Congrong-Zaoren-Wumei joogiekstrakti optimeerimine ja und parandav toime hiirtel
Jan 30, 2026
2 Tulemused ja analüüs
2.1 Congrong-Zaoren-Wumei joogiekstrakti valmistamise protsessi optimeerimine
Jooniselt 1 on väljakujunenud HPLC-meetodil nelja võrdlusühendi – sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi ja spinosiini – kromatograafiliste piikide ja külgnevate piikide tõhus eraldamine. Retentsiooniajad olid vastavalt tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min ja tR4=25.9 min. Piigi pindala ja analüüdi kontsentratsiooni lineaarne regressioon andis lineaarsed vahemikud 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 ja 2,44–18,30 µg·mL–1, R2 väärtused olid 0,9998, joon1a, indicine ja . Nendes tingimustes olid sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi ja spinosiini avastamispiirid (LOD) 3,636, 0,045144, 0,058 ja 0,7564 µg·mL–1 ning kvantifitseerimispiirid (LOQ) olid 12,14, 4,14, 02,14 ja 02,14, µg·mL–1. Täpsustestid näitasid nelja analüüdi RSD-deks 0,10%, 0,07%, 0,06% ja 0,33%, mis viitab seadme heale täpsusele. Stabiilsus 0–12 tunni jooksul oli hea, RSD-d olid 0,78%, 0,16%, 0,20% ja 1,46%. Korratavuse testid andsid analüütide RSD-d 0,51%, 0,42%, 0,37% ja 0,38%, mis näitab head korratavust. Spike-taaste testid näitasid keskmist taastumist 97,42%, 103,32%, 98,90% ja 99,71%, RSD-dega vastavalt 0,70%, 0,52%, 1,05% ja 0,63%. Seetõttu on nende nelja peamise komponendi samaaegseks määramiseks loodud HPLC meetod täpne ja usaldusväärne ning sobib järgnevateks protsessi optimeerimise katseteks.
Joonis 1 Võrdluslahuste ja lahuste HPLC kromatogrammid lainepikkusel 210 nm (A) ja 330 nm lainepikkusel (B ja C)
Toorpolüsahhariidide metoodilisel hindamisel oli LOD 0,098 µg·mL–1. Lahusti tühikatse ja pimekatse OD väärtused 485 nm juures ei näidanud ilmseid muutusi, mis viitab heale spetsiifilisusele. OD lineaarne regressioon kontsentratsiooni suhtes andis tulemuseks R2=0.9997, mis näitab suurepärast lineaarsust. Kuue järjestikuse mõõtmise RSD oli 0,47%, mis näitab head täpsust. Polüsahhariidide sisalduse RSD 12 tunni jooksul oli 0, 44%, mis näitab head stabiilsust. Kuue sõltumatult valmistatud proovi RSD oli 2, 51%, mis näitab head korratavust. Seega sobib meetod töötlemata polüsahhariidide kvantifitseerimiseks protsessi optimeerimise ajal.
Cistanche Roucongrongi eelised iidses raamatus
Wecistanche'i tugiteenus – koostöö kohta lisateabe saamiseks
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Ühefaktoriliste uuringute tulemused
Kasutades väljakujunenud HPLC meetodit kombineerituna polüsahhariidide analüüsiga ning võttes hindamisindeksitena sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi, spinosiini ja polüsahhariidide sisaldust ekstraktis, viidi ortogonaalse disaini toetamiseks läbi ühefaktorilised uuringud ekstraheerimistemperatuuri, tahke ja vedeliku suhte ning ekstraheerimisaja kohta.
Ekstraheerimistemperatuuridel 60, 80 ja 100 kraadi suurenes sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi, spinosiini ja toorpolüsahhariidide sisaldus ekstraktides temperatuuri tõustes.
Tahke-vedeliku vahekorras 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 ja 1:12 (g·mL–1) suurenes sidrunhappe, spinosiini ja toorpolüsahhariidide sisaldus suuremate suhetega; ehhinakosiid ja verbaskosiid saavutasid maksimumi 1:10 (g·mL–1) ja vähenesid 1:12 (g·mL–1). Kõigi markeri komponentide kogusisaldus suurenes aga tahke ja vedeliku suhtega.
Ekstraheerimisaegadel 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ja 3,0 tundi varieerusid üksikute analüütide sisaldused erinevalt, kuid markeri komponentide kogusisaldus aja jooksul suurenes.
Üksikasjalikud andmed on esitatud lisamaterjalides. Arvestades tööstuslikku praktilisust (vältides liiga pikka ekstraheerimist), määrati ortogonaalse disaini tegurid ja tasemed nagu tabelis 2 ning ortogonaalne skeem on näidatud tabelis 3.
Tabel 2. Congrong-Zaoren-Wumei joogi ekstraheerimismeetodi ortogonaalse eksperimentaalse disaini teguritasemed
Tegurid:
V: Väljatõmbetemperatuur ( kraadi )
B: tahke ja vedeliku suhe (g ml–1)
C: ekstraheerimisaeg (h)
| Tase | V: Temperatuur (kraad) | B: suhe (g ml–1) | C: aeg (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonaalse disaini tulemused
Ekstraheerimine viidi läbi ortogonaalse massiivi järgi. Sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi, spinosiini ja toorpolüsahhariidide sisaldused on toodud tabelis 3. Vahemiku (R) analüüsi põhjal oli teguri mõju järjekord markerite kogusisaldusele A > B > C, st ekstraheerimistemperatuur > tahke aine ja vedeliku suhe > ekstraheerimisaeg. K väärtuste võrdlemine näitas optimaalset kombinatsiooni A3B3C3: ekstraheerimistemperatuur 100 kraadi, tahke ja vedeliku suhe 1:12 (g·mL–1) ja ekstraheerimisaeg 2 tundi. ANOVA (tabel 4) näitas, et ekstraheerimistemperatuuril oli märkimisväärne mõju kogu markerite sisaldusele, samas kui tahke ja vedeliku suhte ja aja mõju ei olnud oluline.
Tabel 3. Congrong-Zaoren-Wumei joogi ortogonaalne eksperimentaalne ülesehitus ja mõõdetud komponentide sisaldus (mg g-1)
Tegurid: A (temperatuur), B (tahke ja vedeliku suhe), C (aeg)
| Kohtuprotsess nr. | A | B | C | Markerid kokku | Sidrunhape | Spinosiin | ehhinakosiid | Verbascoside | Toorpolüsahhariidid |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K statistika (kogusummade summa teguritaseme kohta)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Vahemik R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Valideerimine ja suurendamine
Protsessi valideerimine optimaalsetes tingimustes andis markeri komponentide keskmiseks kogusisalduseks 119,74 mg·g–1, RSD 0,57%, mis näitab stabiilsust ja usaldusväärsust. Samadel tingimustel läbiviidud suurendamiskatse andis keskmiseks markerite kogusisalduseks 120,89 mg · g–1 ja RSD 0,95%, mis on kooskõlas skaalaeelsete tulemustega, kinnitades veelgi tugevust. Järgnevates unega seotud uuringutes kasutati kolme suuremahulise partii proove; nende keskmised sisaldused olid: sidrunhape 77,73 mg·g–1, ehhinakosiid 2,69 mg·g–1, verbaskosiid 1,03 mg·g–1, spinosiin 0,50 mg·g–1 ja polüsahhariidid 38,93 mg·g–1.
Tabel 4. Ortogonaalsete katsete dispersioonianalüüs
| tegur | Ruudude summa | df | Keskmine ruut | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Ekstraheerimise temperatuur | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Tahke-vedeliku suhe | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Ekstraheerimise aeg | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et al. [16] optimeeris fenüületanoidglükosiidide vesiekstrakti Cistanche tubulosast ja tuvastas optimaalseks 1:15 (g·mL–1), 80 kraadi ja 2 tundi; fenüületanoidglükosiidide sisaldus langes üle 90 kraadi. Käesolevas uuringus saavutas ehhinakosiidi ja verbaskosiidi sisaldus haripunkti suhtega 1:10 (g·mL–1) ja vähenes 1:12 (g·mL–1), kuid suurenes temperatuuridel 60, 80 ja 100 kraadi. See lahknevus võib olla seotud Cistanche deserticola (Cistanche kõrbe) kasutamisega meie joogis ning samaaegselt eksisteerivate Suanzaoreni ja Wumei maatriksiefektidega, mis võivad mõjutada fenüületanoidglükosiidide lahustumist.
Tabel 5. Congrong-Zaoren-Wumei joogiekstrakti mõju otsesele unele hiirtel (n=12)
| Grupp | Loomad kokku | Magavad loomad | Unesagedus (%) |
|---|---|---|---|
| Tühi | 12 | 0 | 0 |
| Estasolaam | 12 | 0 | 0 |
| Madala annusega ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Keskmise annusega ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
| Suure annusega ekstrakt | 12 | 0 | 0 |
Kokkuvõttes optimeerisime HPLC ja fenool-väävelhappe meetodi abil ekstraheerimisprotsessi sidrunhappe, ehhinakosiidi, verbaskosiidi, spinosiini ja polüsahhariidide sisalduse põhjal. Ühefaktorilised ja ortogonaalsed katsed, millele järgnes valideerimine, määrasid optimaalsed tingimused: 100 kraadi, 1:12 (g·mL–1) tahke ja vedeliku suhe ja 2-tunnine ekstraheerimisaeg, mis annab võrdlusaluse tulevaseks tööstuslikuks arenguks.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 aakrit), värske tsistangi ladustamisvõimsus (~ 15 000 tonni) ja GMP-sertifikaadiga tootmistsehhid (100 000-klassi puhasruumid), mis on varustatud täiustatud ultrafiltrimise ja nanofiltratsiooniga puhastamiseks ja kontsentreerimiseks, ning lisaks 10 000-klassiline mikrobioloogialabor. Sertifikaadid hõlmavad Hiina SC, HACCP ja orgaanilisi programme (nt NOP). See infrastruktuur toetab optimeeritud veepõhise ekstraheerimise ja markerite standardimise protokolli otsest tõlkimist funktsionaalsete jookide ja ekstraktide suuremahuliseks ekspordinõuetele vastavaks tootmiseks.
Tabel 6. Ekstrakti mõju naatriumpentobarbitaali hüpnootilisele toimele hiirtel (x̄ ± s, n=12)
| Grupp | Loomad kokku | Magavad loomad | Unesagedus (%) |
|---|---|---|---|
| Tühi | 12 | 1 | 8.33 |
| Estasolaam | 12 | 10 | 83.33** |
| Madala annusega ekstrakt | 12 | 4 | 33.33 |
| Keskmise annusega ekstrakt | 12 | 5 | 41.67 |
| Suure annusega ekstrakt | 12 | 6 | 50.00* |
Märkus. Võrreldes tühja rühmaga * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Ekstrakti mõju hiire käitumisele ja unele
2.2.1 Otsene unerežiim
Nagu on näidatud tabelis 5, ei ilmnenud pärast 30-päevast pidevat manustamist hiirtel estasolaami rühmas ja madala/keskmise/suure annuse ekstrakti rühmades 20 minuti jooksul pärast lõplikku annust ilmset und, ilma märkimisväärsete erinevusteta tühja rühmaga võrreldes. See näitab, et pärast 30-päevast ekstrakti manustamist ei ole otsest und esile kutsuvat toimet.
2.2.2 Käitumuslikud mõjud
Avatud välikatses hinnati rahustitaolist toimet. Mõju kogu läbitud vahemaale ja keskpunkti sisestustele on näidatud joonisel 2. Võrreldes tühja rühmaga suurendas estasolaam kogukaugust ja tsentri sisestusi vastavalt 14,48% ja 31,07%, ilma statistilise olulisuseta. Väikeses annuses ekstrakt suurendas märkimisväärselt kogukaugust 25, 10% võrra (P < 0, 05) ja suurendas mitteoluliselt tsentrite sisenemist 50, 93%. Keskmine annus suurendas oluliselt kogukaugust ja keskpunkti sisenemist 27,09% ja 72,33% võrra (P < 0,05). Suur annus suurendas kogukaugust ja keskpunkti sisenemist vastavalt 15, 60% ja 40, 78%, ilma et see oleks oluline. Võrreldes estasolaamiga suurendasid madalad/keskmised/suured annused kogukaugust 1,73, 1,87 ja 1,07 korda ning tsentraalseid sisestusi vastavalt 1,64, 2,33 ja 1,31 korda, mitte ükski oluline. Need tulemused näitavad, et ekstrakt vähendas ärevustaolist käitumist avamaal pärast 30 päeva möödumist, mis viitab rahustavale toimele.
2.2.3 Naatriumpentobarbitaal-indutseeritud unerežiim
Nagu on näidatud tabelis 6, suurendasid estasolaam ja kõik kolm ekstrakti annust võrreldes tühirühmaga unesagedust naatriumpentobarbitaali alamläviannuse all. Estasolaam suurendas magavate loomade arvu 9 korda võrreldes tühja katsega (P < 0,001). Madala, keskmise ja suure annuse ekstrakti rühmad suurendasid magavate loomade arvu vastavalt 3, 4 ja 5 korda; ainult suur annus saavutas statistilise olulisuse (P < 0,05). Võrreldes estasolaamiga ei näidanud ükski ekstrakti annus tugevamat und esile kutsuvat toimet. Seega võib ekstrakt teatud määral parandada naatriumpentobarbitaali alampiiri poolt esile kutsutud und.
2.2.4 Naatriumpentobarbitaali une latentsus
Võrreldes tühja rühmaga lühendasid estasolaam ja kõik kolm ekstrakti annust märkimisväärselt pentobarbitaalist põhjustatud une latentsust (P <0, 001). Estasolaam vähendas latentsust 58,44% (P < 0,001). Madala, keskmise ja suure annuse ekstrakti rühmad vähendasid latentsust vastavalt 29,59%, 31,42% ja 53,83% (kõik P <0,001). Väikeste ja keskmiste annuste vahel ei olnud olulist erinevust; suur annus lühendas oluliselt latentsusaega võrreldes nii väikeste kui ka keskmiste annustega 34,43% ja 32,69% võrra (P < 0,01), kusjuures toime oli sarnane estasolaamiga (tabel 7). Seetõttu lühendasid kõik kolm annust märkimisväärselt pentobarbitaalist põhjustatud une latentsust, kusjuures kõrge annus toimis kõige paremini.
Traditsioonilised Hiina ravimid sisaldavad erinevaid bioaktiivseid koostisosi, mis toimivad mitmele sihtmärgile, pakkudes ainulaadseid eeliseid unetuse raviks [17]. Kuna uneprobleemidele tähelepanu pööratakse, uuritakse üha enam meditsiinilisi söödavaid TCM-e une modulatsiooni osas [18]. Näiteks peamiselt Suanzaoreni ja Poriast koosnev komposiitjook lühendas hiirtel märkimisväärselt pentobarbitaalist põhjustatud une latentsust ja pikendas une kestust, potentsiaalselt 5-HT, DA ja GABA muutuste kaudu [19]. Siin suurendas ekstrakt märkimisväärselt und pentobarbitaali alamkünnise all ja lühendas pentobarbitaalist põhjustatud une latentsust, soodustades une algust ja vähendades latentsust, ilma et see avaldaks otsest und esile kutsuvat toimet. Mõõdetud esmaste komponentide sisaldused olid kahanevas järjekorras: sidrunhape (77,73 mg·g–1), polüsahhariidid (38,93 mg·g–1), ehhinakosiid (2,69 mg·g–1), verbaskosiid (1,03 mg·g–1) ja spinosiin (0,50 mg·g–1). On näidatud, et spinosiin parandab pentobarbitaalist põhjustatud und; see võib suurendada mitte-REM und ja muuta c-Fos ekspressiooni une-ärkveloleku reguleerivates ajupiirkondades [20], nõrgendada PCPA-indutseeritud unetust, vähendada une latentsust ja pikendada und [21]. Verbascoside on teatanud anksiolüütilisest, hüpnootilisest ja lihaseid lõdvestav toimest [22]. Seevastu peamised koostisosad – sidrunhape, polüsahhariidid (Cistanche, Suanzaoren ja Wumei) ja ehhinakosiid – annavad vähem otseseid teateid une paranemise kohta; hiljutised uuringud TCM-i polüsahhariidide (nt Acanthopanax senticosus polüsahhariidide) kohta viitavad aga potentsiaalsele une kasulikkusele selliste radade kaudu nagu SIRT1/PGC-1 [23]. Seetõttu nõuavad sidrunhappe, polüsahhariidide ja ehhinakosiidi rollid une modulatsioonis edasist uurimist.
7. Ekstrakti mõju naatriumpentobarbitaali poolt indutseeritud une latentsusele hiirtel (x̄ ± s, n=12)
| Grupp | Loomad kokku | Unerežiimi latentsus (min) |
|---|---|---|
| Tühi | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estasolaam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Madala annusega ekstrakt | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Keskmise annusega ekstrakt | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Suure annusega ekstrakt | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Märkused:
Võrreldes tühja rühmaga: ** P < 0,0001.
Võrreldes suure annuse ekstrakti rühmaga: # P < 0,01.
3 Järeldus
Kasutades Congrong-Zaoren-Wumei joogi valmistamiseks meditsiinilisi söödavaid TCM-e Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen ja Mume Fructus, optimeerisime selle ekstrakti valmistamise protsessi, kasutades nelja markerkomponendi (ehhinakosiid, verbaskosiid, spinosiin, sidrunhape) ja hindamispolüsahhariidide sisu. Optimaalseteks ekstraheerimistingimusteks määrati 100 kraadi, tahke ja vedeliku suhe 1:12 (g·mL–1) ja 2 tundi, andes teoreetilised juhised tööstuslikuks tootmiseks. Täiendav hindamine näitas, et 30-päevasel pideval manustamisel ei olnud hiirtel otsest und esile kutsuvat toimet, kuid see vähendas märkimisväärselt ärevustaolist käitumist avatud välitestis (viitab rahustavale toimele), parandas und naatriumpentobarbitaali alamläviannuse all ja lühendas märkimisväärselt pentobarbitaalist põhjustatud une latentsust. Need leiud näitavad, et optimeeritud protsessi käigus valmistatud ekstraktil on hiirtel soodne und parandav toime, mis annab teadusliku aluse Cistanche-põhiste und parandavate tootesarjade väljatöötamiseks.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 aakrit; Värske tsitanche ladustamine ~15 000 tonni) toetab tooraine konsistentsi ja rahvusvaheliste standardite kvaliteedikontrolli, hõlbustades USA/EL-i ootustele vastavate funktsionaalsete jookide ja terviselisandite turustamist.
