Tetrahüdrobiopteriini kõrgenenud taseme tuvastamine ortostaatilise talumatusega ME/CFS-i patsientide seerumiproovides: pilootuuring

Abstraktne:Müalgiline entsefalomüeliit ehk kroonilise väsimussündroom (ME/CFS) on multisüsteemne krooniline haigus, mida iseloomustavad tõsine lihaste väsimus, valu, pearinglus ja aju udu. Paljud ME/CFS-iga patsiendid kogevad ortostaatilist talumatust (OI), mida iseloomustab sagedane pearinglus, peapööritus ja minestustunne püstises asendis. Vaatamata intensiivsele uurimisele on selle kurnava seisundi molekulaarne mehhanism endiselt teadmata. OI avaldub sageli kardiovaskulaarsetes muutustes, nagu aju verevoolu vähenemine, vererõhu langus ja südame löögisageduse vähenemine. Tetrahüdrobiopteriini (BH4), endoteeli lämmastikoksiidi süntaasi (eNOS) ensüümi olulise kofaktori, biosaadavus on tihedalt seotud südame-veresoonkonna tervise ja vereringega. Et uurida BH4 rolli ME/CFS-is, võtke seerumiproovid CFS-iga patsientidelt (n=32), ainult OI-ga CFS-i patsientidelt (n=10; CFS + OI) ja CFS-i patsientidelt, kellel on nii OI kui ka OI. väikese kiu polüneuropaatia (n=12; CFS + OI + SFN) suhtes tehti BH4 ELISA. Huvitaval kombel näitasid meie tulemused, et BH4 ekspressioon on märkimisväärselt kõrge CFS-i, CFS + OI ja CFS + OI + SFN-ga patsientidel võrreldes vanuse / sooga sobitatud kontrollidega. Lõpuks näitas ROS-i tootmise test kultiveeritud mikrogliiarakkudes, millele järgnes Pearsoni korrelatsioonistatistika, et kõrgenenud BH4 CFS + OI patsientide seerumiproovides võib olla seotud oksüdatiivse stressi vastusega. Need leiud viitavad sellele, et BH4 metabolismi reguleerimine võib olla paljutõotav sihtmärk CFS-i ja CFS-i molekulaarse mehhanismi mõistmisel OI-ga.

Cistanche võib toimida väsimuse ja vastupidavuse suurendajana ning eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et Cistanche tubulosa keetmine võib tõhusalt kaitsta kaaluga ujumishiirte kahjustatud maksa hepatotsüüte ja endoteelirakke, reguleerida NOS3 ekspressiooni ja soodustada maksa glükogeeni tootmist. sünteesi, avaldades seega väsimusevastast toimet. Fenüületanoidglükosiidide rikas Cistanche tubulosa ekstrakt võib märkimisväärselt vähendada seerumi kreatiinkinaasi, laktaadi dehüdrogenaasi ja laktaadi taset ning tõsta hemoglobiini (HB) ja glükoosi taset ICR hiirtel ning see võib mängida väsimusevastast rolli, vähendades lihaskahjustusi. ja piimhappega rikastamise edasilükkamine energia salvestamiseks hiirtel. Ühendi Cistanche Tubulosa tabletid pikendasid märkimisväärselt raskust kandvat ujumisaega, suurendasid maksa glükogeenivaru ja vähendasid seerumi uurea taset pärast treeningut hiirtel, näidates selle väsimusevastast toimet. Cistanchise keetmine võib parandada hiirte vastupidavust ja kiirendada väsimuse kaotamist, samuti võib seerumi kreatiinkinaasi taseme tõusu pärast koormust vähendada ja hoida hiirte skeletilihaste ultrastruktuuri pärast treeningut normaalsena, mis näitab, et sellel on mõju. füüsilise jõu suurendamiseks ja väsimuse vastu võitlemiseks. Cistanchis pikendas ka märkimisväärselt nitritiga mürgitatud hiirte elulemusaega ja suurendas tolerantsust hüpoksia ja väsimuse vastu.

Klõpsake valikul Üleväsimust

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Märksõnad:ME/CFS; tetrahüdrobiopteriin; ortostaatiline talumatus; väikese kiu polüneuropaatia; endoteeli NOS; reaktiivsed hapniku liigid

1. Sissejuhatus

Müalgiline entsefalomüeliit/kroonilise väsimussündroom (ME/CFS) on krooniline multisüsteemne haigus, mida iseloomustavad kurnav lihaste väsimus, valu, pearinglus ja aju udusus [1,2]. ME/CFS-i patsientide alamrühmal on raske ortostaatiline hüpotensioon [3], mida iseloomustab vererõhu märkimisväärne langus, mis põhjustab püsti seistes pearinglust ja minestamist [4]. Seda seisundit nimetatakse sageli ortostaatiliseks talumatuks (OI). Osa OI-ga patsientidest vastab ka väikeste kiudude polüneuropaatia [5,6] diagnostilistele kriteeriumidele, mida diagnoositakse naha biopsiaproovides amüloidoosi Kongo punase värvimise abil [7]. Vaatamata intensiivsele uurimisele ei ole OI molekulaarne mehhanism teada.

BH4 on aminohapete metabolismi oluline kofaktor [8]. Aminohapped, nagu fenüülalaniin, türosiin ja trüptofaan, muudetakse hüdroksülaasi ensüümide toimel olulisteks raku vaheühenditeks. BH4 toimib kõigi nende hüdroksülaasi ensüümide olulise kofaktorina [9–11]. Seetõttu on BH4 biosaadavus neurotransmitterite, nagu dopamiini ja serotoniini sünteesi jaoks kriitiline [10]. Lisaks nendele hüdroksülaasi ensüümidele reguleerib BH4 ka lämmastikoksiidi süntaasi ensüümide funktsiooni ja lämmastikoksiidi (NO) tootmist endoteelis [12]. NO endoteeli tootmine suurendab vasodilatatiivset vastust, alandab vererõhku ja aitab lihaseid lõdvestada [13,14]. Teisest küljest eraldub BH4 oksüdatiivse stressi korral eNOS-i poolt indutseeritud NO tootmisest [15] ja suurendab otseselt mitokondriaalset stressivastust südamekoes [16] ja skeletilihastes [17]. Seetõttu on BH4 metabolismi reguleerimine südame-veresoonkonna funktsiooni ja vereringe tervise jaoks kriitiline. Kuna OI-patsientidel on teadaolevalt kardiovaskulaarsed kõrvalekalded, oleme huvitatud sellest, kas OI-patsientidel on muutunud BH4 metabolism. Siiani ei ole tehtud ühtegi uuringut, mis uuriks BH4 metabolismi rolli CFS-is. Lisaks uurib meie uuring ka seda, kas OI-ga CFS-i patsiendid on muutnud BH4 biosünteesi.

Uuringusse kaasati 66 katsealuse seerumiproovid n=32 CFS-i ja n=34 kontrolliga. Tervete kontrollide ja CFS-i patsientide BH4 taseme võrdlemiseks viidi läbi topeltpime kvantitatiivne ELISA. Huvitaval kombel täheldasime, et CFS-iga patsientidel oli BH4 tugev ülesreguleerimine võrreldes tervete kontrollidega. Võrreldes BH4 taset OI-ga CFS-ga patsientide (n=10) ja vanuse-/sooliste kontrollrühmade (n=10) vahel, täheldasime ka, et OI-ga CFS-iga patsientidel oli oluliselt kõrgem BH4 seerumis. Meie praegune käsikiri rõhutab kollektiivselt, et seerumi BH4 tõus CFS-i patsientidel võib mängida OI patogeneesis kriitilist rolli.

2. Tulemused

Uuringusse kaasatud isikud: BH4 taseme määramiseks seerumiproovides kaasati uuringusse kokku 66 inimest. Tabelis 1 on kokkuvõte nende uuritavate vanusest, soost, rahvusest ja olemasolevatest tingimustest. Neljal kontrollrühma katsealusel esines vähiga seotud tüsistusi ja seetõttu jäeti nad lõplikust analüüsist välja. Kontrollrühma miinimum-, mediaan- ja maksimaalne vanus on vastavalt 18, 64,5 ja 82 aastat. CFS-rühma puhul on need väärtused 26, 59 ja 76 aastat. Vanuse sagedusjaotus mõlemas rühmas näitas sarnast kalduvust ja sellele järgnenud Bland-Altmani analüüsi test näitas, et erinevuste keskmine oli nullilähedane, mis viitab sellele, et vanuse suhtes ei ole erapoolikust. Kontrollrühmas oli 44% mehi ja 56% naisi, samas kui CFS-i rühmas oli 41% mehi ja 59% naisi. Kõik patsiendid olid kaukaaslased ja elasid Põhja-Nevada ja California geograafilises piirkonnas.

ME/CFS-i patsientide populatsioon registreeriti Kanada 2003. aasta ja Fakuda ME/CFS-i kriteeriumide alusel. Nad vastasid ka SCID (meditsiiniinstituudi poolt loodud ME/CFSi uus nimi) diagnostilistele kriteeriumidele. Kontrollide vanus/sugu sobitati CFS-i subjektidega, kes kutsuti ka koos patsientidega Dr. Petersoni sisehaiguste kliinikusse.

CFS + OI ja CFS + OI_SFN alamhulgad loodi diagnostiliste testimiste kirjete (meditsiiniline diagramm on täielik) ja kliinilise korrelatsiooni abil. Näiteks esitasid OI-ga inimesed kontorisse modifitseeritud positiivse NASA lahja testiga (näitab OI-d) ja kõik said IV mahu suurendamise ravi (soolalahus). SFN patsientidel võeti biopsiaproovid. Kaasatud CFS + OI + SFN subjektide puhul registreeriti Mass General Hospital aruanne, milles pahkluu külgmises lihaskoes viidi läbi Kongo punase värvimine neuriitide tiheduse loendamiseks.

BH4 tase on kõrge ME/CFS-i patsientide seerumiproovides: Kokku kaasati uuringusse 32 CFS-i ja 34 kontrollisikut (tabel 1), et mõõta seerumi BH4 taset konkureeriva ELISA abil. BH4 ELISA standardkõver oli negatiivse kaldega eksponentsiaalne kõver, mis tuletati kuuest kasvavast BH4 standardi kontsentratsioonist (5, 10, 25, 50, 10{{52). }} ja 150 ng/ml). BH4 absoluuttaseme mõõtmiseks OD väärtusest kasutati standardkõvera kallet ja lõikepunkti. Seerumiproovide seerialahjendus, millele järgnes BH4 ELISA test, näitas, et seerumi lahjendus 1:2 andis kõige kontrastsemad tulemused võrreldes tühja või taustaga. Seetõttu lahjendati kõik seerumiproovid 1:2. Huvitav on see, et topeltpime ELISA analüüs, millele järgnes mitteparameetriline Mann-Whitney U test [* p < 0,05 (=0,033); U=304.5] näitas, et BH4 tase oli oluliselt kõrgem n=32 CFS-iga patsiendil võrreldes n=28 kontrollsubjektiga (joonis 1A). Neli katsealust (n=4) kontrollrühmast jäeti välja nende olemasoleva vähi tõttu. Kuna katsealused kaasati juhuslikult, sõltumata nende vanusest ja soost, soovisime järgmisena analüüsida BH4 taseme korrelatsiooni katsealuste vanuse ja sooga. Sellest lähtuvalt näitas mitteparameetriline Spearmani korrelatsioonianalüüs (joonis 1B), et BH4 taseme ja katsealuste vanuse vahel ei olnud korrelatsiooni (Spearmani r=−0,1657; p=0,1835). Järgmisena võrdlesime BH4 taset meeste ja naiste vahel (joonis 1C). Et hinnata olulisust meeste ja naiste vahel (efektor nr 1 on sugu), samuti kontrolli ja CFS vahel (efektor nr 2 on tervislik seisund), viidi läbi kahesuunaline ANOVA analüüs. Seega ei ilmnenud mees- ja naissoost uuritavatel BH4 tasemetes olulist erinevust (p > 0,05; =0,3496). Siiski esines BH4-s oluline erinevus kontroll- ja CFS-i subjektide vahel (p < 0,05; =0,0375), sõltumata soolisest erinevusest.

Kuna praegune kohort on rangelt piiratud sama geograafilise piirkonna, etnilise päritolu ja ühe arsti praktika alusel, oleks BH4 paaripõhine võrdlusanalüüs juhtumite ja vanuse ja sooga vastavuses olevate kontrollide vahel otsustavam. Kokku võrreldi 15 paari (joonis 1D). Mitteparameetriline Wilcoxoni sobitatud paaride märgistatud järjestuse test näitas, et CFS-i patsientidel oli oluliselt kõrgem BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Kuna kõik CFS-i ja kontrollproovid sobitati vanuse ja sooga, viidi läbi paaripõhine võrdlusanalüüs. Järgnev paaris-t-test (t1, 9=3.834; ** p < 0.{7}}.004) näitas, et CFS + OI seerumiproovides oli kontrollseerumi proovidega võrreldes oluliselt kõrgem BH4 (joonis 2C). ). Kumulatiivne tulpstatistika test (joonis 2D) näitas lisaks, et seitsmel kümnest CFS + OI patsiendist oli BH4 tase oluliselt kõrgem kui mediaan (=99,63 ng/mL). Teisest küljest oli ainult kahel 10-st kontrollisikust BH4 mediaanväärtusest kõrgem. Need andmed viitavad ühiselt sellele, et CFS + OI patsientidel oli kontrollsubjektidega võrreldes oluliselt kõrgem BH4.

CFS-i patsientide alamhulgal (n=12) on nii OI kui ka SFN. BH4 tasemete võrdlus (joonis 3A) tervete kontroll- ja CFS + OI + SFN subjektide vahel näitas, et CFS + OI + SFN patsientidel oli BH4 tase oluliselt kõrgem [t1, 22=2.371; * lk<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Kui võrrelda BH4 taset ainult CFS-i ja CFS + OI-ga patsientide vahel, täheldasime, et CFS-i + OI-ga patsientide seerumiproovides (n=14) oli BH4 tase kõrgem (joonis 4A) võrreldes kontrollsubjektidega (n {{). 6}}). QQ graafiku analüüs näitab, et andmete jaotus on mõlemas rühmas normaalne (joonis 4B), mis viitab sellele, et keskmiste võrdlemiseks saab kasutada parameetrilist testi. Sellest lähtuvalt näitas paaristamata t-test keskmise olulisuse analüüsimiseks rühmade vahel tugevat erinevust [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Valitud kohordi (n=22) veergude statistika näitas, et 14-st CFS + OI patsiendist 9-l oli kõrgem seerumi BH4 tase võrreldes mediaaniga 119,7 ng/ml (joonis 4C). Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et OI-ga CFS-i patsientidel on seerumis kõrgenenud BH4 tase. Meie praegune käsikiri identifitseerib ühiselt BH4 potentsiaalse vere kaudu leviva biomarkerina CFS + OI ja CFS + OI + SFN patsientidele.

Kõrgenenud BH4 tase võib olla seotud suurenenud oksüdatiivse stressiga: et mõista kõrgenenud BH4 funktsionaalset tähtsust seerumis, uurisime OI-ga (n=10) CFS-patsientide seerumiproovide ROS-i indutseerivat võimet. DCFDA-ga infundeeritud mikrogliiarakke töödeldi 1:2 lahjendatud seerumiproovidega 10 CFS + OI ja 10 vanuse-/sookontrollirühmast 90 minutit, millele järgnes ROS-i produktsiooni mõõtmine fluorestsentsplaadilugeja abil (nt: Em { {12}} nm/535 nm), nagu on kirjeldatud materjalide ja meetodite osas. Nagu oleme varem teatanud [18], näitas histogrammi analüüs, et CFS + OI seerumiproovide ROS-i tootmisvõime oli oluliselt suurem kui kontrollseerumi proovidel (joonis 5A) [t1, 18=2.541; p < 0,05 (=0,0205)]. Kuna kõik andmepunktid mõlemas rühmas olid normaalselt jaotunud (joonis 5B), teostasime rühmadevahelise keskmise olulisuse uurimiseks parameetrilise testi. Huvitaval kombel näitas Pearsoni korrelatsiooni statistiline analüüs selles kohordis, et BH4 taseme ja ROS-i tootmise vahel oli mõõdukalt positiivne korrelatsioon, mis viitab sellele, et kõrgenenud BH4 tase CFS + OI seerumiproovides võib olla seotud suurenenud oksüdatiivse vastusega (joonis 5C).

Kokkuvõttes tõstab meie praegune käsikiri esile, et CFS-iga patsiendid on seotud kõrgenenud BH4 tasemega seerumis ja et ülesreguleerimist täheldati OI-ga CFS-i patsientidel oluliselt. Lisaks võib kõrgenenud BH4 olla seotud oksüdatiivse stressi vastusega, mis toob esile BH4 metabolismi potentsiaalse rolli CFS-i ja CFS-i patogeneesis OI-ga (joonis 5D).

3. Arutelu

Tetrahüdrobiopteriini (BH4) biosüntees on tervises rangelt reguleeritud ainevahetusprotsess ja selle ebanormaalne ekspressioon on seotud mitmete haigustega. Selle puudus põhjustab aminohapete metabolismi metaboolset defitsiiti [19, 20], dopamiini regulatsiooni häireid [21] ja verevoolu häireid [22, 23] ning on seotud hüpertensiooni, diabeedi, ateroskleroosi, vananemise ja muud ainevahetushäired. Teisest küljest kahjustab ülesreguleeritud BH4 biosüntees mitokondriaalset energiatootmist [24], kutsub esile oksüdatiivse stressi [25] ja suurendab autofagia kahjustust [26]. Kõrgenenud BH4 tase on seotud ka vererõhu langusega [27], kutsudes esile vasodilatatiivse vastuse endoteeli NOS-i aktiveerimise kaudu [28]. Seetõttu võib BH4 ülesreguleeritud biosüntees otseselt soodustada vererõhu või hüpotensiooni langust. Uuring näitab, et BH4 puudus nõrgendab hiirtel LPS-i põhjustatud hüpotensiooni [23]. Siiani ei ole BH4 metabolismi rolli CFS-i patsientidel, eriti OI-ga CFS-i patsientidel uuritud. Seetõttu oli meie eesmärk hinnata seerumi BH4 ekspressiooni selles patsientide populatsioonis. Üllataval kombel näitas meie ELISA analüüs, et CFS-i patsientide seerumiproovides oli oluliselt kõrgem BH4 tase võrreldes vanuse ja sooga sobivate tervete kontrollrühmadega. Sellest lähtuvalt näitas Spearmani korrelatsioonistatistika, et BH4 ülesreguleerimisel ei olnud olulist korrelatsiooni nii vanuse kui ka soo osas, mis tühistas nende patsientide BH4 biosünteesi vanuse või sooga seotud kahjustuse võimalused.

Järgmisena täheldasime, et CFS + OI patsientide seerumiproovid näitasid ka tugevat BH4 tõusu võrreldes vanuse ja sooga sobivate kontrollide seerumiproovidega. Meie kumulatiivne veeru statistika näitas, et 7-l 10-st CFS + OI patsiendist oli märkimisväärselt kõrge BH4 tase, mis viitab sellele, et BH4 seerumi tõus võib olla seotud OI patogeneesiga. Tulemust kinnitas veelgi, kui väikese kiu polüneuropaatiaga (SFN) CFS + OI patsientide alamhulk näitas oma seerumiproovides kõrget BH4 ekspressiooni võrreldes vanuse ja sooga sobiva kontrolliga. Huvitaval kombel näitas seerumi BH4 taseme võrdlus ainult CFS-i ja OI-ga CFS-i patsientide vahel, et OI-ga patsientidel oli BH4 tase oluliselt kõrgem.

Kuidas aitab kõrgenenud BH4 kaasa ME / CFS-i patogeneesile? On mitmeid teid, mille kaudu kõrgenenud BH4 võib otseselt kaasa aidata ME / CFS-i patogeneesile (joonis 5D). Esiteks põhjustab BH4 ülesreguleerimine energia metabolismi mitokondriaalset kahjustust elektronide transpordiahela I ja IV kompleksi inhibeerimise kaudu, mille tulemuseks on mitokondriaalse membraani potentsiaali vähenemine, tsütokroom C vabanemine ja apoptoos [24]. BH4 kokkupuude põhjustab samuti oksüdatiivset stressi [29]. Kuigi füsioloogiliselt toetab BH4 endoteeli NO tootmist eNOS-i aktiveerimise kaudu, lahutab BH4 oksüdeerimine superoksiidiga selle eNOS-ist, mis põhjustab oksüdatiivse stressi südamekoes ja mõjutab südame-veresoonkonna tervist (joonis 5C). Toetuseks näitasid meie tulemused, et BH4 kõrgenenud tasemetel CFS + OI seerumiproovides oli positiivne korrelatsioon ROS-i indutseerivate võimetega. Lisaks aktiveerib BH4 ka rapamütsiini kompleks1 (mTORC1) kinaasi imetajate sihtmärke, et kahjustada autofagiat. Varem teatasime, et mTORC1 aktiveerimine ja sellele järgnev autofagia kahjustus võib olla seotud ME / CFS patogeneesiga. On teatatud, et nii mTORC1-sõltuv autofagia kahjustus [18] kui ka energia metabolismi mitokondriaalne puudulikkus [30] aitavad kaasa ME/CFS patogeneesile. Seetõttu võib BH4 taseme tõus ME / CFS-i patsientide seerumiproovides esile kutsuda oksüdatiivset stressi ja suurendada eNOS-i lahtiühendamist, millele järgneb kardiovaskulaarne stress, hüpotensioon, mitokondriaalne toksilisus ja autofagia kahjustus CFS-i patsientidel.

4. Materjalid ja meetodid

Proovi võtmine: proovide võtmist, identifitseerimist ja säilitamise plaani arutati enne [18]. Lühidalt, vereproovid ja küsimustiku andmed koguti dr Daniel Petersoni (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, USA) juhendamisel (Western IRB) #20201812. Vereproovid tsentrifuugiti ja seerumiproovid jaotati alikvootideks ja seejärel külmutati kohe temperatuuril –80 ◦C. Igale proovile anti kordumatu identifitseerimisnumber ja see registreeriti nii sülearvutis kui ka Microsoft Excelis koos kuupäeva ja allkirjaga vastavalt IRB poolt heaks kiidetud protokollile. Seejärel toimetati proovid meie Wisconsini uurimisasutusse kuival jääl üleöö. Pärast kättesaamist töödeldi proove ja analüüsiti neid kohe. Küsimustikud ja identifitseerimata kliinilised andmed salvestatakse turvalises, piiratud juurdepääsuga Redcap serveri andmebaasis, mida haldavad Sierra sisehaiguste teadur ja kliiniline stipendiaat. Patsiendi andmeid säilitati vastavalt Sierra Internal Medicine'i kehtestatud privaatsuspoliitika juhistele. ME/CFS-i patsientide alamhulgad OI ja OI + SFN rühmades määrati kindlaks pimediagrammi ülevaate abil ning laborijärgset analüüsi kinnitas kliiniline PI. Neli vähihaiget kaasati sellesse analüüsi pimesi ja need toimisid haiguspositiivse kontrollina.

OI diagnostilised kriteeriumid hõlmasid asjakohaseid leide (südame kaldetabeli tulemused) kliinilise diagrammi ülevaatest. Lisaks lõpetas kliiniline kaaslane verevõtu ajal NASA lahja analüüsi. SFN-i diagnoos tehti kliinilise kaardi ülevaate ja sääreluueelsest piirkonnast kogutud nahalöögi biopsia histoloogilise uurimise kaudu. Naha biopsiaid hinnati sõltumatult Massachusettsi üldhaiglas epidermise närvilõpmete morfomeetriliseks kvantifitseerimiseks, et uurida nahapinna pindala neuriitide tihedust.

BH4 konkureeriv ELISA: BH4 taset mõõdeti ja kvantifitseeriti ME-CFS-i patsientide ja vanusega sobivate tervete kontrollide seerumiproovides vastavalt tootja juhistele (Human BH4 konkureeriv ELISA komplekt; Müüja: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Cat # MBS733839). Komplekt valideeriti meie laboris (multimodaalne plaadilugeja Perkin Elmer Victor X3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) ning selle standardkõver (R2=0.98) ja tundlikkus oli nii madal kui 1 ng/ml kontsentratsioon positiivse kontrolli suhtes. Lühidalt, seerumiproovid lahjendati analüüsi lahjendiga (või 1 × PBS) ja seejärel pipetiti mikroplaadile, mis oli eelnevalt kaetud polüklonaalse BH4-vastase antikehaga. Pärast 30-minutilist inkubeerimist prooviga lisati plaadile BH4-HRP konjugaat ja inkubeeriti veel 1 tund temperatuuril 37 ◦C. Ülejäänud seerumiproovid dekanteeriti ja pesti plaadil 1x pesupuhvriga (alternatiivina 1x PBS-T-ga) kolm korda viis minutit, kasutades mitme kanaliga pipetti. Pärast pesemist pandi iga süvend reageerima TMB substraadiga 10 minutit pimedas. Värvuse kujunemine toimub pärast 10-minutilist substraadi inkubeerimist loksutamise tingimustes. BH4-HRP konjugaat konkureeriks seerumi BH4-ga, et seonduda kaetud primaarse antikehaga. Seega, mida rohkem on proovis seerumi BH4, seda vähem BH4-HRP-d seondub ja seega tekib vähem värvi. Kokku võeti 66 seerumiproovi (34 kontroll-+ 32 ME-CFS-i patsienti) (üksikasjad jaotises "Proovide võtmine") koos asjakohaste institutsionaalsete regulatiivsete juhistega ja analüüsiti GLP tingimustes. Proovide jaotus oli juhuslik ja analüüs oli topeltpime, nagu on kirjeldatud jaotises "proovi suuruse põhjendus".

Valimi suuruse põhjendus ja statistiline analüüs: valimi suurust põhjendati järgmise võrrandiga. Valimi suurus {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z on z-skoor, mis on 1,28 võimsuse 0.8 korral. p on rahvastiku osakaal; 95% usaldusvahemiku korral on p {{20}},95. ε on veapiir, mis on 0,05. Seetõttu, et saavutada rühmade keskmise erinevuse olulisus p < 0,05 juures, kaasati rühma kohta kokku n=32 proovi. Kontroll- ja CFS + OI patsientide võrdlemiseks kaasati rühma kohta n=10 proovi. Sarnane valimi suurus lisati kontroll- ja kontroll-+OI + SFN-rühmade võrdlemisel. Valimi suuruse arvutamine tehti ε=0,05 ja p=0,99 põhjal. Mitteparameetriline Mann-Whitney U test võeti kasutusele, et testida kahe rühma keskmise olulisust, kui kahe rühma andmete jaotus oli identne ja normaalne; vastasel juhul viidi läbi parameetriline paaritu t-test. Rühmadevahelise paarisanalüüsi jaoks viidi läbi parameetriline paaris-t-test, kui mõlema rühma andmepunktid olid normaalselt jaotunud; vastasel juhul viidi rühmadevahelise olulisuse hindamiseks läbi Wilcoxoni järgu test. Keskmise olulisuse testimiseks enam kui kahes rühmas kasutati kahesuunalist ANOVA-d post hoc Bonferroni või Tukeyga, võttes arvesse sugu (mees või naine) ja tervist (tervislik või CFS). Kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism versiooni 9.5.1 (733) tarkvaras (Boston, MA 02110, USA).

ROS-analüüs:HMC3 inimese embrüonaalseid mikrogliiarakke kasvatati ja passeeriti täieliku DMEM söötmega. Lühidalt, HMC3 rakud plaaditi ROS fluoromeetrilise uuringu jaoks 96 süvendiga plaadile. Rakke kasvatati 75–80% konfluentsuseni ja inkubeeriti DCFDA sondiga (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, UK) 45 minutit temperatuuril 37 ◦C pimedas. Optimaalse fluorestsentsi väärtuse saavutamiseks asendati standardne sööde 90 minutiks 100 µL (lahjendus 1:2=50 µL seerumi + 50 µL söötmega) seerumiga täiendatud söötmega. Inkubatsiooniperioodi lõpus sööde aspireeriti ja mõõdeti seejärel ergastus-emissioonil, kasutades 485 nm ja 535 nm filtrikomplekte PerkinElmer Victor X3 plaadilugejas (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Autori kaastööd:AR mõtles idee välja, kavandas, viis läbi uurimistööd ja kirjutas käsikirja. CGG tegi uurimistööd ja kirjutas käsikirja. RW aitas vereproovide kogumisel ja patsientide arvestuse pidamisel. DP on kliiniline PI, kes vastutas bionäidiste, küsimustike ja IRB heakskiidu kogumise eest. Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:Seda tööd toetas Simmaron Research Inc., mittetulunduslik 501C uurimisorganisatsioon, Incline Village, NV 89451, tänu Ramsay Award 2023 auhinnale AR-le Solve ME algatuse ja Hesse Sibylla fondi (Québec, QC, Kanada) rahaliste vahendite tulemusena.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:Ühtegi selle uurimisartikli osa, sealhulgas pilte ja tekste, ei olnud varem avaldatud ega reprodutseeritud üheski raamatus, artiklis ega muus avaldatud kirjanduses. Pildid on originaalid ja neid ei ole muudest allikatest kopeeritud. See ei ole kliiniline uuring, vaid institutsionaalne vaatlusuuring. Bionäidiste, küsimustike juhiste kogumise, arvestuse pidamise ja ainulaadsete identifitseerimisnumbrite genereerimise viis läbi Lääne IRB protokoll nr 20201812 (praegune uuendamise kuupäev 21.07.23).

Teadliku nõusoleku avaldus:Kõik autorid andsid oma nõusoleku selle ülevaateartikli avaldamiseks.

Andmete kättesaadavuse avaldus:Selle paberiga pole seotud elektroonilist andmelehte. Elektroonilises hoidlas andmed puuduvad.

Huvide konfliktid:AR, CGG, RW ja DP on 501C mittetulundusliku uurimisorganisatsiooni Simmaron Research INC töötajad. Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Lühendid

ME/CFS=Müalgiline entsefalomüeliit või kroonilise väsimuse sündroom; OI=Ortostaatiline talumatus; SFN=väikese kiu polüneuropaatia; BH4=tetrahüdrobiopteriin; eNOS=endoteeli lämmastikoksiidi süntaas; EI=Lämmastikoksiid. ROS=Reaktiivsed hapniku liigid. ME/CFS=Müalgiline entsefalomüeliit või kroonilise väsimuse sündroom; OI=Ortostaatiline talumatus; SFN=väikese kiu polüneuropaatia; BH4=tetrahüdrobiopteriin; eNOS=endoteeli lämmastikoksiidi süntaas; EI=lämmastikoksiid; ja ROS=Reaktiivsed hapniku liigid.

Viited

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Son, CG Kroonilise väsimussündroomi/müalgilise entsefalomüeliidi (CFS/ME) levimuse süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs. J. Transl. Med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Poeg C.-G. Ülevaade kroonilise väsimuse levimusest kogu maailmas. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Ortostaatilise talumatuse füsioloogiline hindamine kroonilise väsimussündroomi korral. J. Transl. Med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, MINA; Dowell, TG; Felsenstein, D. Müalgiline entsefalomüeliit/kroonilise väsimuse sündroom: diagnoosimise ja juhtimise põhialused. Mayo Clinic Proceedings; Elsevier: Amsterdam, Holland, 2021; lk 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Väikese kiu neuropaatia määratlus, diagnoos ja ravi. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Filiaal, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Kroonilise valu, väsimuse ja kognitiivsete häirete komplekssed sündroomid, mis on seotud autoimmuunse düsautonoomia ja väikeste kiudude neuropaatiaga. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Ei, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Naha amüloidiladestused ja närvikiudude kadu neuropaatia alguse ja progresseerumise markeritena päriliku transtüretiini amüloidoosi korral. Eur. J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Tetrahüdrobiopteriini metabolism: selle tähtsus monoaminergiliste neuronite ja neuroloogiliste häirete korral. Chem. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; hall, DW; Shiman, R. Roti maksa fenüülalaniini hüdroksülaasi reguleerimine. III. Katalüüsi juhtimine (6R)-tetrahüdrobiopteriini ja fenüülalaniiniga. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Türosiinhüdroksülaas (TH), selle kofaktor tetrahüdrobiopteriini (BH4), teised katehhoolamiinidega seotud ensüümid ja nende inimese geenid Parkinsoni tõve (PD) ravimite ja geeniteraapiate kohta: ajalooline ülevaade ja väljavaated. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahüdrobiopteriin suurendab trüptofaani hüdroksülaasi aktiivsust roti raphe viiludes. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahüdrobiopteriini eNOS-i redoksfunktsiooni reguleerimine. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahüdrobiopteriin parandab vananemisega seotud endoteelist sõltuva vasodilatatsiooni kahjustust lämmastikoksiidi tootmise suurendamise kaudu. Ateroskleroos 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA BH4 lisamise mõju pärast pikaajalist isheemiat skeletilihastes. Mikrokirurgia 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOS lahtiühendamine ja endoteeli düsfunktsioon vananenud veresoontes. Olen. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. eNOS-i lahtiühendamine südame-veresoonkonna haigustes – oksüdatiivse stressi ja põletiku roll. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Vananemise ja treeningutreeningu mõju eNOS-i lahtiühendamisele skeletilihaste resistentsuse arterioolides. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Kõrgenenud ATG13 sisaldus ME/CFS-iga patsientide seerumis stimuleerib oksüdatiivset stressivastust mikrogliiarakkudes, aktiveerides arenenud glükatsiooni lõpptoodete (RAGE) retseptori. Mol. Kamber. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahüdrobiopteriin ja pärilikud hüperfenüülalanineemiad. türklane. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hüperprolaktineemia, vahend tetrahüdrobiopteriini puudulikkuse ravi kontrollimiseks: endokriinsed uuringud haigel tüdrukul. Pediatr. Res. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Tetrahüdrobiopteriini puudulikkus ja dopamiini kadu Lesch-Nyhani tõve geneetilises hiiremudelis. J. Pärand. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrisoni peadirektoraadi tetrahüdrobiopteriini puudulikkus ja lämmastikoksiidi süntaasi lahtiühendamine aitavad kaasa vooluhäiretest põhjustatud ateroskleroosi tekkele. Arterioskleer. Tromb. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Endoteelirakkude tetrahüdrobiopteriini puudulikkus nõrgendab LPS-i indutseeritud veresoonte düsfunktsiooni ja hüpotensiooni. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Ei, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahüdrobiopteriin põhjustab mitokondriaalset düsfunktsiooni dopamiinergilistes rakkudes: mõju Parkinsoni tõvele. Neurochem. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Moon, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Roti mesentsefaalsete dopamiinergiliste neuronite eriline haavatavus tetrahüdrobiopteriini suhtes: olulisus Parkinsoni tõve suhtes. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et al. Autofagia indutseerimine tetrahüdrobiopteriini puudulikkusega. Autofagia 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahüdrobiopteriin: uudne antihüpertensiivne ravi. J. Hum. Hüpertensioon. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahüdrobiopteriin: Endoteeli lämmastikoksiidi süntaasi regulaator vaskulaarsete haiguste korral. Trends Cardiovasc. Med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Tetrahüdrobiopteriini (BH4) metabolismi kriitiline roll radiosensitiivsuse moduleerimisel: BH4/NOS-i telg ingli või kuradina. Esiosa. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Müalgilise entsefalomüeliidi / kroonilise väsimussündroomi patsientidel on muutunud T-rakkude metabolism ja tsütokiinide seosed. J. Clin. Uurige. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Lahtiütlus/väljaandja märkus:Kõikides väljaannetes sisalduvad väited, arvamused ja andmed on ainult konkreetse(te) autori(te) ja kaastöölise(te), mitte MDPI ja/või toimetaja(te) avaldused, arvamused ja andmed. MDPI ja/või toimetaja(d) loobuvad vastutusest inimestele või varale tekitatud vigastuste eest, mis tulenevad sisus viidatud ideedest, meetoditest, juhistest või toodetest.

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】