Cistanche Deserticolast eraldatud oligosahhariidide koostise analüüs ja immunoloogiline tegevus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Abstraktne.Oligosahhariid (CDOS) saadiCistanche deserticolaleeliselise (pH=10) ekstraheerimise, etanooli sademete ja sephadex G-25 kolonnifiltratsiooni kromatograafia poolt kaheks puhastatud fraktsiooniks (st CDOS-1 ja CDOS-2). CDOS-i monosahhariidi koostist analüüsiti suure jõudlusega vedela kromatograafiaga (HPLC). Leiti, et CDOS-1 koosnes ainult sahharoosist ja CDOS-2 koosnes peamiselt sahharoosist, raknoosist ja mannitoolist, mille mooli suhe oli 1:0,73:3,61. Immunoloogilised testid näitasid, et CDOS avaldas olulist mõju hiire põrna indeksile, suurendades makrofaagide fagotsütoosi aktiivsust ja stimuleerides antikehi tootvate rakkude vohamist. Loodetakse, et CDOS arendatakse funktsionaalseks toiduks või ravimiks.

Märksõnad:Cistanchedeserticola, oligosahhariid, puhastamine, koostis, immunoloogiline tegevus.

Cistanche deserticola'l on palju efekte, klõpsake siin, et rohkem teada saada

1. Sissejuhatus

CistancheDeserticola Y.C.Ma. (Perekond Orobanchaceae) on lühike parasiittaim, mis on pärit Hiina loodeosas. Kogu kuivatatud taim (ilma lilledeta) on tuntud kui toonik ja seda nimetatakse "Rou Congrong". Idamaises meditsiinis on see klassifitseeritud magusaks ja soolaseks maitse järgi, looduses soojaks ning neerude ja jämesoole kanalitele omistavaks, mille funktsiooniks onKosutavatneerja täiendades olemust, niisutades soolestikku ja lõdvestades soolestikku [1]-[3]. Kaasaegne farmakoloogiline uuring näitas, et see võib ajendada DNA sünteesi ja edasi lükata seniilsuse protsessi, suurendada antioksüdatiivset [4] , ennetada ja ravida südame-veresoonkonna haigusi [3]. Lisaks võib see põhjustada ka valuvaigistavat jaanti-Põletikulinemõju [5], parandada õppimist ja mälu, tekitades närvi kasvufaktoreid [6]. Mõned uuringud näitasid, et C. deserticola ekstraktid võivad aktiveerida kõhusisese makrofaagi fagotsüütilist funktsiooni hiirtel [7]-[9] jasuurendadakeha"sImmuunsus[10]. Varasemate uuringute kohaselt sisaldab see taim mitmeid aktiivseid koostisosi, mille hulka kuuluvad fenüületanoidi glükosiidid, iridoidid, lignanid, sahhariidid, alkaloidid jne [11] Nagu C.deserticolafenüületanoidiGlükosiididja polüsahhariide peetakse peamisteks aktiivseteks komponentideks, paljud uuringud on viimastel aastakümnetel keskendunud nende struktuuridele ja bioaktivismile [12]-[17]. Mis puutub väärtuslikesse oligosahhariididesseC. deserticola, aruanded on üsna piiratud. Oligosahhariidid, homo- või heterosuhkureid sisaldav lühikese ahelaga sahhariid, on tuntud oma kasuliku mõju poolest inimelule ja neid on pikka aega laialdaselt kasutatud [18]. Funktsionaalsed oligosahhariidid, millel on füsioloogiline funktsioon, nagu madal karogeensus ja bifidobakterite kasvufaktor, [19] parandavad inimeste ja loomade tervist. Neid on kasutatud toidu koostisosana. Hiljuti on teatatud oligosahhariidide uutest funktsioonidest, millel on võime moduleerida immuunsüsteemi inimestel, loomadel ja kaladel [20]. Käesolevas artiklis teatame uurimisprogrammi tulemuste esimesest osast, C. deserticola leelisekstraktist saadud oligosahhariidide fraktsioneerimise ultrafiltratsiooni ja geeli läbilaskvuse kromatograafia kombinatsiooniga ning nende koostise analüüsist suure jõudlusega vedela kromatograafia (HPLC) abil. Lisaks tutvustame ka C. deserticola oligosahhariidide immunoloogilist tegevust. Meile teadaolevalt on avaldatud vähe aruandeid immunostimuleerivate aktiivsusuuringute kohta.C. deserticolaoligosahhariidid.

2. Eksperimentaalne

2.1. Materjalid

C. deserticola kasvatati ja koguti Alxa Liigast (Sise-Mongoolia, Hiina). Kunmingi hiired (GradeII, kuus nädalat vanad) osteti Sise-Mongoolia ülikooli farmakoloogia eksperimentaalkeskusest. Sephadex G-100,Sephadex G-25, trifluoroaakeetiline hape (TFA), 1-fenüül-3-metüül-5- pürosoloon(PMP), D-glükoos, D-galaktoos, D-fruktoos, D-ksüloos, D-ksüloos, D-galakturoonhape, D-galakturoonhape, D- glükuroonhape, sahharoos, mentos, mannitool, fukoos, phanose, osteti Sigmast (St. Louis, MO, USA). Medium RPMI-1640 osteti Gibco Invitrogen Co.-lt (San Diego, CA, USA). Kõik muud kemikaalid olid analüütilise kvaliteediga.

2.2. Oligosahhariidide ekstraheerimine

C. deserticola kuivatatud kehad lõigati väiksemateks tükkideks ja jahvatati veski poolt pulbriks, ekstraheeriti veevaba etanooliga (3×5000 ml) 70° juures 3 tunni jooksul atmosfäärirõhul. Lipiidide eemaldamiseks kinnitati reflukskondensaator. Järelejäänud jääk ekstraheeriti seejärel leelisega (pH=10) 60 °C juures 3 korda (iga kord 2 tundi). Pärast tsentrifuugimist (2000 g 15 minutit, 20°) kontsentreeriti supernatant 50 °C juures vähendatud rõhu all pöörlevas aurustis ühe kümnendiku mahust ja filtreeriti. Seejärel deproteineeriti filtraat Sevagi reaktiivi abil [21] ja värviti aktiivsöega.

2.3. Oligosahhariidide isoleerimine ja puhastamine

Külmkuivatatud tooroligosahhariidid lahustati destilleeritud vees, tsentrifuugiti ja seejärel puhastati supernatant Sephadex G-100 kolonniga (1×50 cm), mis oli tasakaalus ultrapure veega. Pärast prooviga laadimist jäi kolonn ultrapure veega voolukiirusel 5 ml/min. Katseklaaside abil koguti erinevaid fraktsioone. Iga toru süsivesikute kogusisaldust mõõdeti fenooli-H2SO4 meetodil 490nm juures [22]. Veepuuduses olev lahus eraldati kaheks fraktsiooniks CDOS-1 ja CDOs-2. Sephadex G-25 kolonnil (2,7×85 cm) puhastati vastavalt kaks fraktsiooni, kasutades ultrapure vett (voolukiirusega 1 ml/min). Pärast puhastatud fraktsiooni kogumist oli see lüofiliseeritud.

2.4. Monosahhariidi koostise analüüs

CDOde monosahhariidi koostis saavutati HPLC analüüsiga. CDOd (2 mg) hüdrolüüsiti kõigepealt veevaba metanooliga, mis sisaldas 2 M HCl 80 °C juures 16 h lämmastiku atmosfääris ja seejärel 2 M TFA-ga 120 °C juures 1 h. Pärast TFA eemaldamist aurustumise teel deradiveeriti hüdrolüüsid seejärel PMP-ga vastavalt teatatud meetodile [23] ja hplc analüüsis neid. HPLC eraldamine toimus EF-2002 HPLC süsteemis (KNAUER ettevõte, Saksamaa). PMP derivaadid kromatograafiliselt kasutati Sugar-PAK mahtu (6,5×300mm, klaasid veefirmat, Ameerika) ja neeldumist mõõdeti 245 nm juures. Süstimismaht oli 20 μl ja liikuvat faasi, mis koosnes PBS-ist (lahusti A) ja atsetonitrioolist (lahusti B), kasutati isokraatlikuks elutsiooniks mahu suhtega 82% (A) kuni 18% (B). HPLC kogu tööaeg oli 40 min ja voolukiirus 0,5 ml/min.

2.5. Immunobioloogilised tegevused

2.5.1. Monotsüütide-makrofaagi fagotsüütiline funktsioon

Kuuskümmend Kunmingi hiirt (GradeII, kuus nädalat vana) osteti Sise-Mongoolia ülikooli farmakoloogia eksperimentaalkeskusest ja neid aklimatiseeruti 1 nädal enne kasutamist. Kõik hiired jagati juhuslikult nelja rühma, mis koosnes soolalahuse kontrollrühmast, kõrgest CDOde annuserühmast, mõõdukast annustamisrühmast ja madalast CDOde annuserühmast. Hiirtele süstiti intraperitoneaalselt 0,5 ml oligosahhariidide lahust üks kord päevas 5 päeva jooksul. Kõrge, mõõduka või madala CDOd annustamisrühm sai vastavalt 100, 50 või 25 mg/kg/BW CDOd; kontrollrühma süstiti 0,5 ml soolalahust. Seitsmendal päeval viidi Hou sõnul läbi süsinikuosakeste kliirensi eksperiment [24] ning mõõdeti põrnaindeksit ja tüümuse indeksit. Lühidalt, 0,05 ml / 10 g / bw India tint süstiti igasse hiirse vena caudalise kaudu, seejärel saadi 20 μL veri vena orbitalis tagumisest 3 ja 7 minutit pärast süstimist. Vereproovid paigutati torudesse 2mL 0,1% Na2CO3-ga ja OD väärtusteks mõõdeti 600 nm. Kliirensiindeks (K), fagotsüütiindeks (α) ja immuunorganite indeks arvutati järgmiselt(1), t2 ja t1 tähendab vastavalt 7 minutit ja 3 minutit.

2.5.2. Antikehi tootvate rakkude vohamine

Kunmingi hiirte rühmad (viis rühma kohta) immuniseeriti intraperitoneaalse süstimisega 2 x 107 SRBC 1,0 ml PBS-i, millele lisati 50ug katsematerjale (ükski kontrollrühmas ei osalenud). Nädal hiljem kasvatati Kunmingi hiirte splenotsüüte (106 rakku 2 ml kohta kaevu kohta) katsematerjalidega või ilma 72 h katsematerjalidega 10% RPMI 1640 keskmises alla 5% CO2 õhus, kolmekordselt iga kultuuri jaoks. PFC arv SRBC vastu 106 splenotsüüdi kohta määrati [25], [26].

2.6. Statistiline analüüs

Andmeid väljendati keskmiste väärtustena ±SD. Erinevust testitud rühmade ja kontrolli vahel analüüsiti õpilase t-testiga. P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="">

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Oligosahhariidide isoleerimine ja puhastamine

CDOd eraldati C. deserticola kuivatatud kehade leeliseekstraktist 3,07% saagikusega. Kaks murdosa CDOS-1-st ja CDOS-2-st eraldati destilleeritud vee elutest vastavalt Sephadex G-100 kolonniga (joonis 1). CDOS-1 ja CDOS-2 puhastatud fraktsioonid näitasid Sephadex G-25 veerus ühte tippu, mis näitab, et proovis ei olnud teisi oligosahhariide. Monosahhariidikompositsioonide tulemused näitasid, et CDOS-1 koosnes ainult sahharoosist (joonis 2) ja CDOS-2 koosnes peamiselt sahharoosist, phanoosist ja mannitoolist (joonis 3), mooli suhe oli 1:0,73:3.61.

3.2. CDOde immunobioloogiline tegevus

Paljud in vivo ja in vitro tõendid on näidanud, et looduslikud oligosahhariidid näitasid immunomoduleerivat funktsiooni, stimuleerides nii rakulist kui ka humoraalsetImmuunsüsteemi Vastused[27], [28]. Selles dokumendis suurendasid hiire põrnaindeksit 100 mg/kg/BW CDOd, kuid ravitud rühmade ja kontrollrühmade vahel ei olnud tüümuse indeksis olulisi erinevusi(tabel 1). Makrofaagid on oluline osa peremeesorganismide kaitsest viirusinfektsiooni vastu, pärssides viiruste rakusisest replikatsiooni ja tappes viirusega nakatunud rakke [29]. Aktiveerimisel vabanevad makrofaagidest mitmesugused hapniku- või lämmastikuvaheained ja tsütokiinid ning nad osalevad mitmesugustes olulistes bioloogilistes funktsioonides, nagu põletikuvastane ja kasvajavastane toime [30]-[32]. Seetõttu on makrofaagide fagotsüütiline aktiivsus organismi immuunfunktsioonide oluline näitaja. Selles uuringus suurendasid CDOde mõõdukad ja suured annused makrofaagide fagotsütoosi aktiivsust (tabel 1). CDOde poolt indutseeritud antikehi tootvate rakkude vohamist uuriti hemolüütilise PFC suurenemise uurimisel Kunmingi hiirte spleensis, mis immuniseeriti SRBC-ga pluss katseproov. Tulemused näitasid, et cdode mõõdukad ja suured annused suurendavad oluliselt antikehi tootvate rakkude vohamist (tabel 2). Cdode suured annused põhjustasid PFC-de arvu väga olulise suurenemise (P<>

Viited

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Waveleti analüüsi põhjal segatud bioloogilise signaali äratundmine. In: Y. Jiang, et al (toim). Ühendkuningriigi-Hiina sporditehnika töötoa proc. Liverpool: Maailma Akadeemiline Liit. 2007, lk 1–8.

[2] J. Ouyang, X.D. Wang, B. Zhao jt. Haruldaste muldmetallide elementide mõju Cistanche deserticola rakkude kasvule ja fenüületanoidi glükosiidide tootmisele. J B io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian jt. Cistanche deserticola uus looduslik toode Y.C.MA. Hiina farmaatsiateaduste ajakiri, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Tsistanche glükosiidide antioksüdatiivne toime hiirte kudedes. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin L.W, Hsieh M.T, Tsai F.H, Wang W.H, Wu C.R.Tsitsiceptiivne ja põletikuvastane toime, mida põhjustab Cistanche deserticola närilistel. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, J.G; Kuu, M; Jeong, H.U; Kim, M.C; Kim, S.Y; Oh, M.S. Cistanches Herba parandab õppimist ja mälu, tekitades närvi kasvufaktorit. Käitumuslik ajuuuringud. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Tsistanche deserticola Y. C. Ma ja C võrdlus, tubulosa (Shenk) Wight mõnel farmakoloogilisel tegevusel. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] Ta W, Shu X.F, Zeng G.Z, et al. Uuring C. deserticola soo potentsi suurendamiseks. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng G.Z, He W, Wu G.L jt. Cistanche deserticola Y. C. Ma ja C.tubulosa kaalu võrdlus mõnede farmakoloogiliste tegevuste puhul. J Chin Med. 1996, lk 21(7): 436-438.

[10] Zeng Q.L, Zheng Y.F, Lu Z.L. Cistanche deserticola Y. C. Ma polüsahhariidi immunomoduleerivad toimed. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Edusammud Cistanche keemiliste koostisosade ja meditsiinilise aktiivsuse uurimisel. Hiina looduslikud taimevarud, 2010, lk 29(1):7-11.

[12] Du N.S, Wang H, Yi YH. Fenüületanoidi glükosiidide isoleerimine ja identifitseerimine Cistanche deserticolast. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu N.S, Liu J.L. Fenüületanoidi glükosiidide määramine Tsistanche deserticolas makroretikulaarse vaigu- spektrofotomeetria abil. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong Q.B, Tezuka Y, Kaneko T jt. Lämmastikoksiidi inhibeerimine fenüületanoidide poolt aktiveeritud makrofaagides.

Euroopa Farmakoloogia Ajakiri, 2000, 400: 137-144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan jt Vees lahustuva polüsahhariidi SPA struktuurne analüüs Eraldatud Cistanche Deserticola Ma varrest. Hiina ülikoolide keemiaajakiri, 2005, lk 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Uuring Cistanche deserticola polüsahhariidide immuunfarmakoloogia ja imendumise iseloomu kohta. 2011, nr.S1, Meditsiini- ja terviseteadused, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektiivne aktiivsus fenüületanoidide cistanche deserticola. Planta Med. 1998, lk 64(2):120-5.

[18] Amülaaslaste ja nendega seotud ensüümide käsiraamat (toim. Jaapani Amylase Research Society poolt), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (toim.) Hambakaariese ja sidumissuhkru viienda konverentsi toimetised (jaapani keeles), Riiklik Terviseinstituut, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Funktsionaalne oligosahhariid ja selle uus aspekt immuunmodulatsioonina. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polüsahhariidid röstitud Coffea arabica ubade kuumavee ekstraktidest: isolatsioon ja iseloomustus. Karbohüdr. Polüm.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers PA, Smith F. Colorimetric meetod suhkrute ja nendega seotud ainete määramiseks. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Angelica polüsahhariidide monosahhariidide komponentide analüüs suure jõudlusega vedela kromatograafia abil. Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan jt. Lektiini ekstraheerimine ja puhastamine punase neeru oa ja Lektiini ja nelja Hiina taimse polüsahhariidi esialgsetest immuunfunktsioonide uuringutest. Biomeditsiini ja biotehnoloogia ajakiri, 2010:1-9.

Cunningham, A. J. ja A. Szenberg. Naastude tehnika edasine täiustamine üksikute antikehade moodustavate rakkude avastamiseks. Immunoloogia.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura jt Porini fraktsiooni immunobioloogilised tegevused eraldatud Fusobacterium nukleatum ATCC 10953 [J]. Infektsioon ja immuunsus. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang M.Q, Guilbert L.J, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu S.R, Pang P, Shan J.J. CVT- E002 immunomoduleeriv tegevus: patenteeritud väljavõte Põhja-Ameerika ženšennist (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard C.S, Kiyohara H, Reynolds J.C, Thomas-Oates J.E, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen B.S. Mali antiulcer taimedest Cochlospermum tinctorium A. Rich ja Vernonia kotschyana Sch Bip kolme mitogeense ja täiendust fikseeriva pektilise arabinogalaktaani struktuurid ja struktuuri-aktiivsuse suhted. endine Walp. Biomakromolekulid. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim ja J.-K. Hwang, Arabinogalactani ja Fucoidani immunomoduleeriv aktiivsus in vitro. Meditsiinilise toidu ajakiri. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian jt. Angelica Sinensise in vitro nelja vees lahustuva fraktsiooni immunoregulatiivse aktiivsuse hindamine ja võrdlemine ICR-hiirte kõhukelme makrofaagidel. Rahvusvaheline immunofarmakoloogia. 2010, 10:422–430.

[31] Y. S. Lee, O. K. Han, C. W. Park jt. Põletikuvastane tsütokiini geeniekspressioon ja vesiekstrakteeritud Astragali radiksi lämmastikoksiidi regulatsioon RAW 264.7 makrofaagirakkudes. Etnofarmakoloogia ajakiri. 2005, 100(3): 289–294.

[32] K. Y. Lee ja Y. J. Jeon. Poria cocos sclerotiumist eraldatud polüsahhariid indutseerib NF-κB/ Rel aktiveerimist ja iNOS ekspressiooni murine makrofaagides. Rahvusvaheline immunofarmakoloogia. 2003, 3(10-11):1353–1362.