Cistanche Tubulosast pärit kalkooni süntaasi kloonimine, funktsionaalne tuvastamine ja ekspressioonianalüüs Ⅱ

3 Tulemused ja analüüs

3.1 CtCHS geeni kloonimine

Cistanches tubulosa lillede transkriptsiooniandmete abil sõeluti välja neli järjestust, millele on märgitud "kalkoonsüntaas". NCBI Blast võrdluse käigus leiti, et ainult ühel järjestusel oli CHS geeni täispikkus ja FPKM oli suurem kui 10. Selle järjestuse põhjal kavandati spetsiifilised praimerid ja umbes 1200 aluspaari pikkune fragment saadi PCR amplifikatsiooniga, kasutades Cistanches tubulosa lille cDNA matriitsina (joonis 1). PCR produkt eraldati geelist ja ühendati pCE2TA/Blunt-Zero vektoriga. Sekveneerimise tulemused olid kooskõlas transkriptoomianalüüsiga. Geen sai nimeks CtCHS. Järjestuse pikkus on 1173 aluspaari ja kodeerib 390 aminohapet.

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood

3.2 CtCHS-i bioinformaatika analüüs

3.2.1 CtCHS füüsikalised ja keemilised omadused ning transmembraanse domeeni analüüs

CtCHS geeni poolt kodeeritud valgu füüsikaliste ja keemiliste omaduste analüüsimiseks kasutati võrgutarkvara ProtParam. CtCHS kodeerib 390 aminohapet, molekulaarvalem on C1908H3041N511O562S22, suhteline molekulmass on 42 836,54, teoreetiline isoelektriline punkt on 5,85 ja see on ebastabiilne. Koefitsient II on 43,24, mis on ebastabiilne valk, ja üldine keskmine hüdrofiilsus (GRAVY) on –0,052, mis on hüdrofiilne valk. Prot Scale võrgutööriista kasutati täiendavalt valgu hüdrofiilsuse/hüdrofoobsuse analüüsimiseks. Analüüsi tulemused näitasid, et CtCHS valgu hüdrofiilsuse/hüdrofoobsuse maksimaalne väärtus oli 2,422 (342) ja minimaalne väärtus –2,489 (119). CtCHS geeni poolt kodeeritud aminohappepeptiidahelas on rohkem hüdrofiilseid aminohappejääke kui hüdrofoobsetes aminohappejääkides, seega on tegemist hüdrofiilse valguga. Valgu transmembraanse struktuuri ennustamiseks kasutati võrgutarkvara TMHMM. CtCHS valgul puudub transmembraanne domeen.

Joonis fig 1 CtCHS geeni PCR amplifikatsioon

3.2.2 CtCHS valgu sekundaarstruktuuri ja tertsiaarse struktuuri ennustamine

Valgu sekundaarstruktuuri ennustamiseks kasutati veebipõhist tööriista SOPMA. Tulemused on näidatud joonisel 2-A. 44,87% -heeliksid, 31,03% juhuslikud mähised, 15,64% pikendatud ahelad ja 8,46% -lehed moodustavad CtCHS valgu sekundaarse struktuuri. taseme struktuur. Valgu tertsiaarse struktuuri ennustamiseks kasutati veebipõhise analüüsi tarkvara SWISS-MODEL ja CtCHS valgu kolmemõõtmelise struktuuri ennustamiseks kasutati mallina riisi CHS1 kristallstruktuuri. Tulemused on näidatud joonisel 2-B. Cistanche tubulosa CtCHS ja riisi CHS1 vaheline konsistents on 83,55%.

3.2.3 Järjestuste võrdlemine ja fülogeneetilise puu analüüs ja rakendamine

DNAMAN tarkvara võrdleb homoloogiat CtCHS ja teiste liikide CHS aminohappejärjestuste vahel. Tulemused on näidatud joonisel 3-C. CtCHS aminohappejärjestus on kooskõlas Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) ja Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) ja Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). CHS-i aminohappejärjestused on väga sarnased, sarnasus on 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% ja 81,61%.

LOODUSLIK ORGAANILINE KISTANŠEKSTRAKT 30% EHHINAKOOSIIDI JA 12% AKTEOSIIDIGA

Lisaks näitas mitme järjestuse joondamine, et CtCHS on konserveerunud katalüütilised jäägid Cys164, His303 ja Asn336. Cistanche tubulosa CtCHS evolutsioonilise positsiooni paremaks mõistmiseks taimede CHS perekonnas kasutati MEGA-X tarkvara, et konstrueerida fülogeneetiline puu teiste taimede CtCHS ja CHS valkude vahel. Tulemused on näidatud joonisel 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS on tihedalt seotud.

3.3 CtCHS prokarüootne ekspressioon ja puhastamine

Plasmiid pET-28a-CtCHS transformeeriti E. coli ekspressioonitüvesse BL21 (DE3) ja valgu ekspressioon indutseeriti madalal temperatuuril IPTG abil. Valk puhastati nikliioonafiinsuskromatograafia kolonniga ja puhastatud valk tuvastati 10% SDSPAGE abil. Tulemused on näidatud joonisel 3. CtCHS valgu riba ilmus 40,000 lähedal, mis on kooskõlas CtCHS valgu suhtelise molekulmassiga 42 800.

3.4 CtCHS ensüümi aktiivsuse analüüs

CtCHS-i funktsiooni tuvastamiseks inkubeeriti puhastatud CtCHS-valku malonüül-CoA-ga, 4-kumaroüül-CoA-ga ning saadused tuvastati HPLC ja MS-i abil. Looduslikes tingimustes on naringeniin-kalkoon lahuses ebastabiilne ja tsükliseerub kergesti naringeniiniks. Seetõttu valiti standardkontrolliks naringeniin-kalkoon ja naringeniin.

HPLC testi tulemused on näidatud joonistel 4-A ja B. Ensüümi reaktsiooniprodukti retentsiooniaeg on sarnane naringeniini standardi omaga. Mõlemal on UV-neeldumisspektris maksimaalne neeldumine 289 nm juures, mis erineb naringeniin-kalkooni retentsiooniajast. Aja- ja UV-neeldumisspektrid olid erinevad, kuid negatiivse kontrollina ei sisaldanud toode pärast kõrgel temperatuuril inaktiveeritud CtCHS valgu substraadiga inkubeerimist naringeniini, kalkooni ja naringeniini. Täiendav massispektromeetria abil tuvastamine näitas esimese taseme massispektrit (joonis 4-C, D), et ensüümi reaktsiooniproduktil on [MH]-piik m/z271.060 97, naringeniinil aga [MH ]-tipp m/z 271.{13}}.

Võrreldes MS2 spektreid (joonis 5-E, F), on CtCHS ensüümi reaktsiooniproduktil ja naringeniinil mõlemal iseloomulikud fragmendi piigid m/z 107, 151 ja 177 juures, mis on kooskõlas kirjanduse aruandega [19], mis näitab, et CtCHS-il on kalkoonkompleks. Ensümaatiline aktiivsus, see võib katalüüsida malonüül-CoA ja 4-kumaroüül-CoA reaktsiooni naringeniin-kalkooniks.

3.5 Subtsellulaarse lokaliseerimise analüüs

CtCHS valgu rolli uurimiseks rakkudes konstrueeriti pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plasmiid ja transformeeriti Arabidopsis thaliana protoplastideks, et jälgida selle subtsellulaarset lokaliseerumist. Tulemused on näidatud joonisel 5. Kontrollina jaotati pCAMBIA1300-35S-GFP valk tuumas ja tsütoplasmas, samas kui pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS sulandvalk jaotus peamiselt tsütoplasmas, mis näitab, et CtCHS valk võib toimida taimerakkude tsütoplasmas. Funktsioon.

3.6 CtCHS ekspressioonimustri analüüs

qRT-PCR-i kasutati CtCHS suhtelise ekspressiooni tuvastamiseks Cistanche deserticola lilledes kolme värviga: valge, lilla ja punane. Tulemused on näidatud joonisel 6. CtCHS ekspressioon lillades ja punastes õites oli oluliselt kõrgem kui valgetel õitel. kogus. Võrreldes valgete õitega on CtCHS ekspressioonitase lilladel õitel 8,44 korda kõrgem ja punaste lillede CtCHS ekspressioonitase 3,21 korda kõrgem. Need tulemused näitavad, et muutused CtCHS ekspressioonitasemetes võivad olla seotud Cistanche deserticola õievärvi erinevusega. Mida kõrgem on ekspressioonitase, seda tumedam on lillevärv. , mida madalam on väljendusaste, seda heledam on lillevärv.

****P＜0.000 1Joon. 6 CtCHS suhteline ekspressioonitase erinevat värvi lilledel

4 Arutelu

CHS on avõtmeensüüm flavonoidide biosünteesi rajasja on seotud the lillevärvi reguleeriminepaljudes taimedes. Näiteks lillevärvDianthus chinensisL.[20] ja Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] on kõik CHS-st mõjutatud. kontroll.Cistanches tubulosaon peamiselt kolme õievärviga: valge, punane ja lilla, kuid selle lillevärvi reguleerimise mehhanismi pole veel teatatud. Selles uuringus klooniti CtCHS geen, kasutades RT-PCR kauduCistanches tubulosa lillede transkriptsiooniandmete analüüs, ja selle

Bioinformaatika analüüsviidi läbi ja tulemused näitasid, et CtCHS-il on suur sarnasus ja tihe geneetiline seos Physalis nigra (AHJ80976.1) ElCHS-i aminohappejärjestusega. CHS on III tüüpi polüketiidi süntaas (PKSIII) ja uuringud on leidnud, et CHS-il on konserveerunud Cys-His-Asn katalüütiline triaad [23]. Selles uuringus näitas aminohappejärjestuse joondamise analüüs, et CtCHS-il on konserveerunud katalüütilised jäägid Cys164, His303 ja Asn336, mis näitab, et CtCHS-il võib olla tüüpiline kalkooni süntaasi funktsioon.

võimeline. Ensüümi aktiivsuse analüüs viidi läbi, kasutades CtCHS valgu prokarüootset ekspressiooni Escherichia colis ja tuvastati HPLC ja MS abil. Leiti, et CtCHS valk võib katalüüsida 4-kumaroüül-CoA ja malonüül-CoA, et toota naringeniin-kalkooni.

CHS osaleb paljudes taimedes flavonoidide sünteesis, kuid selle subtsellulaarne paiknemine on erinevatel liikidel erinev. Näiteks Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Kõik eaCHS[26] asuvad tsütoplasmas, samas kui Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], baklažaan Solanum melongena L. SmCHS [28] paikneb tsütoplasmas ja tuumas ning viinamarja Vitis vinifera L. VvCHS paikneb tsütoplasmas, tuumas ja rakuseinas [29]. Selles uuringus kasutati Arabidopsis thaliana protoplastide transformeerimiseks plasmiidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ja täheldati, et CtCHS valk paiknes peamiselt tsütoplasmas ja võib katalüüsida naringeniin-kalkooni tootmist tsütoplasmas. soodustab flavonoidide kogunemist.

Fenüülpropanoidi rada hargneb 4-kumaroüül-CoA-st flavonoidide sünteesi rajaks ja lignaani biosünteesi rajaks. CHS katalüüsib 4-kumaroüül-CoA-d ja malonüül-CoA-d, et tekitada naringeniini ja kalkooni flavonoidide initsieerimiseks. Ühenditaoliste ühendite biosünteesirada on selle raja esimene võtmeensüüm [30]. Seetõttu on kõrge ekspressiooniga CHS kasulik taimedele, et koguda rohkem flavonoide ja toota tumedamaid õisi. Näiteks Hosta plantaginea (Lam.) Aschersi lillaõieliste sortide CHS ekspressioonitase on kõrgem kui valgeõielistel sortidel. Hosta HpCHS muundatakse tubakaks, et saada Võrreldes metsikut tüüpi tubakaga, on üleekspressiooniga taimedel tumedamad kroonlehed ja suurem antotsüaniini üldsisaldus [31].

Selles uuringus on CtCHS geeni ekspressioonitase seotud Cistanches tubulosa lillede värviga. See väljendub tugevalt tumedamates lillades ja punastes õites ning vähe heledates valgetes õites. CtCHS-i ekspressioonierinevus võib olla tingitud erinevusest Cistanches tubulosa lilledes. Üks põhjusi, miks on erinevad ülikonnad ja värvid. Kokkuvõttes kloonis see uuring CtCHS geeni Cistanche deserticola lilledest ja viidi läbi selle bioinformaatika analüüs. CtCHS rekombinantne valk saadi eksogeense ekspressiooni teel Escherichia colis. Ensüümi aktiivsuse analüüs tõestas, et CtCHS valk võib katalüüsida 4-kumaroüülkoensüümi. A ja malonüülkoensüüm A genereerivad naringeniin-kalkooni. Leiti, et CtCHS geen ekspresseerub tugevalt lillades ja punastes õites ning vähe valgetes õites. Need tulemused näitavad, et CtCHS geen võib reguleerida Cistanche deserticola erinevate õievärvide tootmist, mis on kasulik Cistanche tubulosa õievärvi regulatsioonimehhanismi edasistele uuringutele ja on viiteallikaks järgnevateks uuringuteks CtCHS rolli kohta õievärv Cistanche deserticola.