Cistanche Deserticolast eraldatud oligosahhariidide koostise analüüs ja immunoloogiline aktiivsus

Kuidas parandada mälu ilma ravimiteta?

Lisateabe saamiseks võtke ühendustali.ma@wecistanche.com

Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1Toiduteaduse ja tehnika kolledž, Sise-Mongoolia Põllumajandusülikool, Hohhot 010018, Hiina

Abstraktne:Oligosahhariid (CDOS) saadi ettevõttestCistanche deserticolaleelise (pH{0}}) ekstraheerimise, etanoolisadestamise ja fraktsioneerimise teel Sephadex G-100 abil kaheks puhastatud fraktsiooniks (st CDOS-1 ja CDOS-2) ja Sephadex G-25 kolonnfiltratsioonikromatograafia. CDOS-i monosahhariidide koostist analüüsiti kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil. Leiti, et CDOS-1 koosnes ainult sahharoosist ja CDOS-2 koosnes peamiselt sahharoosist, ramnoosist ja mannitoolist, moolisuhtega 1:0,73:3,61. Immunoloogilised testid näitasid, et CDOS avaldas olulist mõju hiire põrna indeksile, suurendades makrofaagide fagotsütoosi aktiivsust ja stimuleerides antikehi tootvate rakkude proliferatsiooni. CDOS-st loodetakse arendada funktsionaalne toit või ravim.

Märksõnad:Cistanche deserticola, oligosahhariid, puhastamine, koostis, immunoloogilised aktiivsused.

Tsüstanche ekstrakti eelised toodetele klõpsake

1. Sissejuhatus

Cistanche deserticolaYCMa.(PerekondOrobanchaceae) on lühike parasiitaim, mis pärineb Loode-Hiinast. Tervet kuivatatud taime (ilma õiteta) tuntakse toonikuna ja seda nimetatakse "Rou Congrong".Idamaises meditsiinis klassifitseeritakse see magusa ja soolase maitsega, olemuselt soojaks ning neerude ja jämesoole kanalite jaoks, mille funktsioon on neerude turgutamine ja essentsi täiendamine, soolestikku niisutav ja soolestikku lõõgastav funktsioon [1] -[3] Kaasaegne farmakoloogiline uuring näitas, et see võib kiirendada DNA sünteesi ja aeglustada seniilsuse protsessi, suurendada antioksüdantset toimet [4], ennetada ja ravida südame-veresoonkonna haigusi [3]. Lisaks võib see põhjustada ka valuvaigistit ja antioksüdante. -põletikulised mõjud [5], parandavad õppimist ja mälu, kutsudes esile närvikasvufaktoreid.Mõned uuringud näitasid, etC. deserticola ekstraktid võivad aktiveerida intraabdominaalsete makrofaagide fagotsüütilist funktsiooni hiirtel [7]–[9] ja tugevdada keha immuunsust. Varasemate uuringute kohaselt sisaldab see taim mitmeid aktiivseid koostisosi, sealhulgas fenüületanoidglükosiide, iridoide, lignaane, sahhariide, alkaloide jne. [11]C. deserticola fenüületanoidglükosiide ja polüsahhariide peetakse peamisteks aktiivseteks komponentideks, nende struktuuridele ja bioaktiivsusele on viimastel aastakümnetel keskendunud arvukad uuringud [12]–[17]. Mis puudutab väärtuslikke oligosahhariideC. deserticola, on aruanded üsna piiratud. Oligosahhariidid, homo- või heterosuhkrut sisaldavad lühikese ahelaga sahhariidid, on hästi tuntud oma kasuliku mõju poolest inimelule ja neid on laialdaselt kasutatud juba pikka aega [18]. Funktsionaalsed oligosahhariidid, millel on füsioloogiline funktsioon, nagu madal kariogeensus ja bifidobakterite kasvufaktor [19], parandavad inimeste ja loomade tervist. Neid on kasutatud toidu koostisosana. Hiljuti on teatatud oligosahhariidide uutest funktsioonidest, millel on võime moduleerida inimeste, loomade ja kalade immuunsüsteemi [20]. Käesolevas artiklis käsitleme uurimisprogrammi tulemuste esimest osa, fraktsioneerimist. aasta leeliseekstraktist saadud oligosahhariidide koguarvustC. deserticolakombineerides ultrafiltratsiooni ja geelkromatograafiat ning nende koostise analüüsi kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil. Lisaks tutvustame ka selle immunoloogilisi aktiivsusiC. deserticolaoligosahhariidid. Meile teadaolevalt on avaldatud vähe aruandeid immunostimuleeriva aktiivsuse uuringute kohtaC. deserticola oligosahhariidid.

2. Eksperimentaalne

2.1. Materjalid

TheC. deserticola kasvatati ja koguti Alexa League'ist (Sise-Mongoolia, Hiina). Kunmingi hiired (GradeII, kuue nädala vanused) osteti Sise-Mongoolia ülikooli farmakoloogia katsekeskusest. Sephadex G-100, Sephadex G-25, trifluoroäädikhape (TFA), 1-fenüül-3-metüül-5- pürasoloon (PMP), D-glükoos, D- galaktoos, D-fruktoos, D-ksüloos, D-mannoos, D-galakturoonhape, D-glükuroonhape, sahharoos, ramnoos, mannitool, fukoos, ramnoos osteti firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA). Keskmine RPMI{12}} osteti ettevõttelt Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Kõik muud kemikaalid olid analüütilise kvaliteediga.

2.2. Oligosahhariidide ekstraheerimine

Kuivatatud kehadC. deserticola lõigati väiksemateks tükkideks ja jahvatati edasi veskis pulbriks, ekstraheeriti veevaba etanooliga (3 × 5000 ml) 70 kraadi juures 3 tundi atmosfäärirõhul. Lipiidide eemaldamiseks fikseeriti püstjahuti. Järelejäänud jääki ekstraheeriti seejärel leelisega (pH{4}}) 60 kraadi juures 3 korda (iga kord 2 tundi). Pärast tsentrifuugimist (2000 g 15 minutit, 20 kraadi juures) kontsentreeriti supernatant ühe kümnendiku mahust pöördaurustis alandatud rõhul 50 kraadi juures ja filtriti. Seejärel filtraat deproteiniseeriti Sevag reagendiga [21] ja värviti aktiivsöega.

2.3. Oligosahhariidide eraldamine ja puhastamine

Külmkuivatatud tooroligosahhariidid lahustati destilleeritud vees, tsentrifuugiti ja seejärel puhastati supernatant Sephadex G-100 kolonnis (1 × 50 cm), mis oli tasakaalustatud ülipuhta veega. Pärast prooviga laadimist elueeriti kolonn ultrapuhta veega voolukiirusel 5 ml/min. Erinevad fraktsioonid koguti katseklaaside abil. Iga katseklaasi süsivesikute kogusisaldus mõõdeti 490 nm juures fenool-H abil₂NII₄meetod [22]. Veega elueeritud lahus jagati kaheks fraktsiooniks CDOS-1 ja CDO-2. Kaks fraktsiooni puhastati täiendavalt Sephadex G-25 kolonnis (2,7 × 85 cm), kasutades ülipuhast vett (voolukiirusel 1 ml/min). Pärast puhastatud fraktsiooni kogumist see lüofiliseeriti.

2.4. Monosahhariidide analüüs koostis

CDO-de monosahhariidide koostis saadi HPLC analüüsiga. CDO-sid (2 mg) hüdrolüüsiti esmalt veevaba metanooliga, mis sisaldas 2 M HCl 80 kraadi juures 16 tundi lämmastikuatmosfääris ja seejärel 2 M TFA-ga 120 kraadi juures 1 tund. Pärast TFA eemaldamist aurustamisega derivatiseeriti hüdrolüsaadid PMP-ga vastavalt kirjeldatud meetodile [23] ja analüüsiti HPLC abil. HPLC eraldamine viidi läbi EF-2002 HPLC süsteemiga (firma KNAUER, Saksamaa). PMP derivaadid kromatografeeriti, kasutades Sugar-PAK mahtu (6,5 × 300 mm, veeettevõtte klaasid, Ameerika) ja neeldumist mõõdeti 245 nm juures. Süstimismaht oli 20 ui ja liikuvat faasi, mis koosnes PBS-st (lahusti A) ja atsetonitriilist (lahusti B), kasutati isokraatseks elueerimiseks mahusuhtega 82% (A) kuni 18% (B). Kogu HPLC tööaeg oli 40 minutit ja voolukiirus oli 0,5 ml/min.

2.5. Immunobioloogiline Tegevused

2.5.1. Monotsüütide-makrofaagide fagotsüütiline funktsioon

Kuuskümmend Kunmingi hiirt (II klass, kuue nädala vanused) osteti Sise-Mongoolia ülikooli farmakoloogiaeksperimentaalkeskusest ja neid aklimatiseeriti 1 nädal enne kasutamist. Kõik hiired jagati juhuslikult nelja rühma, mis koosnesid soolalahuse kontrollrühmast, kõrge CDO-de annuste rühmast, mõõduka annuse rühmast ja madala CDO-de annuste rühmast. Hiirtele süstiti intraperitoneaalselt 0,5 ml oligosahhariidide lahust üks kord päevas 5 päeva jooksul. Suurte, mõõdukate või madalate CDO-de annuste rühm sai vastavalt 10{{10}}, 50 või 25 mg/kg kehamassi kohta; ja kontrollrühma süstiti 0,5 ml soolalahust. Seitsmendal päeval viidi läbi Hou [24] järgi süsinikuosakeste kliirensi katse ning mõõdeti põrna indeks ja harknääre indeks. Lühidalt, igasse hiiresse süstiti vena caudalis'e kaudu 0, 05 ml / 10 g / bw India tinti, seejärel saadi vena orbitalis posterior 3 ja 7 minutit pärast süstimist 20 μl verd. Vereproovid pandi tuubidesse, milles oli 2 ml 0,1 protsenti Na₂CO₃ja OD väärtused mõõdeti 600 nm juures. Kliirensi indeks (K), fagotsüütiline indeks ( ) ja immuunorgani indeks arvutati järgmiselt (1), t₂ja t₁tähendab vastavalt 7 minutit ja 3 minutit.

2.5.2. Antikehi tootv rakk levik

Kunmingi hiirte rühmad (viis rühma kohta) immuniseeriti 2 x 10 intraperitoneaalse süstiga.⁷SRBC 1.0 ml PBS-s, millele on lisatud 50 ug testmaterjale (kontrollis ei olnud ühtegi). Nädal hiljem splenotsüüdid (10⁶Kunmingi hiirtelt saadud rakke 2 ml süvendi kohta) kultiveeriti koos testitavate materjalidega või ilma 72 tundi 10% RPMI 1640 söötmes 5% CO juures.₂õhus, iga kultuuri kohta kolmes eksemplaris. PFC arv SRBC vastu 10 kohta⁶splenotsüüdid määrati.

2.6. Statistiline analüüs

Andmed väljendati keskmiste väärtustena ± SD. Erinevusi testitud rühmade ja kontrolli vahel analüüsiti Studenti t-testiga. P < 0,05="" loeti="">

3. Tulemused ja Arutelu

3.1. Oligosahhariidide eraldamine ja puhastamine

CDO-d eraldati kuivatatud kehade leeliseekstraktistC. deserticola tootlusega 3.{14}}7 protsenti . Sephadex G-100 kolonni abil eraldati destilleeritud vee eluaadist vastavalt kaks fraktsiooni CDOS-1 ja CDOS-2 (joonis 1). CDOS-1 ja CDOS-2 puhastatud fraktsioonid näitasid Sephadex G-25 kolonnis ühte piiki, mis näitab, et teisi oligosahhariide proovis ei esinenud. Monosahhariidide koostiste tulemused näitasid, et CDOS-1 koosnes ainult sahharoosist (joonis 2) ja CDOS-2 koosnes peamiselt sahharoosist, ramnoosist ja mannitoolist (joonis 3) moolisuhtega. 1:0,73:3,61-st.

3.2. CDO-de immunobioloogiline aktiivsus

Paljud in vivo ja in vitro tõendid on näidanud, et looduslikud oligosahhariidid avaldasid immunomoduleerivat funktsiooni, stimuleerides nii rakulist kui humoraalset immuunvastust [27], [28]. Selles artiklis suurendasid 100 mg/kg/bw CDO-d hiire põrnaindeksit, kuid tüümuse indeksis ei olnud ravitud rühmade ja kontrollrühmade vahel olulisi erinevusi (tabel 1). Makrofaagid on oluline komponent peremeesorganismi kaitsemehhanismides viirusnakkuse vastu, pärssides viiruste rakusisest replikatsiooni ja tappes viirusega nakatunud rakke [29]. Aktiveerimisel vabanevad makrofaagidest mitmesugused hapniku või lämmastiku vaheühendid ja tsütokiinid, mis osalevad mitmesugustes olulistes bioloogilistes funktsioonides, nagu põletiku- ja kasvajavastased toimed [30]–[32]. Seetõttu on makrofaagide fagotsüütiline aktiivsus organismi immuunfunktsioonide oluline näitaja. Selles uuringus suurendasid CDO-de mõõdukad ja suured annused makrofaagide fagotsütoosi aktiivsust (tabel 1). CDO-de poolt indutseeritud antikehi tootvate rakkude proliferatsiooni uuriti, uurides hemolüütilise PFC suurenemist Kunmingi hiirte põrnades, keda immuniseeriti SRBC-ga pluss testitava prooviga. Tulemused näitasid, et mõõdukad ja suured CDO-de annused suurendavad märkimisväärselt antikehi tootvate rakkude proliferatsiooni (tabel 2). CDO-de suured annused põhjustasid PFC arvu väga olulise suurenemise (P <0,>

Viited

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Segatud bioloogiliste signaalide tuvastamine laineanalüüsi põhjal. Väljaandes: Y. Jiang et al (toim.).Proc. Ühendkuningriigi-Hiina sporditehnika töökojast. Liverpool: Maailma Akadeemiline Liit. 2007, lk 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao jt. Haruldaste muldmetallide elementide mõju kasvuleCistanche deserticolarakud ja fenüületanoidglükosiidide tootmine.JB io-tehnoloogia, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian jt. Uus looduslik toode alatesCistanche deserticolaYCMA. Hiina farmaatsiateaduste ajakiri,1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Glükosiidide antioksüdatiivne toimeCistanchehiirte kudedes.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA antinotsitseptiivne ja põletikuvastane toime, mis on põhjustatudCistanche deserticolanärilistel.J Etnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Kuu, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbaparandab õppimist ja mälu, kutsudes esile närvikasvufaktori.Käitumuslik ajuuuring. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. VõrdlusCistanche deserticolaYC Ma ja C,tubulosa(Shenk) Wight mõnel farmakoloogilisel toimel.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ jt. Uuring seksuaalse potentsi suurendamise kohtaC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL jt. Võrdlused vahelCistanche deserticolaYC Ma ja C.tubulosa mõjutavad mõningaid farmakoloogilisi toimeid.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL polüsahhariidide immunomoduleerivad toimed.Cistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Edusammud Cistanche keemiliste koostisosade ja meditsiinilise tegevuse uurimisel.Hiina looduslikud taimeressursid, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Fenüületanoidglükosiidide eraldamine ja identifitseerimineCistanche deserticola.

Nat Prod teadus- ja arendustegevus, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Fenüületanoidglükosiidide määramine inCistanche deserticolamakrovesikulaarse vaigu spektrofotomeetria abil.Nat Prod teadus- ja arendustegevus, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T jt. Lämmastikoksiidi inhibeerimine fenüületanoidide poolt aktiveeritud makrofaagides.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan jt. Cistanche Deserticola Ma varrest eraldatud vees lahustuva polüsahhariidi SPA struktuurianalüüs.Hiina ülikoolide keemiline ajakiri, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Uuring polüsahhariidide immuunfarmakoloogia ja imendumise kohtaCistanche deserticola. 2011, nr S1,Meditsiin ja terviseteadused, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Fenüületanoidide hepatoprotektiivne aktiivsus alatesCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (Toim.: The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (toim.) Proceedings of the 5^thHambakaariese ja sellega seotud suhkru konverents (jaapani keeles), Tokyo riiklik terviseinstituut (1980)

[20] Kodo Otaka. Funktsionaalne oligosahhariid ja selle uus aspekt immuunmodulatsioonina.J. Biol. Macromol. 2006, 6

(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polüsahhariidid röstitud Coffea arabica ubade kuumaveeekstraktidest: eraldamine ja iseloomustus. Süsivesikud.Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimeetriline meetod suhkrute ja sarnaste ainete määramiseks.Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Angelica polüsahhariidide monosahhariidkomponentide analüüs kõrgsurvevedelikkromatograafia abil.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan jt. Lektiini ekstraheerimine ja puhastamine punasest oast ning lektiini ja nelja Hiina taimse polüsahhariidi esialgsed immuunfunktsiooni uuringud.Biomeditsiini ja biotehnoloogia ajakiri, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ ja A. Szenberg. Täiendavad naastude tehnikat üksikute antikehade moodustavate rakkude tuvastamiseks.Immunoloogia.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura jt. Fusobacterium nucleatum ATCC 10953-st [J] eraldatud poriini fraktsiooni immunobioloogiline toime. Infektsioon ja immuunsus. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ CVT-E002 immunomoduleeriv toime: patenteeritud ekstrakt Põhja-Ameerika ženšennist (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Kolme mitogeense ja komplemendi fikseerija struktuurid ja struktuuri-aktiivsuse seosed pektiin-arabinogalaktaanid Mali haavandivastastest taimedestCochlospermum tinctoriumA. Rikas jaVernonia kotschyanaSch Bip. endine Walp.Biomakromolekulid. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim ja J.-K. Hwang, Arabinogalaktaani ja fukoidaani immunomoduleeriv toime in vitro.Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian jt. Angelica Sinensise nelja vees lahustuva fraktsiooni immunoregulatoorse aktiivsuse hindamine ja võrdlemine in vitro ICR-hiirte kõhukelme makrofaagidel.Rahvusvaheline immunofarmakoloogia. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park jt. Põletikueelne tsütokiini geeniekspressioon ja lämmastikoksiidi reguleerimine veepõhiselt ekstraheeritud Astragali radixi RAW 264.7 makrofaagirakkudes.Ajakiri Etnofarmakoloogia. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee ja YJ Jeon. Poria cocos sclerotium'ist eraldatud polüsahhariid indutseerib hiire makrofaagides NF-κB / Rel aktivatsiooni ja iNOS-i ekspressiooni.Rahvusvaheline immunofarmakoloogia. 2003, 3(10-11):1353–1362.