Clr-f ekspressioon reguleerib neerude immuunsüsteemi ja metaboolset homöostaasi Ⅲ

Arutelu

Põletik ja immuunrakkude vahendatudkahjustused mängivad juhtivat rolli neerukahjustuse ja düsfunktsiooni tekkes ja progresseerumises. Selles uuringus kirjeldame Clr-f-i nõuet hooldusesneerude tervisja funktsioonsisemise homöostaatilise kontrollinaimmuun- ja metaboolne neerukahjustus. Meie leiud näitavad immuunrakkude infiltratsiooni ning immunoglobuliini ja komplemendi valkude ladestumist Clr-f-puudulike hiirte neerudes. Need Clr-f-puudulike hiirte immuunomadused on seotud vanusega seotud tubulaarsete ja glomerulaarsete kahjustuste ilmnemise, ektoopilise lipiidide akumulatsiooni ja paljude transkriptsiooniprotsesside düsregulatsiooniga.

Klõpsa, et neeruhaiguse raviks herba tsüstitanche teha

NKC-s kodeeritud Clr-valgud nende geneetiliselt seotud NKR-P1 retseptorite seas on olnud uurimise keskmes kui mitte-liigsed MHC I klassi sõltumatud vahendajad NKR-P1 ekspresseerivate immuunrakkude poolt 9, 27–31 puuduva enesetuvastuse korral. Samuti on teatatud, et valitud Clr-valkude suurenenud ekspressioon vastuseks rakustressile piirab funktsionaalselt kudedes elavate immuunrakkude immuunvastuseid 7, 12, 32. Sellest lähtuvalt arvati, et soole Clr-f aitab kaasa immuuntolerantsusele muidu väga immunogeenses soolestiku keskkonnas interaktsiooni kaudu inhibeerivate NKR-P1G retseptorit ekspresseerivate intraepiteliaalsete lümfotsüütidega7. Leibelt et al. näitas, et polü(I:C)-ga nakatatud hiirtel ilmnes suurenenud Clr-f ekspressioon ja et Clr-f/NKR-P1G interaktsioonid in vitro inhibeerivad tugevalt NKR-P1G ekspresseerivaid rakke. Neid leide koos võib tõlgendada kui potentsiaalset mehhanismi, mille abil Clr-f võib takistada soolestiku intraepiteliaalsete NKR-P1G positiivsete alamhulkade reaktiivsust epiteeli barjääri suhtes, mida pidevalt provotseerivad mikroobsed stiimulid7.

Clr-f-puudulike hiirte genereerimine andis meile esimese võimaluse hinnatafunktsionaalsed tagajärjedClr-f ekspressiooni in vivo ja võimaldas meil uurida Clr-f potentsiaalseid immuunsüsteemi homöostaatilisi rolle neerudes. Clr-f-/- hiirtel täheldatud neerukahjustus ühtib mudeliga, mille kohaselt Clr-f-i alareguleerimine on raku stressi ja vigastuse indikaator, mis vabastab piirangud NKR-P1G-d ekspresseerivatele efektorrakkudele. NKR-P1G suurenemine T-rakkudes Clr-f-/- hiirte neerudes viitab sellele, et Clr-f puudumisel suureneb NKR-P1G ekspressioon neerudes elavate T-rakkude hulgas või Clr-f-i neerudes. f-/- hiired infiltreeritakse NKR-P1G-d ekspresseerivate T-rakkudega. Tuvastatava muutuse puudumine NKR-P1G-d ekspresseerivate rakkude olemasolus või jaotuses Clr-f-/- hiirte soolestikus võib viidata sellele, et NKR-P1G funktsionaalsed tagajärjed: Clr-f interaktsioon soolestikus on piiratud. immuunreaktiivsuse kontrollimiseks pigem infektsiooni kui immuuntolerantsuse kontekstis. Alternatiivselt võivad üleliigsed interaktsioonid kontrollida ka NKR-P1G-d ekspresseerivate rakkude aktiivsust. Seda toetavad leiud, et NKR-P1G ei seondu mitte ainult Clr-f-ga, vaid ka Clr-d ja Clr-g33-ga, millest viimane on mõõdukalt ekspresseeritud nii neeru kui ka soolestiku kudedes6. Kuigi meie leiud näitavad, et Clr-f on vaja kaitsta autoimmuunse neerukahjustuse eest, on NKR-P1G-vahendatud roll Clr-f-/- hiirte autoimmuunsetes neerupatoloogiates puudulik. Nimelt, kuigi Clr-f-/-hiirte neerudes suureneb NKR-P1G-d ekspresseerivate T-rakkude arv, on erinevus tohutu. Võimalik, et Clr-f jälgimises neerudes osaleb alternatiivne retseptor. Selle neeru homöostaasi kontrolltelje täielikuks käsitlemiseks on vaja täiendavaid uuringuid

Immuunvahendatud neerukahjustust iseloomustab põletikuliste rakkude infiltratsioon interstitsiaalsesse ruumi või glomerulisse34. Monotsüütide, B- ja T-rakkude, glomerulaarsete vastaste antikehade, kõrgenenud IL-12 ja IFN tsütokiinide ning erinevate glomerulaarsete patoloogiate akumuleerumine Clr-f-/- hiirtel meenutab väga LN-hiirte mudelite autoimmuunset maastikku. st MRL-Faslpr)35–37. Kuigi Clr-f-/- neerudes on IgA domineerivad mesangiaalsed ladestused koos nendega seotud IgM ja IgG ladestumisega ning Clr-f-/- ja IgAN transkriptsiooniprofiilide rühmitus, on tõenäoliselt ennatlik arvata, et need fenotüübid viitavad teatud tüüpi CKD koos IgAN38-ga. Pigem on need vigastused koos mesangiolüüsi, GBM paksenemise ja podotsüütide surmaga Clr-f-/- neerudes, samuti tubulointerstitsiaalsed muutused, rasva kogunemine ja metaboolsete radade oluline düsregulatsioon paljude patoloogiate jaoks ühised elemendid. tuleneb immuunsüsteemi poolt süvendatud metaboolsetest defektidest37,39,40. Olenemata Clr-f-/- hiire neerufunktsiooni häire algpõhjusest või haiguse tüübist näib, et Clr-f mängib kergendavat rolli selge glomerulonefriidiga seotud patoloogiaga autoimmuunsuse tekke vastu.

Meie Rag1-/-Clr-f-/- hiirte uurimine näitab T- ja B-rakkudest sõltumatute vahendajate märkimisväärset panust Clr-f-/- hiirte autoimmuunvastustesse. Eelkõige oli periglomerulaarsete CD11c+ rakkude, F4/80+ rakkude ja NKp46+ rakkude kuhjumine veelgi suurem T- ja B-rakkude puudumisel ning korreleerus glomerulaarsete kahjustuste olulise esinemisega. See viitab sellele, et kuigi T- ja B-rakud võivad soodustada neere kahjustavat põletikku ja autoantikehade komplekse, ei pruugi need Clr-f-/- hiirtel olla patoloogia kesksed määrajad, vaid kas sekundaarsed panustajad teiste immuunrakkude põletikulisele aktiivsusele või potentsiaalselt täidavad immunoreguleerivat rolli hiirtel, kellel puudub Clr-f. See vastandab IgAN-i ddY hiiremudeli tõendeid, mis näitavad tugevat T1 polariseeritud vastust, kusjuures IFN-i tootvad T-rakud suurenevad koos vanusega ja glomerulaarkahjustuse progresseerumisega41. B-rakkude neerude infiltratsiooni Clr-f-puudulike hiirte puhul on näidatud ka SLE42 hiiremudelites. Praeguseks on ebaselge, kas neeru B-rakud aitavad kaasa kroonilise neeruhaiguse kahjustavale põletikule või mängivad rohkem reguleerivat rolli43. Hiljutised tõendid kroonilise neeruhaiguse kohta eakatel patsientidel näitasid, et B-rakkude populatsiooni vähenemine oli seotud neeruhaiguse progresseerumisega44. Nii T- kui ka B-rakkude tõendid on näidanud, et neil on immuunsupressiivne toime autoimmuunsete neeruhaiguste korral 45, 46 ja seetõttu vajab edasist uurimist, mil määral need aitavad kaasa või reguleerivad Clr-f-/- hiirte patoloogiaid.

Meie leiud koos näitavad Clr-f ekspressiooni nõuet proksimaalsete keerdunud tuubulite, podotsüütide ja/või sooleepiteeli tubulaarses epiteelis. Clr-f ekspressiooni kadumine põhjustab väljendunud autoimmuunse ja põletikulise kaskaadi, mis põhjustab neerukahjustusi ja sellega seotud rasvumist. Clr-f kaotusest tingitud immuunvastused näivad olevat T- ja B-rakkudest sõltumatud. Üldiselt võib Clr-f-i funktsionaalset rolli neerudes ette kujutada kui pärssivat molekuli neerude efector-immuunrakkude jälgimiseks, nagu see on soolestikus, või kuitorukujulise raku funktsiooni sisemine regulaator.

Materjalid ja meetodid Hiired.

Kõiki hiiri hoiti spetsiaalses patogeenivabas keskkonnas. C57BL/6 (WT) ja B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) hiired saadi Jacksoni laborist (Bar Harbor, ME, USA). Hiired, kes kandsid Rag1 ja Clr-f kombineeritud nullmutatsioone (Rag1-/-; Clr-f -/-), loodi Clr-f-puudulike (Clr f -/-) hiirte ristamise teel (Rag1-/-) hiirtega. . Kõik loomadega tehtud aretus ja manipulatsioonid olid kooskõlas ülikooli juhistega ning heaks kiidetud Dalhousie ülikooli loomade eetikakomitee ja Ottawa ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) poolt. Kõik loomkatsete kavandid, katsed ja aruandlus viidi läbi vastavalt ARRIVE juhistele.

Clr-f-puudulike hiirte genereerimine. Clr-f-puudulikud (Clr-f -/-) hiired genereeriti sihtkonstruktsiooni homoloogse rekombinatsiooni teel, mis sisaldas rebase fosfoglütseraatkinaasi (PGK)-neomütsiini kassetti ja genoomset järjestust, mis hõlmab eksoneid 3, 4 ja osa eksonist 5. Clr-f geen. Täielik sihtimiskonstruktsioon kinnitati sekveneerimisega Ottawa haiglate uurimisinstituudis (OHRI) enne elektroporatsiooni C57BL/6 Bruce-4 embrüonaalsetesse tüvirakkudesse (ES). ES kloonide valiku G{{10}}resistentsuse järgi teostas IRCM (Montreali kliiniliste uuringute instituut) transgeenne põhirajatis (Montreal, QC, Kanada). Vahepeal testiti 5' ja 3' Clr-f sonde restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüsis, kasutades WT B6 hiire tüümuse genoomset DNA-d, mida lõigati vastavalt BamHI ja PstI-ga. Seeditud DNA fragmendid lahutati 1% agaroosgeelil ja kanti nailonmembraani blotidele. Clr-f cDNA sondid märgistati radioaktiivse 32P-dCTP-ga (Perkin Elmer, Guelph, ON, Kanada), kasutades NEB partii komplekti (New England Biolabs, USA). Blotte sondeeriti 32P-märgistatud Clr-f cDNA sondidega hübridisatsioonilahuses (10% (mass/maht) dekstraansulfaat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hübridiseerimine viidi läbi üleöö temperatuuril 65 kraadi ja hübridiseerimisjärgsed pesud viidi läbi lahusega, mis sisaldas 2 × SSC ja 1% SDS-i, mis oli eelnevalt soojendatud 65 kraadini. Te blotid eksponeeriti fotofilmidele, et paljastada hübridisatsioonisignaalid (joonised S1A, S3B). Membraanid eemaldati 0,2% SSC/0,2% SDS-ga 30 minuti jooksul 85 kraadi juures erinevate hübridisatsioonide vahel. Neomütsiiniresistentseid kloone skriiniti Southern blot analüüsiga ja täheldati sihtimise efektiivsust ~ 15%. Valitud ES kloonid mikrosüstiti blastotsüstidesse IRCM Microinjection Service Facility'is, et genereerida kimäärsed Clr-floxi asutajahiired. Hiiri sõeluti Southern blot analüüsiga ja seejärel aretati B6 emasloomadega, et saada Clr-fwt/lox heterosügootseid hiiri. Heterosügootsed hiired lõigati Clr-flox/lox hiirte saamiseks. Neomütsiini kasseti eemaldamiseks kasvatati Clr-flox/lox hiiri homosügootsete CMV-cre transgeensete hiirtega B6 taustal (Jackson Laboratory). Saadud topeltheterosügootne CMV-CreTg/0; Clr-f-/+ hiired lõigati, et saada Clr-f-/- hiiri, kellel puudus CMV-cre transgeen. Hiirte genotüüp määrati spetsiifiliste praimerite abil (tabel 1, joonis S1B, C ja joonis S3C, D). PCR amplifikatsioon viidi läbi, kasutades AccuStart II Taq DNA polümeraasi (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). PCR segu valmistati järgides tootja juhiseid. Matriitsina kasutati fenooli/kloroformi ekstraheeritud kõrva DNA-d. Kasutati järgmisi PCR tsükliparameetreid: 30 amplifikatsioonitsüklit 94 kraadi 40 sekundi jooksul, 60 kraadi 45 sekundit, 72 kraadi 60 sekundit. Kõigis katsetes kasutati WT ja Clr-f -/- pesakonnakaaslasi, kui pole teisiti näidatud.

In situ hübridisatsioon.

Clr-f in situ hübridisatsioonianalüüsid saavutati täispika senss-ahela CDS ja Clr-f-i hõlmava antisenss-ahela kloonimisega pGEM-T Easy vektorisse, nagu eelnevalt kirjeldatud. Digoxi geniiniga märgistatud antisenss- ja senss-RNA sondid transkribeeriti Clr-f geeni kodeerivatest lineariseeritud plasmiididest T7 polümeraasiga, kasutades DIG RNA märgistussegu (Roche, Basel, Šveits). Koed koguti täiskasvanud B6 hiirtelt ja fikseeriti kas 10% formaliinis toatemperatuuril või 4% paraformaldehüüdis 4 kraadi juures õrnalt loksutades kuni 24 tundi. Seejärel sisestati koed parafiini ja slaididele valmistati 4 µm lõigud. Koeslaidid dekarboneeriti, töödeldes 0,2 N HCl-ga 15 minutit ja 30 µg/ml proteinaas K-ga 37 kraadi juures 20 minutit. Kude fikseeriti 4% PFA-s 10 minutit, millele järgnes töötlemine 0,25% äädikhappe anhüdriidiga 0,1 M trietanoolamiinis kaks korda 5 minutit. Seejärel hübridiseeriti slaidid hübridisatsioonilahusega (50% (maht/maht) formamiid/5 × SSC, pH 4,5; 2% (mass/maht) blokeeriv pulber (Roche); 0,05% (mass/maht)) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/ml hepariin; 1 µg/mL pärmi RNA) 58-kraadises ahjus vähemalt 1 tund ja seejärel inkubeeriti hübridisatsioonilahusega, mis sisaldas 500 ng/ml digoksigeniiniga märgistatud sondi, öö läbi 58 kraadi juures. Hübridisatsioonijärgsed pesud viidi läbi 50% formamiidi/2 × SSC-ga, pH 4,5 55 kraadi juures 3 korda 20 minuti jooksul ja objektiklaasid värviti lamba digoksigeniini vastase leeliselise fosfataasiga konjugeeritud antikehaga lahjenduses 1:1000 blokeerimislahuses ( Roche). Värvuse arendamiseks lisati slaididele nitrosinise tetrasoolium/5-bromo, 4-kloro ja 3-indoüülfosfaat (NBT/BCIP, Roche). Slaide hoiti toatemperatuuril pimedas kuni optimaalsete signaalide ilmumiseni. Kontrollmärgistamine viidi läbi, kasutades senss-ahela sondi ja konkureerivaid sidumisuuringuid senss- ja antisenss-sondidega, mille spetsiifilisus oli kinnitatud. Seejärel värviti slaidid helerohelise või metüülrohelisega ja visualiseeriti valgusmikroskoobi all.

RT-PCR. Vanuse ja sooga WT ja Clr-f −/− hiirte neerukuded lõigati välja, loputati PBS-ga ja külmutati -80 kraadi juures. RNA eraldati külmutatud kudedest, kasutades RiboZol RNA ekstraheerimisreagenti (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA), järgides tootja juhiseid. Ligikaudu 1 ug RNA-d transkribeeriti cDNA-ks, kasutades Verso cDNA komplekti (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). PCR amplifikatsioon viidi läbi 1 μl cDNA produktiga, kasutades spetsiifilisi praimereid (tabel 1). Kasutatud PCR tingimused olid 94 kraadi 30 sekundit, 58 kraadi 30 sekundit, 72 kraadi 60 sekundit ja 35 amplifikatsioonitsüklit. PCR produktid visualiseeriti 1% agaroosgeelil, mis oli värvitud etiidiumbromiidiga (joonis 1C, joonis S3A).

Immunohistokeemia.

Vanuse ja sooga WT ja Clr-f −/− hiirte neerukude deparafineeriti kolme 5-minutise inkubeerimisega ksüleenis, kahe 5-minutise inkubeerimisega 100% etanoolis, millele järgnes 90 % etanooli, siis 80 % etanooli ja lõpuks 70 % etanooli. Slaidid rehüdreeriti, pestes neid destilleeritud vees (20 kastmist) ja kuumusega indutseeritud epitoopide otsimine viidi läbi survekeetja abil tsitraatpuhvris (pH 6,0). Endogeensed peroksidaasid blokeeriti 3% vesinikperoksiidiga steriilses vees 10 minuti jooksul ja valgud blokeeriti Background Sniperi abil (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). Seejärel inkubeeriti sektsioone öö läbi 4 kraadi juures roti hiirevastaste monoklonaalsete Clr-f-vastaste antikehadega7. Järgmisel päeval loputati slaidid 0, 1 M PBS-ga ja inkubeeriti 1 tund sekundaarsetes antikehades. Värvimine töötati välja Goat-on-Rodent HRP-Polymer komplekti (Biocare Medical) ja Betazoid DAB puhvri (Biocare Medical) abil, millele järgnes hematoksüliini vastuvärvimine. Sama protsessi kasutati ka neerukoe lõigu värvimiseks NKp46+ ja CD{3+ rakkude IHC-märgistamiseks, kasutades anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, kloon 29A1.4, CAT#). 48-3351-82) ja anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) vastavalt primaarsete antikehadena. F4/80 IHC märgistamine viidi läbi külmutatud neerulõikudel, kasutades anti-F4/80 roti monoklonaalset BM8 antikeha. Kitse rotivastase IgG H&L HRP-ga konjugeeritud sekundaarset antikeha (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) kasutati nagu eespool ja IHC-d töötati koos välja, mädarõika peroksidaasi (HRP) substraati kasutati DAB Substrate Kit (Abcam, CAT#). ab64238).

Immunofluorestsents.

Vanuse ja sooga WT ja Clr-f −/− hiirte neeru- ja/või soolekudesid külmsäilitati 30% sahharoosis temperatuuril –80 kraadi Tissue-Tek optimaalse lõiketemperatuuri segus (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 20 μm krüostaadi sektsioonid fikseeriti atsetooniga tõmbekapis toatemperatuuril 16 minutit ja kuivatati õhu käes vähemalt 30 minutit pärast pesemist 0, 01 M PBS-is, pH 7, 4. Mittespetsiifiline seondumine blokeeriti 10% eesli seerumiga. Sektsioone inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures primaarsete antikehadega: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (varem kirjeldatud hiirevastane monoklonaalne antikeha7), anti-IgA (kitse hiirevastane IgA alfaahel (Abcam, Cambridge). , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), komplement C3 Anti body (11H9) ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA kat. nr NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116) ja anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) kontsentratsiooniga 1:100 5% normaalses seerumis niisutatud kambris. Anti-antikeha sekundaarne märgistus -Clr-f ja anti-NKR-P1G antikehad, kasutades FITC konjugeeritud polüklonaalseid antikehi viidi läbi toatemperatuuril 1 h inkubatsiooni.Proovid värviti DAPI tuumaga toatemperatuuril 5 minutit, pesti PBS-ga ja paigaldati slaididele ühe tilga VECTASHIELDiga PLUS pleekimisvastane paigalduskandja (Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) ja kaetud klaasist katteklaasiga. Slaide uuriti Zeiss LSM 510 laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga.

Histoloogia ja patoloogia hindamine.

Vanuse ja soo järgi sobitatud WT, Clr-f −/−, Rag1−/− ja Rag1−/−Clr-f −/− hiirte (3 μm) neerulõigud värviti perioodilise happe-Schifiga (PAS). Neerukude hinnati mesangiaalse rakulisuse (määratletud kui 4 või enama tuuma mesangiaalse piirkonna kohta), endokapillaaride proliferatsiooni, poolkuude ja glomerulaarskleroosi suhtes. Sektsioone hinnati ka tubulopaatia, interstitsiaalse fibroosi, tubulaarse atroofia ja tubulointerstitsiaalsete rakkude infiltraatide suhtes. Glomerulipatoloogia hindamisel kasutati glomerulaarkahjustuse astme hindamiseks poolkvantitatiivset skoori. Igas rühmas uuriti vähemalt 50 glomeruli ja kahjustuse raskusaste määrati 0-st+3: a+1 kahjustus esindas vähem kui 30% või sellega võrdset. glomerulusest, +2 30–60%, samas kui +3 kahjustus näitas, et kaasatud oli 60% või rohkem glomeruli. GBM paksuse mõõtmine viidi läbi WT ja Clr-f −/− glomerulaarsete elektronmikrograafidega, kasutades pilti J V1.53a47. Kahe Rag1−/− ja kahe Rag1−/−Clr-f −/− hiire PAS-värvitud neerukude hinnati lisaks pimesi ülaltoodud patoloogiliste tunnuste esinemise suhtes ja kvantifitseeritud tunnused arvutati keskmise nelja neeruosa põhjal. hiir.

Elektronmikroskoopia.

Kudede töötlemine ülekandeelektronmikroskoopia jaoks järgis avaldatud protokolli48. Lühidalt, 12-nädala vanuste WT ja Clr-f −/− hiirte neerukudede väikesed tükid fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdi lahuses ja töödeldi seejärel 1% osmiumtetroksiidi/uranüülatsetaadi meetodil. Proovid sisestati Epon Araldite vaigusse enne lõikamist, kasutades Reichert-Jung ultra cut E ultramikrotoomi. Proovid visualiseeriti JEOL JEM 1230 ülekandeelektronmikroskoobiga ja pildid jäädvustati Hamamatsu ORCA-HR digitaalkaameraga.

Uriini ja plasma keemiliste jäätmete ja elektrolüütide mõõtmine.

Umbes 150 μL uriini koguti iga päev 12-nädala vanustelt isastelt WT ja Clr-f −/− hiirtelt samal kellaajal 5 järjestikuse päeva jooksul. Uriini tsentrifuugiti prahi eemaldamiseks kiirusel 10, 000 p/min ja säilitati seejärel temperatuuril –80 kraadi. Näoveenide veri koguti samadelt hiirtelt hepariniseeritud katsutitesse ja eraldati tsentrifuugimisega 3000 g juures 5 minutit ja säilitati temperatuuril -80 kraadi. Uriini- ja plasmaproovid saadeti Idexx Laboratories'ile (Markham, Ontario) valgu, kreatiniini ja elektrolüütide kontsentratsiooni mõõtmiseks.

Vererõhu mõõtmine 12 ja 24 nädala vanustel hiirtel. Süstoolset ja diastoolset vererõhku (BP) mõõdeti saba-manseti pletüsmograafia abil 12-nädalastel ja 24-nädalastel isastel WT ja Clr-f −/− hiirtel püsiseisundis, kasutades BP2000 Visitechi mudelit. BP-d mõõdeti iga päev samas ruumis ja samal kellaajal 5 järjestikuse päeva jooksul. Keskmise BP väärtuse arvutamiseks kasutati viimase 3 järjestikuse mõõtmise BP väärtusi, kuna esimest 2 päeva peeti hiirte kohanemise jaoks oluliseks.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30 × 106 lugemissügavus proovi kohta.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 ja logi voltimise muutuse piirväärtus 1,5. Esitatakse kõigi ajapunktide ja proovide FPKM väärtused (täiendav andmekogumi fail 1). Funktsionaalse rikastamise analüüs. Geeni ontoloogia ja funktsionaalse rikastamise analüüs viidi läbi, kasutades g: Profilerit (versioon e102_nt49_p15_7a9b4d6) koos g: SCS mitme testimise parandusmeetodiga, rakendades olulisuse läve 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 ja PANTHER klassifikatsioonisüsteem Fisheri täpse testimise ja FDR-lävega<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

Funktsionaalsed rikastusvõrgud loodi Mus Musculuse (GRCm38. p6) GO Biological Processes (GO: BP) geenikomplektide abil BioMarti väljalase: 2020-12-08 alla laaditud saidilt g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) viidi läbi, kasutades GSEA V4.0354,55, kasutades FDR-il põhinevat võrgurikastamist.<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

Kõhuõõne ja emakaväline lipiidide analüüs. Rasva kogunemine määrati üksikutelt hiirtelt eraldatud kõhurasva massi järgi. Kehakaalu mõõtmised tehti enne rasva ekstraheerimist. Oil Red O (ORO) värvimiseks lõigati külmutatud neerulõigud krüostaadi abil 10 μm juures ja kuivatati seejärel õhu käes 30 minutit. ORO värvimine viidi läbi, fikseerides lõigud 3 pesukorraga 60% isopropanooliga, inkubeerides neid 15 minuti jooksul ORO lahuse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) töökontsentratsiooniga (66%). Seejärel pesti slaide kiiresti 60% isopropanooliga, värviti tuumade esiletõstmiseks kiiresti Mayeri hematoksüliiniga ja paigaldati seejärel VectaMount AQ Aqueous Mounting Media (Vector Laboratories) abil.

Patotüübi analüüs. Patotüübi analüüs viidi läbi, kasutades diferentsiaalselt ekspresseeritud geene (DEG) koos q-ga<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

Seeditud kude lasti läbi 70- μm nailonfiltri, pesti PBS-iga ja ülejäänud punaseid rakke lüüsiti ACK lüüsipuhvriga 5 minutit jääl. Neeru immuunrakud eraldati RT-tsentrifuugimisega kiirusel 2000 p/min 30 minutit 40% Percollis. Rakupellet resuspendeeriti PBS-is ja rakkude arv saadi hemotsütomeetriga. Rakupinna valgu ekspressiooni kontrollimiseks kasutati erinevaid mAb-sid, rakud värviti lindude tsütomeetria analüüsiks fluorokroomiga märgistatud hiire antikehadega: anti-CD45 (eBioscience, kloon 30-F11), anti-TCR (eBioscience, kloon H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, kloon PK136), anti-CD19 (BioLegend, kloon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, kloon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, kloon BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, kloon M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, kloon 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, kloon 29A1.4) ja isotüübi kontrollid. Rakkude elujõulisus määrati Fixable elujõulisuse värviga (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Immuunrakkude populatsioonide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks WT ja Clr-f −/− neerudes kasutati neutrofiilide (CD11b+Ly6G+), makrofaagide (CD11b+Ly6G−F4/{) rakuspetsiifiliste markerite vastaseid antikehi kasutades multiparameetrilisi lindude tsütomeetrilisi analüüse. {57}}MHCII+), NK-rakud (CD11bloLy6G−TCR −NK11+) ja NKp46+rakud (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), T-rakud (Ly6G−NK1) .1−TCR +) ja B-rakud (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Kõik proovid saadi BD-Fortessa linnutsütomeetriga.

Viited

1. Hato, T. & Dagher, PC Kuidas kaasasündinud immuunsüsteem tajub probleeme ja põhjustab probleeme.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1459–1469 (2015).

2. Krüger, T.et al.Dendriitrakkude identifitseerimine ja funktsionaalne iseloomustus terves hiire neerus ja eksperimentaalseltglomerulonefriit.J. Am. Soc. Nephrol.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Dendriitrakud ja makrofaagid: Sentinels neerus.Clin. J. Am. Soc. Nephrol.10, 1841–1851 (2015).

4. Woltman, AMet al.Dendriitrakkude alamhulkade kvantifitseerimine inimese neerukoes normaalsetes ja patoloogilistes tingimustes.Kidney Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Batf3-sõltuvad dendriitrakud neeru lümfisõlmedes kutsuvad esile tolerantsuse ringlevate antigeenide suhtes.J. Am.Soc. Nephrol.24, 543–549 (2013).

6. Zhang, Q.et al.Hiire Nkrp{0}}Clr geeniklastri järjestuse ja ekspressioonianalüüsid näitavad koespetsiifilise MHC säilimistsõltumatu immuunseire.PLoS One7, e50561 (2012).

7. Leibelt, S.et al.Hiire sooleepiteeli spetsiaalne immunosenseerimine, mida hõlbustab paar geneetiliselt seotud lektiinitaolistretseptorid.Limaskestade immunool.

8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Hiire NKR-P1B: Clr-b äratundmissüsteem on kaasasündinud immuunvastuste negatiivne regulaator.Veri125, 2217–2227 (2015). 

9. Carlyle, JRet al.Inhibeerivate NKR-P1 looduslike tapjarakkude retseptorite poolt puudub Ocil/Clr-b enesetuvastus.Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: uudne immuunsüsteemiga seotud C-tüüpi lektiinitaoline molekul, mida ekspresseerib eranditult hiire sooleepiteel.J. Immunol.198, 916–926 (2017).

11. Balaji, GRet al.Peremeesorganismi Clr-b äratundmine inhibeeriva NKR-P1B retseptori poolt annab aluse puuduva enesetuvastuse jaoks.Nat.Commun.9, 4623 (2018)

12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Select Clr-g ekspressioon aktiveeritud dendriitrakkudel hõlbustab sugulaslikku interaktsioonipõrna NK-rakkude väikese alamhulgaga, mis ekspresseerivad inhibeerivat Nkrp1g retseptorit.J. Immunol.200, 983–996 (2018). 

13. Abou-Samra, E.et al.NKR-P1B ekspressioon soolestikuga seotud kaasasündinud lümfoidrakkudes on vajalik seedetrakti kontrollimisekstrakti infektsioonid.Kamber. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).

14. Germain, C.et al.CLEC2D geeni alternatiivselt splaissitud transkriptivariantide iseloomustus.J. Biol. Chem.285, 36207–36215 (2010).

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

SAAN 25% EHHINAKOOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIK ORGAANILINE KISTANŠEKSTRAKT NERENFEKTSIOONIDE PUHUL