib S1P biosaadavuse vähendamine ja/või sellega seotud radade defektne reguleerimine suurendada SHRSP-s insulditundlikkust. Seevastu S1PR1 suurenenud ekspressioon, mille aktiveerimine on teadaolevalt kasulik aju isheemia katsemudelites [34–36], võib lõpuks olla SHRSR-i kaitsev tegur. Meie tulemused näitasid veel ühte huvitavat erinevust kahe spontaanselt hüpertensiivse roti tüve vahel. CerS1 suurenenud ekspressioon, mis avastati ainult SHRSP-s, võib viidata aju keramiidi suurenenud biosaadavusele, mis võib paljastada toksilise ja potentsiaalselt seotud suurenenud vastuvõtlikkusega insuldile. Seda kinnitavad mitmed uuringud, mis näitavad seost keramiidisisalduse suurenemise, väikeste veresoonte isheemiliste haiguste ja valgeaine hüperintensiivsuse vahel [37,38].
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Teine oluline tähelepanek, mis on saadud meie uuringust, on nii SPTLC1 kui ka 2 märkimisväärne vähenemine SHRSP-s võrreldes SHRSR-iga, kus variatsioone ei tuvastatud. Kuigi mõlemad hüpertensiivsed tüved jagasid mõningaid defekte teiste de novo sphingolipid sünteesiga seotud geenide ekspressioonis, viitab SPTLC-de vähendamine selgelt selle metaboolse marsruudi võtmerollile tserebrovaskulaarse haiguse patogeneesis. Selles kontekstis näitavad hiljutised tõendid, et sphingolipiidide endoteeli de novo süntees reguleerib vererõhku ja endoteeli homöostaasi[30], rõhutades de novo sünteesitud sphingolipiidide kriitilist rolli vaskulaarsetes haigustes. Praegused andmed võivad viidata sellele, et shrsp-s võib häirida sphingolipiidide de novo sünteesi. Meie uuring on esimene, mis käsitleb sphingolipid ainevahetuse spetsiifilisi aspekte insuldi suhtes. Kuigi me ei teinud roti kudedes sphingolipiide kvantitatiivset analüüsi, näitasid meie fifindingid erinevate sphingolipiidide, nagu S1P ja ceramide, biosaadavuse võimalikku muutumist SHRSP-s. Kuna S1P stimuleerib rakkude vohamist ja ellujäämisradasid, samas kui keramiidid avaldavad tavaliselt proliferatiivset ja apoptootilist toimet[39], võib nendevaheline tasakaalustamatus mõjutada SHRSP aju homöostaasi ja potentsiaalselt aidata kaasa insuldi patogeneesile. Arvestades meie uuringu korrelatiivset olemust, on vaja täiendavaid uuringuid, et täielikult mõista sphingolipid muutuste võimalikku keskset rolli hüpertensiivse elundikahjustuse patogeneesis, et töötada välja tõhusamad "sphingolipid-põhised" ravistrateegiad. Arvestades, et mitmed ravimid, mille molekulaarsed sihtmärgid kuuluvad sphingolipid radadesse, on juba olemas teiste haiguste raviks [40], usume, et meie leiud võivad pakkuda tuge nende terapeutilise potentsiaali uurimiseks hüpertensiivses ajus jaNeeruvaskulaarsed häired.
Materjalid ja meetodid
LoomamudelidKõik katsed viidi läbi kahe kuu vanuste meeste insuldile kalduvate spontaanselt hüpertensiivsete (SHRSP), insuldikindlate spontaanselt hüpertensiivsete (SHRSR) rottide tüvede abil ning võrreldi neid vanuse ja sooga sobitatud normotensiivse roti tüvega WistarKyoto (WKY). SHRSP ja SHRSR on kõige sagedamini kasutatavad loommudelid hüpertensiooni ja sellega seotud insuldi prekliinilistes uuringutes [5,6]. Neid hoiti IRCCS Neuromedi loomarajatises, neid hoiti püsival toatemperatuuril ja 12 h päeval / öösel tsüklites ning neid toideti regulaarse roti chow ja vee ad libitumiga. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt IRCCS Neuromed Animal Care Review Boardi ja Istituto Superiore di Sanità heakskiidetud protokollidele (ISS-i loa number: 1086/2020) ning need viidi läbi vastavalt ELi direktiivile 2010/63/EL loomkatsete kohta.
ImmunoblottingsRotte satrigeerisid pea maharaiumine ja koed (aju jaNeerud) külmutati vedelikus N2 ja pulseeriti mördis pestliga. Pulveriseeritud kude homogeniseeriti lüüsipuhvris, mis sisaldas 20 mM Tris, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4 ja 1:1000 proteaasi inhibiitori segu (Sigma-Aldrich) ja ultraheliga 2*10 s impulssidega. Immunoblottingu puhul oli 20 μg kogu valgu lüsaati immunoblotted järgmiste antikehadega: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, Uk), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), anti-S1PR1 (1:1000) (immunoloogilised teadused), anti-S1PR2 (1:1000)(Santa Cruz Biotechnology), anti-S1PR3 (1:1000) (immunoloogiateadused), anti SPTLC1 (1:1000) (Abcam) ja anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Valkude normaliseerimiseks kasutati antiaktiini (1:2000) (Immnunological Sciences, Rooma, Itaalia). Valguribad tuvastas ECL Prime (GE Healthcare) ja kvantiteeriti quantity one software'iga (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
RNA Extraction ja qPCR.
Total RNA ekstraheeriti Rneasy komplekti (Qiagen) abil vastavalt tootja juhistele. 1000 ng kogu RNA-d sünteesiti Super Script III pöördtranskriptaasi (Invitrogen) abil ja saadud cDNA amplififitseeriti Power SYBR Green PCR Master Mixi (Bio-Rad) abil, järgides tootja juhiseid. Kvantitatiivne qPCR analüüs viidi läbi spetsiaalsete kruntide abil: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
