Adoptiivse NK-rakkude infusiooni kombineerimine dopamiini vabastava peptiidiga vähendab vananevate rakkude arvu vananenud hiirtel

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

SISSEJUHATUS

Vananemine on paljude haiguste üks peamisi riskitegureid [1] ning vananemisse sekkumise meetodite väljatöötamine vähendab märkimisväärselt mitmete vanusega seotud haiguste, nagu südame- ja ajuveresoonkonna haigused [2, 3], vähk, riski. [4] ja Alzheimeri tõbi [5]. Vananevad rakud (SNC-d) kogunevad kudedesse järk-järgult vananemisprotsessi käigus ja neid peetakse vanusega seotud haiguste peamiseks põhjuseks [6-8]. On näidatud, et SNC-de eemaldamine hiiremudelites hoiab ära või lükkab edasi kudede düsfunktsiooni ja pikendab tervet eluiga [9, 10]. Seevastu väikestes kogustes SNC-de siirdamine põhjustab noortel hiirtel füsioloogilisi düsfunktsioone [1]. Need uuringud on avanud uksed selliste meetodite väljatöötamiseks, mis on suunatud SNC-de eemaldamisele, et leevendada vanusega seotud kroonilisi haigusi.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

SNC-de sihtkliirens, mida nimetatakse "senolüütikumideks", oli esimene keemiaravi, mida edukalt testiti prekliinilises in vivo mudelis, ja praegu on olemas mitmeid senolüütilisi aineid [12]. Paljud neist ravimitest on suunatud SNC-des ülesreguleeritud anti-apoptootilistele radadele, et selektiivselt puhastada teatud tüüpi SNC-sid, ja on näidanud potentsiaali pikendada eluiga ja parandada keha funktsioone [13, 14].Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toimeVaatamata vanusega seotud patoloogia edukale pöördumisele loommudelites, võib senolüütiliste ravimite kasutamisel inimestel esineda takistusi, mis on tingitud SNC-de heterogeensusest ja suurest toksilisuse riskist [15]. Seetõttu tuleks uurida alternatiivset meetodit, mis võib inimestel ohutult kõrvaldada mitmesuguseid SNC-sid.

Immuunsüsteem suudab SNP-sid ära tunda ja eemaldada [16]. Varasemad uuringud on näidanud, et SNC-d aktiveerivad looduslikke tapjarakke (NK-rakud), reguleerides üles peamist histo-ühilduvusklassi I ahelaga seotud valgu A ja B aktiveerivat ligandit [17]. Vanuse kasvades aga immuunsüsteemi efektiivsus väheneb, mis võib viia SNC-de immuunpõgenemiseni [18]. Vähiravis on uuritud meetodeid immuunpuudulikkuse ületamiseks, mis on põhjustatud immuunfunktsiooni langusest [19]. Hiljuti on tehtud edusamme NK-rakkude adoptiivsel ülekandmisel kasvajate kõrvaldamiseks, mis on näidanud mõningast tõhusust [20]; seega oli mõistlik eeldada, et NK-rakkude adoptiivne infusioon võib SNC-des põhjustada tsütotoksilisust.

Närvi- ja immuunsüsteem on keha kaks kõige olulisemat adaptiivset süsteemi. Mitmed uuringud on näidanud, et dopamiin (DA) kui immuunregulaator on neuroimmuunsuhtluse võti [21]. DA täidab oma bioloogilisi funktsioone dopamiini retseptoritega (DR) interaktsiooni ja nende aktiveerimise kaudu, mis jagunevad kaheks alarühmaks: D1-sarnased (D1 ja D5) ja D2-sarnased (D2, D3, ja D4). Nende erinevate funktsioonide poolest stimuleerib D1-nagu DR kaasamine cAMP tootmist, samas kui D2-nagu DR inhibeerib cAMP tootmist [22]. Varasemad uuringud on näidanud, et D1-sarnane DR-stimulatsioon suurendab NK-rakkude tsütotoksilisust nii in vitro [23] kui ka in vivo [24]. DA tase langeb aga inimese vanuse kasvades [25]. Seega oletasime, et dopamiinergilised ravimid võivad suurendada NK-rakkude adoptiivse infusiooni tsütotoksilisust.

Cistanche on vananemisvastane toime

Siin teeme ettepaneku kasutada nonapeptiidi Acein, mis interakteeris angiotensiini konverteeriva ensüümiga (ACE I), et indutseerida DA sekretsiooni [26], kombinatsioonis süsteemse NK-rakuteraapiaga, et kõrvaldada SNC-d. In vitro tulemused näitasid, et NK-rakud eemaldasid SNC-d, sõltumata vananemise indutseerijatest ja rakutüüpidest.cistanche herbaVananeva hiire mudelis vähendas NK-rakuteraapia kombinatsioonis Aceiiniga oluliselt vananemisega seotud galaktosidaasi (SA- -gal)-positiivsete rakkude arvu mitmes koes, vähendas vananemisega seotud geenide ekspressiooni peamistes elundites. ja leevendatud vananemisega seotud sekretoorseid fenotüüpe (SSP). Selle uuringu tulemused annavad ülevaate krooniliste SNC-de immuunseire võimalikust taastamisest, kasutades NK-rakuteraapiat koos Ace-ga.

TULEMUSED

NK-rakkude adoptiivne infusioon vähendab perifeerses veres vananevaid CD3 pluss T-rakke

Uuringusse kaasati kakskümmend kuus vabatahtlikku, kes said NK-rakkude infusiooni. Vabatahtlike omadused ja NK-rakkude omadused on esitatud tabelis 1. Ajavahemik vere kogumiseks pärast NK-rakkude ülekannet oli umbes 37 (25-57) päeva. NK-rakkude osakaal (joonis 1A) ja absoluutarv (joonis 1B) perifeerses veres olid pöördvõrdelises seoses vabatahtlike vanusega. Üllataval kombel oli igasse isendisse uuesti infundeeritud NK-raku produkti puhtus pöördvõrdelises korrelatsioonis vabatahtlike vanusega (joonis 1C).cistanche peenise kasvSelle põhjuseks võib olla NK-rakkude arvu järkjärguline vähenemine koos vanusega. NK-rakkude manustamise vananemisvastase toime kajastamiseks tuvastati enne ja pärast NK-rakkude infusiooni perifeerse vere CD3 pluss T-rakkudes mitu vananemismarkerit, mis peegeldavad suures osas keha vanusega seotud fenotüüpi [27]. Võrreldes CD3 pluss T-rakkude vananemismarkerite ja SASP faktoriga perifeerses veres enne ja pärast autoloogsete NK-rakkude infusiooni, vähenes SA- -gal-positiivsete T-rakkude osakaal pärast infusiooni oluliselt (joonis 1D). P16, P21 ja plasminogeeni aktivaatori inhibiitori 1 (Pai1) mRNA tasemed vähenesid oluliselt, samas kui muutused monotsüütide kemoatraktandi valgu-1 (MCP-1) ja IL-6 mRNA tasemetes. ei olnud olulised (joonis 1E). Perifeerses veres ei olnud olulist erinevust biokeemilistes indeksites (täiendav tabel 1).

Inimese NK-rakud vähendavad rasvkoe vananemismarkereid ja põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni

Rasvkude koguti kolmelt rasvunud isikult, kuna rasvumine kipub põhjustama SNC-de kuhjumist [28]. Lisaks kultiveeriti rasvkude SNC-de konditsioneeritud söötmes, et veelgi indutseerida rasvkoe vananemist. Kontrolliks loeti mitte-SNC-de konditsioneeritud söötmes kasvatatud rasvkude. Perforiini (joonis 2A) ja CD69 (joonis 2B) ekspressioon NK-rakkudes oli oluliselt kõrgem pärast inkubeerimist vananeva rasvkoega võrreldes kontrollrasvkoega inkubeerimisega. Vananevate markerite p16 ja p21 ekspressioon sisse

vananev rasvkude vähenes oluliselt pärast NK-rakkude töötlemist (joonis 2C, täiendav joonis 1A, B). Samuti leidsime, et SASP põhikomponent konditsioneeritud söötmes pärast koosinkubeerimist NK-rakkudega vananevas rühmas oli oluliselt vähenenud (joonis 2D). Need tulemused näitasid, et NK-rakud võivad eemaldada rasvkoest SNC-d ja vähendada SASP fenotüüpi.

Hiire NK-rakke saab aktiveerida SNC-de vastu ja avaldada tsütotoksilisust

Kõigepealt indutseerisime kiiritamise või adriamütsiini abil hiire rasvkoe eellasrakkude vananemise, nagu eelnevalt kirjeldatud [29]. Et teha kindlaks, kas SNC-d aktiveerisid spetsiifiliselt NK-rakke, inkubeeriti kiiritamata kontrollrakke või kiiritatud SNC-sid koos NK-rakkudega 24 tundi. Voolutsütomeetria näitas, et CD69 (joonis 3A) ja IFN-y (joonis 3B) ekspressioonitasemed NK-rakkudes olid SNC-sihtrakkudes oluliselt ülesreguleeritud võrreldes kontroll-sihtrakkudega. Samal ajal oli pärast NK-rakkudega inkubeerimist SNC-de apoptootiline tase oluliselt kõrgem kui kontrollrakkudel (joonis 3C). Järgmisena tuvastasime NK-rakke aktiveerivate ja inhibeerivate ligandide ekspressiooni SNC-des. qPCR tulemused näitasid, et aktiveerivate ligandide ekspressioonitase NK-rakkudes oli kontrollrakkudega võrreldes oluliselt ülesreguleeritud ja mõnede inhibeerivate ligandide, näiteks beeta2-mikroglobuliini (2m), ekspressioonitase oli kontrollrakkudega võrreldes allareguleeritud (joonis fig. .3D). Samuti oleme uurinud NK-rakkude võimet elimineerida SNC-sid in vivo.cistanche salsa eelisedDiR-märgistatud kontrollrakud ja DiR-märgistatud SNC-d siirdati hiirte kõhuõõnde ja NK-rakke manustati sabaveeni kaudu. In vivo pildistamise tulemused näitasid, et fluorestsentsi intensiivsus hiirtel, kellele siirdati SNC-d pärast NK-rakkude töötlemist, oli oluliselt nõrgem kui kontrollrakkudega siirdatud hiirtel (joonis 3E). See näitas, et NK-rakkude võime tappa SNC-sid oli oluliselt kõrgem kui SNC-del in vivo. Järgmisena määrasime kindlaks, kas NK-rakkude tsütotoksilisus SNC-de vastu oli annusest sõltuv ja rakuspetsiifiline. Samal ajal kasutasime ka doksorubitsiini poolt indutseeritud vananemist, et teha kindlaks, kas NK-rakkude tsütotoksilisus SNC-de vastu piirdus kiirguse indutseerimisega. Tulemused näitasid, et NK-rakkudel oli annusest sõltuval viisil märkimisväärne tsütotoksiline aktiivsus SNC-de suhtes, kuid kontrollrakkude suhtes vähene tsütotoksilisus. Erinevad vananemise stimuleerimise meetodid ei mõjutanud NK-rakkude võimet tappa SNC-sid (joonis 3F). Need tulemused näitasid, et SNC-d võivad NK-rakke spetsiifiliselt aktiveerida ja tekitada in vitro ja in vivo SNC-de suhtes olulist tsütotoksilisust.

DA suurendab D1-sarnaste retseptorite kaudu hiire NK-rakkude tsütotoksilisust SNC-de vastu

Pidades silmas DA olulist neuroimmuunse suhtlusfunktsiooni [30], hindasime, kas DA võib suurendada hiire NK-rakkude tsütotoksilisust SNC-de vastu. NK-rakke inkubeeriti koos kiirgusega indutseeritud SNC-dega ja söötmele lisati erinevad kontsentratsioonid DA. Tulemused näitasid, et DA võib suurendada NK-rakkude tsütotoksilisust SNC-de vastu (joonis 4A, B). Signalisatsiooniraja iseloomustamiseks, mille abil DA suurendas NK-rakkude tapvat toimet SNC-dele, hinnati muutusi DR-i ekspressioonis, cAMP-sisalduses ja cAMP-vastuse elementi siduva valgu (CREB) fosforüülimises NK-rakkudes. NK-rakkudes, mida inkubeeriti koos SNC-dega koos DA-ga, suurenes cAMP-i sisaldus (joonis 4C) ja CREB-i fosforüülimistase (joonis 4D, täiendav joonis 2A) oluliselt võrreldes NK-rakkude ja SNC-koinkubatsiooniga. ilma DA-ta. Selgitamaks, miks DA suurendab NK-rakkude tapmisaktiivsust SNC-de vastu, võrdlesime DR-i muutusi NK-rakkudes pärast NK-rakkude koosinkubeerimist SNC-de või kontrollrakkudega. Tulemused näitasid, et D1 ja D5 DR ekspressioonitase oli kontrollrakkudega võrreldes oluliselt ülesreguleeritud pärast NK-rakkude koosinkubeerimist SNC-dega (joonis 4E). Järgmiseks meeldivad DA ja D{15}}retseptori antagonistid või D2-

retseptori antagonistid lisati NK-rakkude ja SNC-de koosinkubatsioonisüsteemi. Võrreldes ainult DA lisamisega, vähenes SNC-de apoptoosi tase DA pluss SCH-23300(D1-sarnase retseptori antagonisti) lisamisel (joonis 4F, G). Samal ajal oli cAMP sisaldus (joonis 4H) ja CREB fosforüülimistase (joonis 4l, täiendav joonis 2B) NK-rakkudes alareguleeritud. Seevastu DA pluss haloperidooli (D2 retseptori antagonist) lisamine ei muutnud oluliselt SNC-de apoptoosi taset, cAMP sisaldust ja CREB fosforüülimist NK-rakkudes, võrreldes ainult DA lisamisega. Need tulemused näitasid, et DA suurendas hiire NK-rakkude tapmisaktiivsust SNC-de vastu D1-nagu Drs.

Ace koos hiire NK-rakkudega suurendab oluliselt SNC-de kliirensit in vivo

Eelmine uuring on näidanud, et dopamiin väheneb inimestel vanusega [22]. Esmalt mõõtsime perifeerset dopamiini taset noortel ja vanadel hiirtel. Tulemused näitasid, et vanade hiirte dopamiini tase plasmas oli madalam kui noortel hiirtel (joonis 5A). Järgmisena uuriti perifeerset dopamiini vabanemist pärast Aceini intraperitoneaalset süstimist vanadel hiirtel. Leidsime, et plasma dopamiini tase tõusis oluliselt pärast 10 mg/kg Aceini süstimist (joonis 5B, täiendav joonis 3). Seda silmas pidades teostasime vanade hiirte ravimiseks hiire NK-rakke koos Aceiniga. Tuvastasime NK-rakkude seisundi hiirte perifeerses veres pärast ravi ja leidsime, et NK-rakkude arv perifeerses veres ainult NK-rakkude või Aceiiniga kombineeritud NK-rakkude infusioonil oli oluliselt suurem kui Ace-ravi saanud rühmas ja PBS-i rühm, samas kui NK-rakkude arv ei erinenud oluliselt NK-rakkudega töödeldud rühma ja Aceiiniga töödeldud rühmaga kombineeritud NK-rakkude vahel (joonis 5C, D).cistanche tubulosa dosage redditNK-rakkude aktivatsioonitaseme edasine tuvastamine näitas, et CD69 ekspressioonitase perifeerse vere NK-rakkudes kombineeritud ravitud rühmas oli oluliselt ülesreguleeritud võrreldes NK-rakkudega töödeldud rühmaga (joonis 5E). Järgmisena hindasime koes olevaid SNC-sid. Leidsime, et NK-rakkude infusioon üksi vähendas mõnede vananevate markerite ekspressiooni võrreldes PBS-rühma ja Aceiiniga ravitud rühmaga, samas kui NK-rakkude infusioon koos Aceiiniga vähendas oluliselt SA- -gal-positiivsete rakkude arvu (joonis 5F). ), samuti P16 ja P21 ekspressioonitasemeid (joonis 5G, täiendav joonis 4A, B) rasvkoes, võrreldes ainult NK-rakkude raviga. Ki67BrdUrakkude arv rasvkoes suurenes samuti oluliselt (joonis 5H), mis tõestab veelgi, et SNC-de sisaldus rasvkoes oli kombineeritud ravirühmas madalam. Maksa-, kopsu-, neeru- ja rasvasektsioonide SA- -gal värvimine näitas ka madalaimat SNC-de taset kombineeritud ravitud rühmas (täiendav joonis 5A–D). Need tulemused näitasid, et NK-rakud koos Acein-raviga suurendasid NK-rakkude aktivatsioonitaset hiirtel ja põhjustasid SNC-de märkimisväärse elimineerimise in vivo.

Ace koos NK-rakkudega vähendab vanusega seotud fenotüüpe vanadel hiirtel

Hiirte vanusega seotud fenotüüpide täiendavaks kinnitamiseks koguti maksa-, kopsu-, neeru-, rasv- ja silmakudesid, et tuvastada mitmesuguseid vananevaid markereid, sealhulgas P16, P21 ja SASP faktoreid. Need proovid valiti, kuna need kuded vananevad tõenäolisemalt koos vanusega [31]. Igas koes olid P16, P21 ja SASP faktorite mRNA tasemed pärast ainult NK-rakkude infusiooni oluliselt madalamad kui kontrollrühmas, samas kui vananemismarkerite tase maksas, rasvkoes ja eelõhtul kombineeritud ravitud kudedes. grupis vähenes veelgi võrreldes rühmaga, keda raviti ainult NK-rakkude infusiooniga (joonis 6A). Samamoodi oleme tuvastanud ka peamise SASP-faktori hiirte seerumis ja tulemused olid kooskõlas kudede tulemustega (joonis 6B). Lisaks oleme uurinud ka NAD taset maksas ja rasvkoes, mis on seotud vananemisega [32]. Leidsime, et NK-rakkude infusioon üksi või kombineeritud ravis suurendas oluliselt NAD-i sisaldust maksas ja rasvkoes, paranemise tase oli kombineeritud ravirühmas oluliselt kõrgem (joonis 6C). Mõned seerumi biokeemilised indeksid, sealhulgas ALT, AST, CREA, UA, CHOL ja BUN, on seotud vananemistasemega [33]. Oleme leidnud, et kombinatsioonravi saanud rühmas vähenes hiirte seerumis oluliselt ainult UA, samas kui teised peamised biokeemilised indeksid seda ei teinud.

MATERJAL JA MEETODID Inimese NK-rakkude infusioon

Autoloogse NK-rakkude infusiooni viis läbi Shanghai Mengchao vähihaigla (Shanghai, Hiina) ja kõik protokollid kiitis heaks nende eetikakomitee (nr 05,2020, Shanghai Mengchao vähihaigla meditsiinieetika komitee). Kõik vabatahtlikud andsid perifeerse vere saamiseks allkirjastatud teadliku nõusoleku. Lühidalt, igalt isikult ekstraheeriti 50 ml perifeerset verd, mille järel perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC-d) eraldati ja kanti T75 kolbi koos ExCellerate'i Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA), mis sisaldas 1 × Cloudz CD2/NKp46. , Rekombinantne inimese IL-2 (27 ng/mL), rekombinantne inimese L-12 (10 ng/mL), rekombinantne inimese IL-18 (10 ng/ml ja rekombinantne inimese L{{ 13}}(10 ng/mL) (R&D Systems, USA) 48 tunniks ja seejärel asendati aktiveeritud söötmega (270 ng/mL rekombinantne inimese IL-2, 20 ng/ml rekombinantne inimese IL-12 , 20 ng/mL rekombinantset inimese IL-18 ja 20 ng/mL rekombinantset inimese IL-21) edasiseks kultiveerimiseks. Rakkude tihedust hoiti 1 × 10 kraadi rakku/ml. Kultiveerimise 28. päeval , koguti kvaliteedikontrolliks väike arv autoloogseid NK-rakke ja süstiti intravenoosselt uuesti koos autoloogsete NK-rakkudega tihedusega 4,15 × 10 kraadi (3.{31}},87 × 10) rakke infusiooniajaga 30 minutit. Katseprotsess viidi läbi kooskõlastatult nce hea kliinilise tavaga. Teise verevõtu ajavahemik oli umbes 37 (25-57) päeva.

Inimese perifeerse vere T-rakkude ja NK-rakkude eraldamine Pärast teadliku nõusoleku andmist saadi tervetelt vabatahtlikelt värsket verd ning Hiina Farmaatsiaülikooli (loa number: SYXK{0}}) kiitis protokolli heaks. Inimese PBMC-de isoleerimiseks kasutati Lymphoprepi (STEMCELL Technologies, Kanada). Inimese CD3 pluss T-rakud saadi PBMC-dest, kasutades inimese CD3 T-rakke sorteerivaid magnethelmeid (Miltenyi Biotec, Saksamaa) vastavalt tootja protokollile. NK-rakud eraldati perifeersest verest, kasutades RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail'i (STEMCELL Technologies) vastavalt tootja protokollile.

Hiire NK-rakkude eraldamine ja laiendamine in vitro

Hiire põrna NK-rakud eraldati, kasutades NK-rakkude eraldamise komplekti (Miltenyi Biotec) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt öeldes saadi hiire põrnad, põrnarakud filtriti 70 μm rakufiltri abil ja põrna lümfotsüüdid saadi tihedusgradienttsentrifuugimisega, kasutades hiire põrna lümfotsüütide eralduskomplekti (Solarbio, Hiina). Põrna lümfotsüüdid koguti kõrge puhtusastmega NK-rakkude saamiseks, kasutades hiire NK-rakkude eraldamiseks magnethelmeid. Eraldatud põrna NK-rakke kultiveeriti säilitussöötmes RPMI-1640, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS), 1 protsenti L-glutamiini, 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini, 1 protsenti minimaalset olulist söödet (MEM). asendamatu aminohape, 1% naatriumpüruvaathape ja 50 uM merkaptoetanool (kõik firmalt Life Technologies, USA). Lisaks lisati 200 IU/mL rekombinantset interleukiin 2 (RL-2) (PeproTech, USA) ja 10 ng/ml hiire I-15(ml-15)(PeproTech). keskmine. Seejärel koguti 10-kraadised NK-rakud ja 10-kraadise kiiritatud põrna lümfotsüüdid ning 5 ml amplifikatsioonisöödet (säilitussöödet, millele oli lisatud 1000 IU/mL rlL-2, 10 ng/mL ml-15 ja 30 ng/mL antiainet. -NKp46 antikeha (PA5-46986, Invitrogen, USA)) oli

Joonis fig 3 SNC-d aktiveerivad NK-rakke ja tapeti NK-rakkude poolt. Voolutsütomeetria (A) CD69 ja (B) IFN-y ekspressiooni tuvastamiseks viidi läbi pärast 24-tunnist koosinkubeerimist hiire NK-rakkude ja preadipotsüütidega või kiiritusest indutseeritud preadipotsüütidega. n =3. Andmed on esitatud keskmisena ± SD. Erinevusi hinnati kahepoolse paaritu mitteparameetrilise t-testi abil. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Preadipotsüütide ja lihaste satelliitrakkude ekstraheerimine

Preadipotsüüdid ekstraheeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud [11]. Lühidalt, inimese või hiire rasv eemaldati steriilsetes tingimustes ja lõigati 1-2 mm tükkideks, pesti kaks korda PBS-iga ja seediti kollagenaasiga ll (Solarbio) 37 kraadi juures 1 tund. Seejärel filtreeriti rakud 100 μm rakufiltriga, tsentrifuugiti 300 g juures 5 minutit ja koguti. Kleepuvaid rakke kultiveeriti a-MEM-is, millele oli lisatud 20 protsenti FBS-i, 12 tundi ja seediti kleepunud rakkude kogumiseks trüpsiiniga. Lihassatelliitrakud eraldati nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [34]. Nelipealihas lõigati 1-2 mm tükkideks ja seedimiseks lisati 5 ml kollagenaasi ll temperatuuril 37 °C 12 minutiks. Segu segati pipetiga ja pärast täiendavat 12-minutilist seedimist lisati 5 ml täielikku söödet. Rakud filtriti 70 μm rakufiltri abil ja tsentrifuugiti 300 g juures 5 minutit. Siis olid rakud

kultiveeriti 5 ml söötmega, mida lisati iga päev 4 päeva jooksul. Kleepuvad rakud puhuti pipetiga ära ja tsentrifuugiti 2000 x g juures 5 minutit. Pärast trüpsiini lõhustamist 37 kraadi juures 5 minutit, tsentrifuugiti rakke kiirusel 2000 x g 5 minutit ja koguti. Seejärel lisati 5 ml F-10 Hami söödet, millele oli lisatud 20 protsenti FBS-i ja 4 ng/ml aluselist fibroblastide kasvufaktorit (PeproTech).

Hiire põrna NK-rakkude tsütotoksilisus SNC-de suhtes tuvastati laktaatdehüdrogenaasi testiga

SNC-d indutseeriti 0,2 μM Adriamyciniga (MedChemExpress, USA) 24 tunni jooksul või jätkuva kultiveerimisega 20 päeva pärast 10 Gy röntgenkiirgust. Seejärel asetati plaadile 5000 SNC-d ja lisati põrna NK-rakud (rakkude elujõulisus: 93.{8}},1 protsenti) efektori ja sihtmärgi suhtega 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 ja 1,563:1. Supernatandid koguti pärast 24-tunnist kooskultuuri 37 °C juures ja tuvastamiseks kasutati laktaatdehüdrogenaasi (LDH) tsütotoksilisuse tuvastamise komplekti (Cayman Chemical, USA). Tsütotoksilisus arvutati järgmise valemiga: tsütotoksilisus ( protsent )=(seguraku katse-sihtrakk spontaanne-efektorrakk spontaanne)/(sihtrakk maksimum- sihtrakk spontaanne) × 100.

Reaalajas pildistamine

Kaksteist 10-nädalast C57BL/6 hiirt osteti ettevõttelt Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Hiina). Seejärel 1 × 10 kraadi 1,1'-oktadetsüül-3,3,3',3'-tetrametüülindokarbotsüaniinjodiidi (DiR) (Invitrogen) märgistatud kontroll

preadipotsüüdid või kiirgusest indutseeritud vananevad preadipotsüüdid resuspendeeriti 200 uL fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) ja süstiti 22 G nõelaga hiirte kõhuõõnde. Kolme päeva pärast süstiti läbi sabaveeni 5 × 10 kraadi allogeenseid NK-rakke (rakkude elujõulisus: 93.{7}},2 protsenti) 100 uL PBS-s. 10. päeval anesteseeriti hiired isofluraaniga. Fluorestsents tuvastati MS 100 Series In Vivo Imaging Systemiga (PerkinElmer, MA, USA).

Voolutsütomeetria

DiR-märgistatud põrna NK-rakkudega koos inkubeeritud SNC-de apoptoosi tuvastamiseks (rakkude elujõulisus: 91.8-93,2 protsenti), lõigati 1 × 10 kraadi SNC-d täpsusega 37 kraadi juures 10 minutit ja seejärel värviti. anneksiin V ja propiidiumjodiidi (PI) apoptoosi värvimiskomplektiga (Multisciences Biotech Co, Ltd., Hiina) vastavalt tootja protokollile. SNC-d piirati DiR-negatiivses asendis. NK-rakkude aktiveerimise testimiseks koguti hiire NK-rakud ja värviti mNK1.{11}}allofükotsüaniiniga (APC) (S17016D) ja hiire diferentseerumisklastriga 69-R-fükoerütriin-tsüaniin7 (mCD{{). 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) 4 kraadi juures 30 min. Seejärel töödeldi rakke CytodexCytoperm Plus komplektiga (BD Biosciences, USA) ja värviti hiire interferooniga gamma-brilliantviolett 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) 4 kraadi juures 30 minutit. Inimese NK-rakkude värvimine perforiin-APC(S16009A) viidi läbi, kasutades sama protokolli, mida kasutati ekstratsellulaarseks värvimiseks (CD56-fluorestseiini isotiotsüanaat [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) ja intratsellulaarne värvimine (perforiin-APC) (Biolegend).

Perifeerse vere NK-rakkude tuvastamiseks koguti 100 ui antikoagulandi verd. Hiire perifeerse vere jaoks lisati CD3-FITC, NK11-APC ja CD69-PE-Cy7. Inimese perifeerse vere jaoks lisati CD3-BV421 (OKT3) ja CD56-FITC ning inkubeeriti 20 minutit toatemperatuuril.

Seejärel lisati 400 µl 1 × erütrotsüütide lüsaati (BD Biosciences) ja inkubeeriti 3 minutit, millele järgnes kolm pesemist PBS-ga. Rakkude proliferatsiooni tuvastamiseks rasvkoes süstiti hiirtele intraperitoneaalselt 200 µl 10 mg/ml bromodeoksüuridiini (BrdU) 24 ja 72 tundi enne eutanaasiat. Pärast eutanaasiat eemaldati kubeme rasvalaod ja lõigati fragmentideks, digereeriti 37 °C juures 30 minutit kollagenaasi ll ja DNaasiga ning filtreeriti 100 um rakufiltriga. Rakke töödeldi Cytofix/Cytoperm Plus komplektiga ja värviti BrdU-FITC (3D4) ja Ki{13}}PE (16A8) abil. Voolutsütomeetria viidi läbi CytoFLEX voolutsütomeetriga. Kõikides katsetes kasutati surnud rakkude välistamiseks LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain komplekti (Thermo Fisher Scientific, USA). Andmeid analüüsiti FlowJo tarkvaraga (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivne PCR

RNA ekstraheeriti Trizol reagendiga ning pöörati ümber ja transkribeeriti cDNA-ks, kasutades Hair 1st Strand cDNA sünteesikomplekti (Yepsen Biotechnology, Hiina). Kvantitatiivne PCR (qPCR) viidi läbi, kasutades SYBR Greeni (Yepsen Biotechnology) reaktsioonisegu ABC QuantStudio 3 reaalajas PCR-süsteemis (Applied Biosystems, USA), kusjuures GAPDH toimis sisekontrollina. Andmeid analüüsiti meetodil 2-△ACt. Praimeri järjestuste loend on esitatud lisamaterjalis (tabel 2-3).

Vananemisega seotud -galaktosidaasi värvimine

Rakkude värvimiseks pesti rakke üks kord PBS-ga, fikseeriti vananemisega seotud galaktosidaasi (SA- -gal) lahuses (Cell Signaling Technology, USA) toatemperatuuril 15 minutit, pesti kolm korda PBS-ga ja inkubeeriti. üle öö SA- -gal värvimislahuses temperatuuril 37 °C. Plaat suleti parakilega, et vältida värvimiskeskkonna aurustumist. Rakud

pesti PBS-ga ja jälgiti mikroskoobiga. Külmutatud sektsioonide värvimiseks kuivatati sektsioone 37 kraadi juures 30min ja fikseeriti toatemperatuuril SA- -gal fikseerimislahuses 15 minutit. Sektsioone pesti kolm korda PBS-ga ja inkubeeriti üleöö SA- -gal värvimislahuses temperatuuril 37 °C. Seejärel värviti neid eosiiniga 1 minut ja loputati veega 2 minutit. SA- -gal värvimise andmeid analüüsiti tarkvara Image-Pro Plus 6.0 abil.

Inimese rasvkoe eksplantaadid

Kolmelt isikult saadi rasvkude rasvaimu abil. Üks katsealustest oli mees ja kaks olid naised. Uuritavate keskmine vanus oli 57.0±7,6 aastat (keskmine ±SD: vahemik, 50-65). Keskmine KMI oli 40,5±5,1 kg/m² (keskmine ± SD); vahemik, 36.{10}}.2). Shanghai Mengchao vähihaigla (nr. 05, 2020, Shanghai Mengchao vähihaigla meditsiinieetika komitee) eetikakomitee kiitis katseskeemi heaks. Kõigi vabatahtlike jaoks saadi teadlik nõusolek. Rasvkude lõigati väikesteks tükkideks, mille läbimõõt oli umbes 2 mm. 96-süvendite plaadi igasse süvendisse pandi viis koetükki ja 200 uL kas preadipotsüüte või konditsioneeritud söödet kiirgusest indutseeritud vananevatest preadipotsüütidest, millele oli lisatud 10 protsenti inimese AB seerumit, 1 protsenti L-glutamiini, 1 24 tunniks lisati kaaskultuurile protsent penitsilliini/streptomütsiini, 1 protsent MEM mitteasendamatuid aminohappeid ja 1 protsent naatriumpüruvaathapet. Seejärel asendati sööde värske söötmega, mis sisaldas 5 × 10 kraadi autoloogseid NK-rakke (rakkude elujõulisus: 92.3-95,7 protsenti 6) ja kultiveeriti veel 48 tundi, misjärel koguti NK-rakud voolutsütomeetria jaoks. Rasvkude pesti viis korda PBS-ga ja sama söödet lisati järgmiseks kultuuriks 48 tunniks; supernatanti (100 uL) kasutati mitmefaktoriliseks tuvastamiseks. Preadipotsüüdid või kiirgusest indutseeritud vananevad preadipotsüüdid saadi sama isiku rasvkoest.

See artikkel on välja võetud artiklist Rakusurm ja -haigused (2022) 13:305