QPCR ja RNA-seq võrdlus näitab HLA ekspressiooni kvantifitseerimise väljakutseid, 1. osa

Abstraktne

Inimese leukotsüütide antigeeni (HLA) I ja II klassi lookused on kaasasündinud ja omandatud immuunsuse olulised elemendid. Nende funktsioonid hõlmavad antigeeni esitlemist T-rakkudele, mis põhjustavad rakulisi ja humoraalseid immuunvastuseid, ning NK-rakkude moduleerimist. Nende erakordne mõju haiguse tulemustele on nüüdseks selgeks tehtud genoomi hõlmavate assotsiatsiooniuuringutega. Peptiidi siduvat soont kodeerivad eksonid on olnud HLA mõju määramisel haiguse vastuvõtlikkusele / patogeneesile. Kuid HLA ekspressioonitasemed on samuti seotud haiguse tagajärgedega, lisades HLA äärmuslikule mitmekesisusele veel ühe mõõtme, mis mõjutab immuunvastuste varieeruvust üksikisikute vahel.

Leukotsüütide antigeenide ja immuunsuse vahel on tihe seos. Leukotsüütide antigeen viitab inimese valgevereliblede pinnal olevale molekulile, mis suudab tuvastada ja eristada erinevaid rakutüüpe ja patogeene. See on inimese immuunsüsteemi oluline osa ja oluline immuunvastuse regulaator.

Leukotsüütide antigeenide erinevused võivad põhjustada erinevaid immuunvastuseid ja vastuvõtlikkust haigustele. Näiteks teatud leukotsüütide antigeene seostatakse autoimmuunhaiguste, nakkushaiguste ja kasvajatega. Teatud leukotsüütide antigeenide ekspressioon on seotud ka immuunrakkude funktsiooni ja kogusega.

Seetõttu on indiviidi leukotsüütide pinna molekulaarsete omaduste mõistmisel suur tähtsus indiviidi immuunseisundi ning haiguse riski ja prognoosi hindamisel. Samas soodustab see ka personaalse ravi ja ennetusmeetmete väljatöötamist. Sellest vaatenurgast peame immuunsust parandama. Cistanche mõjutab oluliselt immuunsust. Tistanche on rikas mitmesuguste antioksüdantsete ainete, näiteks C-vitamiini ja karotenoidide poolest. Need koostisosad võivad eemaldada vabu radikaale, vähendada oksüdatiivset stressi ja parandada immuunsüsteemi vastupanuvõimet.

Click cistanche tubulosa ekstrakti pulber

HLA ekspressiooni hindamiseks tuginevad immunogeneetilised uuringud traditsiooniliselt kvantitatiivsele PCR-ile (qPCR). Alternatiivsete suure läbilaskevõimega tehnoloogiate, nagu RNA-seq, kasutuselevõttu on takistanud tehnilised probleemid, mis on tingitud HLA geenide äärmisest polümorfismist. Hiljuti on aga välja töötatud mitu bioinformaatilisi meetodeid HLA ekspressiooni täpseks hindamiseks RNA-seq andmete põhjal. See avab põneva võimaluse HLA ekspressiooni kvantifitseerimiseks suurtes andmekogumites, kuid tekitab ka küsimusi selle kohta, kas RNA-seq tulemused on võrreldavad qPCR-i tulemustega. Selles uuringus analüüsime kolme HLA klassi I geenide ekspressiooniandmete klassi sobivate isikute komplekti jaoks: (a) RNA-seq, (b) qPCR ja (c) rakupinna HLA-C ekspressioon. Täheldasime mõõdukat korrelatsiooni qPCR ja RNA-seq ekspressioonihinnangute vahel HLA-A, -B ja -C jaoks ({{10}}.2 Väiksem või võrdne rho Väiksem või võrdne 0,53 ). Arutame tehnilisi ja bioloogilisi tegureid, mida tuleb arvestada erinevate molekulaarsete fenotüüpide kvantifitseerimise võrdlemisel või erinevate tehnikate kasutamisel.

Märksõnad

HLA · Ekspressioon · PCR · RNA-seq.

Sissejuhatus

Geeniekspressioon annab molekulaarse fenotüübi, mis asub geneetilise variatsiooni ja keeruliste fenotüüpide, näiteks haiguse staatuse, vahepealses positsioonis. Geeniekspressiooni geneetiliste aluste mõistmine võib olla strateegiline, et luua seoseid geneetilise variatsiooni ja keeruliste fenotüüpide vahel (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), sealhulgas vastuvõtlikkus autoimmuun- ja nakkushaigustele. Kuigi geneetilise variatsiooni uuringut inimese leukotsüütide antigeeni (HLA) lookustes ja üldiselt peamise histo-ühilduvuse kompleksi (MHC) piirkonnas on kasutatud mitme kompleksse haiguse geneetilise aluse lahkamiseks (Trowsdale ja Knight 2013; Dendrou et al. 2018), on molekulaarsete fenotüüpide, eriti geeniekspressiooniga seotud fenotüüpide kaasamine suhteliselt hiljutine (Apps jt 2015; Vince jt 2016; Ramsuran jt 2018; Johansson jt 2022).

Inimese MHC piirkonnas kromosoomil 6p21 on suur geenitihedus, millel on unikaalsed ahelduse tasakaalustamatuse (LD) mustrid ja äärmuslik polümorfism (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC piirkond sisaldab HLA I ja II klassi lookusi, mis kodeerivad molekule, mis on seotud immuunvastuse käivitamise ja moduleerimisega. HLA I klassi molekule ekspresseerivad enamik tuumaga rakke ja üldiselt esitlevad need rakusiseseid peptiide CD8 pluss T-rakkudele. Seevastu HLA II klassi molekule ekspresseerivad peamiselt professionaalsed antigeeni esitlevad rakud ja CD4 pluss T-rakkudes esinevad eksogeensed antigeenid, mis sisestati endotsütoosi teel. I klassi molekule tunnevad ära ka looduslike tapjarakkude (NK) retseptorid, tapjaraku immunoglobuliinitaolised retseptorid (KIR), mis mõjutavad nii NK-rakkude harimist kui ka aktiveerimist (Colonna ja Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Erinevate HLA I klassi allotüüpide ja spetsiifiliste KIR-molekulide sidumine mõjutab NK-rakkude (ja CD8 pluss T-rakkude alamhulga) aktiivsust, mille tulemuseks on erinev risk vähi, nakkushaiguste ja autoimmuunsuse tekkeks (vaadatud Kulkarni et al. 2008).

HLA haiguste seoseid on peamiselt omistatud alleelispetsiifilistele erinevustele antigeeni esitluses, mis on tingitud peptiidi siduva soone ulatuslikest polümorfismidest. Kuid HLA ekspressioonitasemed aitavad kaasa mõningatele seostele, mida täheldati HLA polümorfismide ja haiguse tulemuste vahel. HLA ekspressioonitase on oluline autoimmuunsuse ja HLA-vahendatud immuunvastuse tugevuse muutja vähile ja infektsioonidele (vaadatud René et al. 2016).

On mitmeid näiteid seostest HLA ekspressioonitasemete ja viirusinfektsiooni tulemuste vahel. Näiteks on hästi dokumenteeritud, et kõrgemad HLA-C ekspressioonitasemed nii mRNA kui ka rakupinna valgu tasemel on seotud parema kontrolliga HIV-1 vastu (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps jt 2013; Parolini jt 2018; Bachtel jt 2018), samas kui kõrgenenud HLA-A ekspressioon on seotud HIV-kontrolli kahjustusega (Ramsuran jt 2018). SARS-CoV-2 infektsioon vähendab HLA-C geeni ekspressiooni (Loi et al. 2022) ja HLA klassi I ekspressiooni rakupinnal (Zhang et al. 2021; Arshad jt 2023), samuti HLA klassi II geeni ekspressioon, sealhulgas HLA-DPA1, -DPB1, -DRA ja -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Lisaks on seosed HLA-DPA1 (Ou jt 2019) ja HLA-DPB1 (Thomas jt 2012; Ou jt 2021) ekspressioonitasemete vahel HBV kliirensiga; HLA-DRA ekspressioon koos vastuvõtlikkusega nahkhiire A-gripiviiruste infektsioonile inimese rakuliinides (Karakus et al. 2019); ja ulatuslikud seosed regulatoorsete variantide ja ekspressioonitasemete vahel HLA II klassi geenides, sealhulgas HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 ja -DRB5, antikeha vastusega mitmete levinud viiruste vastu (Kachuri et al. 2020).

HLA lookuste ekspressioonitasemeid seostatakse ka autoimmuunsusega (vt ülevaadet Johansson et al. 2022). Seotud on HLA-C ekspressioonitasemeid rakupinnal (Apps et al. 2013; Kulkarni jt 2013), samuti HLA-G taset rakupinnal ja plasmas (da Costa Ferreira jt 2021). põletikulise soolehaiguse ohuga. Anküloseeriva spondüliidiga patsientide seas täheldati HLA-B27 ekspressiooni suurenemist rakupinnal (Cauli et al. 2002), nagu ka üldist HLA I klassi ekspressiooni Gravesi tõvega patsientide seas (Weider et al. 2021). HLA II klassi ekspressioonitasemed mõjutavad ka autoimmuunhaiguste riski.

Vitiliigohaigete perifeerse vere monotsüütides on suurenenud HLA-DQA1 ja -DRB1 geeni ekspressioon ning DQ ja DR molekulide ekspressioon rakupinnal (Cavalli et al. 2016); regulatiivsed variandid, mis on seotud kõrgema HLA-DQA1, -DQB1 ja -DRB1 geeniekspressiooniga ning DQ ja DR ekspressiooniga rakupinnal, on seotud süsteemse erütematoosluupuse riskiga (Raj et al. 2016); HLA-DRB5 geeniekspressioon on kõrgem interstitsiaalse kopsuhaigusega sklerodermiaga patsientidel (Odani et al. 2012); spetsiifilised HLA-DRB1 alleelid ekspresseeruvad kõrgelt reumatoidartriidiga patsientidel (Houtman et al. 2021); ja DRB1*15:01 kõrgem ekspressioon on seotud hulgiskleroosi riskiga (Alcina et al. 2012). Seetõttu on HLA ekspressiooni varieerumise mõistmine üksikisikute vahel ja HLA ekspressioonitasemeid reguleerivate mehhanismide mõistmine võtmetähtsusega haiguse fenotüüpide geneetilise aluse avastamisel.

Traditsiooniliselt on HLA ekspressiooni hinnatud antikehapõhiste meetodite abil ekspressioonitasemete määramiseks rakupinnal (Thomas jt 2012; Apps jt 2013) või kvantitatiivse PCR-iga (qPCR või RT-PCR) mRNA transkriptsioonitasemete määramiseks (Bettens et al. al 2014; Ramsuran jt 2015, 2017). Uuringute tulemuste võrdlemine või isegi eri HLA lookuste võrdlemine samas uuringus on keeruline, kuna iga analüüsi ja iga HLA lookuse jaoks kasutatakse erinevaid eksperimentaalseid protseduure, mille tulemuseks võib olla erinev amplifikatsioonitõhusus qPCR-is või antikehade afiinsused voolutsütomeetrias.

Suure läbilaskevõimega tehnoloogiad, nagu RNA-seq, annavad ekspressioonihinnangud kõigi genoomi geenide, sealhulgas HLA geenide kohta, võimaldades seega hinnata HLA ekspressiooni kogu genoomi hõlmavas kontekstis. Need tehnoloogiad toovad aga kaasa palju väljakutseid, kui neid kasutatakse HLA geenide ekspressioonitasemete hindamiseks. Lisaks RNA-seq analüüsidega seotud hästi dokumenteeritud kõrvalekalletele (nt partiiefektid, raamatukogu ettevalmistamine, GC sisaldus ('t Hoen et al. 2013)) tuleneb HLA geenide ekspressioonitasemete hindamise raskus sellest, et kvantifitseerimine hõlmab lühikeste lugemiste joondamist võrdlusgenoomiga, mis ei anna HLA alleelse mitmekesisuse täielikku esitust.

Seetõttu ei pruugi mõned lugemised joonduda, kuna võrdlusgenoomil on palju erinevusi (Brandt et al. 2015). Lisaks on HLA geenid osa geeniperekonnast, mis on moodustatud pärast järjestikuseid dubleerimisringe ja sisaldavad sageli segmente, mis on paraloogide vahel väga sarnased, mille tulemuseks on geenide ristjoondumine ja ekspressioonitasemete kallutatud kvantifitseerimine. Need raskused ajendasid välja töötama arvutuslikke torujuhtmeid (ülevaate saamiseks vt Johansson jt 2022), mis võtavad arvesse teadaolevat HLA mitmekesisust joondamisetapis ja on näidanud, et need tagavad HLA geenide täpsed ekspressioonitasemed (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar jt 2019; Gutierrez-Arcelus jt 2020; Darby jt 2020).

Kuigi nii RNA-seq kui ka qPCR lähenemisviisid hindavad HLA ekspressiooni, kvantifitseerides transkriptide arvukuse, hõlmavad meetodid erinevaid eksperimentaalseid ja bioinformaatilisi töötlemisprotseduure. Meile teadaolevalt ei ole RNA-seq tulemuste kvantitatiivset võrdlust HLA geenide qPCR-ist saadud tulemustega tehtud. Selles uuringus püüdsime võrrelda erinevaid tehnikaid ja molekulaarseid fenotüüpe HLA I klassi ekspressiooni kvantifitseerimiseks, pidades meeles, et ühtegi tehnikat ei saa pidada kullastandardiks. Et vähendada tehniliste ja bioloogiliste variatsioonide mõju erinevate uuringute võrdlemisel, teostasime RNA-seq analüüsi 96 indiviidiga, kelle jaoks olid saadaval qPCR ekspressioonihinnangud (HLA-A, -B, -C jaoks) ja mille alamhulga jaoks oli saadaval ka HLA-C antikehadel põhinev rakupinna ekspressioon. RNA-seq kvantifitseerimine viidi läbi HLA-le kohandatud torujuhtmega, mis võimaldab täpset ekspressioonihinnangut, minimeerides ühele võrdlusgenoomile tuginevate standardsete lähenemisviiside eelarvamusi.

materjalid ja meetodid

Näidised

Vereproovid võeti 96 tervelt veredoonorilt, kes osalesid Fredericki riiklikus vähiuuringute laboris (FNLCR) vabatahtlikus doonoriprogrammis. Kõigilt katsealustelt saadi kirjalik teadlik nõusolek ja proovid muudeti anonüümseks riikliku vähiinstituudi IRB poolt heaks kiidetud protseduuride kohaselt. RNA ekstraheeriti värskelt eraldatud perifeerse vere mononukleaarsetest rakkudest (PBMC), kasutades RNeasy Universal komplekti (Qiagen). RNA-d töödeldi genoomse DNA eemaldamiseks RNAasivaba DNAaasiga. PBMC-dest ekstraheeritud kogu RNA kvantifitseeriti, kasutades HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Geeniekspressiooni analüüsides kasutati kõiki proove, mille RNA kvaliteediskoor oli suurem kui 8.

HLA tippimine

HLA alleelid määrati Sangeri sekveneerimisega. Lisaks käitasime HLApersi (Aguiar et al. 2019) ja Kouramit (Lee ja Kingsford 2018), et järeldada HLA alleelid otse RNAseqist ja kontrollisime, kas need on kooskõlas Sangeri järjestuspõhiste kõnedega. Kui arvestada järjepidevaid kõnesid HLApersi ja Kourami vahel, täheldasime 288 võrdlusest (3 lookust × 96 isikut) vaid 10 lahknevust Sangeri kõnedega. Enamik neist (n=5) näitas RNA-seq-i toetust alleeli jaoks, mis on väga lähedane Sangeri sekveneerimisega määratud alleelile, seega otsustasime jätta RNA-seq-põhised kõned. Kolme genotüübi puhul jälgime RNA-seq homosügootseid kõnesid tõenäoliselt seetõttu, et ühte alleeli ei ekspresseeritud, ja säilitasime Sangeri sekveneerimisest pärit kõned. See ei mõjuta ekspressioonihinnangut, kuna ükski lugemine ei joondu alleeliga, mida RNA-seq kaudu ei tuvastata. Ühe genotüübi puhul täheldasime heterosügootse kõne head tuge, samas kui Sangeri sekveneerimist nimetati homosügootiks. Sel juhul säilitasime RNA-seq-põhise kõne, kuna see selgitas paremini vaadeldud lugemisi. Ühe alleelikõne puhul kaalusime RNA-seq-põhiste kõnede viga ebapiisava lugemiskatte tõttu.

Kvantitatiivne PCR (qPCR)

HLA mRNA transkriptsioonitasemeid HLA-A, -B ja -C jaoks mõõdeti qPCR-ga testis, mis tagab tavaliste alleelide erapooletu amplifikatsiooni igas lookuses, vältides samal ajal kõigi teiste lookuste amplifikatsiooni. Kasutatud praimerid olid: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Pöördtranskriptsioon viidi läbi, kasutades High-Capacity RNA-to-cDNA komplekti (Applied Biosystems). HLA ja majapidamisgeen 2 mikroglobuliini (B2M) cDNA amplifitseerimine viidi läbi, kasutades Power SYBR rohelist põhisegu (Applied Biosystems) masinal ABI 7900HT. B2M praimerijärjestusi on kirjeldatud Kulkarni et al. tabelis S4. (2013). Iga HLA geeni keskmine ekspressioonitase normaliseeriti B2M omaga ja arvutati 2-∆∆Ct meetodi abil (kus Ct on lävitsükkel).

Tavaliste HLA alleelide keskmisi alleelispetsiifilisi ekspressioonitasemeid hinnati lineaarse mudeli abil, nagu on kirjeldanud Ramsuran et al. (2015). Täpsemalt, me modelleerisime ekspressiooni iga indiviidi poolt kantud kahe alleeli lineaarse funktsioonina ja ekstraheerisime iga alleeli mõju geeniekspressioonile. Tegime selle sammu R-s (vt jaotist Koodi saadavus).

Pinna väljendus

HLA-C rakupinna ekspressiooni mõõdeti CD3 pluss rakkudel värskelt eraldatud PBMC-dest voolutsütomeetria abil, kasutades HLA-C-spetsiifilist monoklonaalset antikeha DT9 (Apps et al. 2013). HLA-A analüüsi jaoks A*03 ja A*11 kandvate indiviidide alamrühmas värvisime rakud antikehaga 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-seq

RNA valmistamine

RNA-seq viidi läbi RNA-ga, mida säilitati temperatuuril -80 kraadi. Kogu RNA kvantifitseeriti, kasutades Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). RNA kvaliteeti hinnati seadme 2100 Bioanalyzer ja Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies) abil. Iga proovi jaoks kasutati 500 ng kogu RNA-d kogu transkriptoomilise rRNA-ga ammendunud raamatukogude valmistamiseks. Adapteriga ligeeritud raamatukogu valmistati KAPA HyperPrep komplektiga (KAPA Biosystems, Wilmington, MA), kasutades Bioo Scientific NEXTfex™ DNA vöötkoodiadaptereid (BioScientifc, Austin, TX, USA) vastavalt KAPA pakutavale protokollile.

rRNA ammendumine RiboErase abil

Ribosomaalne RNA kahandati, inkubeerides kogu RNA-d rRNA järjestustega komplementaarsete sondidega. Pärast hübridisatsiooni kasutati rRNA ensümaatiliseks lagundamiseks RNaasi H. Puhastamine ja DNaasi lõhustamine viidi läbi Kapa Pure Beadsi ja DNaasi abil vastavalt Kapa protokollile.

Fragmentimine, cDNA süntees ja raamatukogu ehitamine

rRNA-vaesestatud proovid fragmenteeriti 85 kraadi juures 4,5 minutit magneesiumi juuresolekul enne 1. ja 2. ahela sünteesi ja A-saba reaktsiooni. NEXTfex DNA vöötkoodiga adapterid (1,5 uM) ligeeriti A-sabaga cDNA-ga iga proovi jaoks ainulaadse vöötkoodiga. Tooted puhastati Kapa Pure Beadsiga ja viidi läbi 8 raamatukogu amplifikatsiooni tsüklit. Pärast amplifikatsiooni viidi läbi raamatukogu lõplik puhastamine ning raamatukogu kvantifitseerimist ja kvaliteedikontrolli hinnati Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) ja Agilent DNA HS komplekti abil seadmel 2100 Bioanalyzer.

Järjestus

Saadud multipleksitud sekveneerimisraamatukogusid kasutati klastri moodustamisel Illumina cBOT-is (Illumina, San Diego, CA, USA) ja sekveneerimine viidi läbi Illumina HiSeq 2500 abil, järgides Illumina pakutavaid protokolle 2 × 126 bp paarisotsa sekveneerimiseks. Iga transkriptoom sekveneeriti sihtsügavuseni 40–50 miljonit lugemist.

RNA-seq värsketel proovidel 11 isendilt

Enne RNA sekveneerimist temperatuuril -80 kraadi säilitatud materjali proovi lagunemise võimaluse uurimiseks, mis võib olla qPCR hinnangutega eriarvamuste allikas, võtsime uuesti 11 doonori verd ja tegime uutele proovidele RNA-seq. Katse viidi läbi sama raamatukogu ettevalmistamise ja meetoditega nagu varem, kuid sekveneeriti Illumina NextSeq abil 2 × 150 pb lugemisega.

RNA-seq ekspressiooni kvantifitseerimine

Viitetranskriptoom

Kõigi Gencode v37 andmebaasis annoteeritud transkriptide ekspressioonitasemete hindamiseks kasutasime Salmonit (Patro et al. 2017). Kasutasime Salmoni puhul kõiki nihke korrigeerimise võimalusi (GC kallutatus, positsiooniline nihe ja järjestusspetsiifiline nihe).

Isikupärastatud

Sama mis "Ref-transkriptoom", kuid isikupärastatud HLA transkriptidega vastavalt iga inimese HLA-A, -B ja -C genotüüpidele. Isikupärastamine viidi läbi, joondades koordinaatide saamiseks võrdlusgenoomi HLA alleeli järjestuse genoomiga. Seejärel, kasutades võrdlusgenoomil oleva alleeli mitme järjestuse joondust kõigi teiste alleelidega (saadaval IPD-IMGT/HLA versioonist 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), omistasime genoomse. positsioonid kõikidele HLA alleelidele. Lõpuks koostasime isikupärastatud ärakirja, mis põhineb transkripti koordinaatide ja HLA alleeli järjestuse teabe kombinatsioonil. See protseduur viidi läbi programmis R (R Core Team 2020), kasutades Biostringsi paketti (Pagès et al. 2020) ja tidyverse metapaketti (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com