Cistanche Tubulosast pärit kalkooni süntaasi kloonimine, funktsionaalne tuvastamine ja ekspressioonianalüüs

Kokkuvõte: eesmärk

Funktsiooni uurimisekskalkoon süntaas Cistanche tubulosa'stja CtCHS geeni ekspressioonimuster valgetes, punastes ja lillades lilledes.

meetodidCtCHS geen klooniti RT-PCR abil ja viidi läbi bioinformaatika analüüs. Plasmiid pET-28a-CtCHS kanti üle Escherichia colisse, et kutsuda esile valgu ekspressioon IPTG abil. CtCHS rekombinantset valku inkubeeriti substraatidega p-kumaroüül-CoA ja malonüül-CoA ning produktid tuvastati HPLC ja MS-ga. Plasmiid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS kanti üle Arabidopsis thaliana protoplasti, et jälgida CtCHS valgu subtsellulaarset lokaliseerumist. CtCHS geeni ekspressioonimuster C. tubulosa kolmevärvilistes lilledes tuvastati qRT-PCR abil.

TulemusedCtCHS geen klooniti. Avatud lugemisraami (ORF) pikkus oli 1173 aluspaari, kodeerides 390 aminohapet, ja valgu molekulmass oli 42 8000.

ORGAANILINE CISTANŠEKSTRAKT 30% EHHINAKOOSIIDI JA 12% AKTEOSIIDIGA

CtCHS sisaldas katalüütilisi jääke Cys164, His303, Asn336, mis konserveeriti kalkooni süntaasis. CtCHS valk ekspresseeriti E. coli-s ja puhastati rekombinantse valgu saamiseks. CtCHS valk võib katalüüsida p-kumaroüül-CoA-d ja malonüül-CoA-d, et toota naringeniini kaltooni. CtCHS valk paiknes peamiselt tsütoplasmas. CtCHS geen ekspresseeriti tugevalt lillades ja punastes õites ning suhtelised ekspressioonitasemed olid vastavalt 8,44 ja 3,21 korda kõrgemad kui valgetes lilledes.

Järeldus CtCHS geen klooniti C. tubulosa õiest ja ekspresseeriti valk. CtCHS valgul on kalkooni süntaasi funktsioon ja CtCHS geeni ekspressioon on suurem tumedamates õites, mis näitab, et CtCHS geen võib reguleerida C. tubulosa õievärvi, mis paneb aluse edasistele uuringutele C õievärvi regulatsioonimehhanismi alal. tubulosa.

Võtmesõnad: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkooni süntaas; ensüümi aktiivsuse analüüs; subtsellulaarne lokaliseerimine; väljendusanalüüs

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT on perekond pürealistlik taim, mis on looduslikult levinud Xinjiangi lõunaosas [1] Xinjiangi Hetiani piirkonnas [2]. Torulilledel on kõrge raviväärtus. Selle lihavarred on üks 2020. aasta versiooni allikatest.Hiina farmakopöa". [3] Piibulillede kordonuse lihavarte uurimine on suurenenud, kuid tema õite bioloogilisi uuringuid on suhteliselt vähe. Piibulillede õitsemisperiood on aprillist maini [4], peamiselt Valget on kolme värviga. , punased ja lillad Piibulilled on rikkaliku värviga, kuid nende õite värvi reguleerimise mehhanismi ei ole kirjeldatud ja geneetilised tegurid [5] Taimede lillede pigment sisaldab peamiselt kolme kategooriat: flavonoidid, karoteen ja beetiin, mis on kõige laiemas valikus. Flavonoidide tüübid ja sisaldus mõjutavad paljude taimede värvi kui Paeonia Lactiflora Pall kolm sorti.

See näib valgena ja värvi põhivärv sisaldab punast värvi ja ilus kompetents muudab lilled lilla-punaseks [8]. Lillevärv on paljude ilutaimede oluline tunnus ja see on ka võtmetegur, mis meelitab ligi roosasid putukaid [9]. Uuringud on näidanud, et see kandub edasi. Kõige sagedamini külastab putukaid sügavlillat tsitanche taime [10]. Bioloogiliste uuringute jaoks, mis käsitlevad tsistanoidide sünteetilisi geneetilisi uuringuid torulillede cistanosauruse lilledes, aitab see selgitada torulille kordoni värvimise kontrollimehhanismi, andes teoreetilise aluse geenitehnoloogia tehnoloogia värvi parandamiseks, edendades selle rikkalikumaid värve, suurendades vaatamisvõimet, rakenduste ulatuse laiendamine.

Biosünteesi radaflavonoididalgab tähegafenüülpropanoidi rada. Fenüülalaniin muundatakse esmalt fenüülalaniini ammoniaalaasi (PAL) toimel kaneelhappeks ja kaneelhape 4-hüdroksüülib kaneelhappega. Ensüüm (kaneelhappe-4-hüdroksülaas, C4H) ja 4-kumaraatkoensüümi A ligaas (4-kumaraatkoensüüm A ligaas, 4CL) katalüüsivad reaktsiooni, tekitades 4-kumaroüül-CoA [11]. Kalkoonsüntaas (CHS) katalüüsib ühte 4-kumaroüül-CoA molekuli ja kolme malonüül-CoA molekuli, et tekitada naringeniini kalkoon, millel onflavonoidühendidKalkoonisomeraasi, flavanoon-3-hüdroksülaasi, dihüdroflavonool4-reduktaasi jne põhiskelett genereerib mitmesuguseid flavonoide, nagu isoflavoonid, flavonoolid, antotsüaniinid jne [12]. Flavonoidide biosünteesiraja võtmeensüümina reguleerib CHS flavonoidide sisaldust taimedes ja mängib olulist rolli ka taimede õite värvuse reguleerimisel [13]. Näiteks Gentiana scabra Bunge CHS-i transkriptsioonijärgne geenivaigistamine võib pärssida antotsüaniinide biosünteesi ja põhjustada korollasagarate spetsiifilist valgenemist [14]. Actinidia eriantha Benthi CHS geeni vaigistamine. CHS vähendab antotsüaniini sisaldust kroonlehtedes ja põhjustab Punaste kroonlehtede värvus muutub heledamaks [15]. Seetõttu klooniti selles uuringus CtCHS geen Cistanche deserticola lilledest ning sellel viidi läbi bioinformaatika analüüs, prokarüootne ekspressioon ja puhastamine, ensüümi aktiivsuse analüüs, subtsellulaarne lokalisatsiooni analüüs ja ekspressioonianalüüs kolme värvi lilledega, et uurida CtCHS funktsiooni. valku ja CtCHS geeni ekspressioonimustrit kasutati CtCHS ja Cistanche deserticola õievärvi vahelise seose esialgseks uurimiseks, mis pani aluse Cistanche deserticola lillevärvi regulatiivse mehhanismi uurimisele.

1 Materjalid ja instrumendid

1.1 Materjalid

Cistanche tuberosa lilled koguti Yutiani maakonnast Hotani prefektuurist Xinjiangist mais 2018. Proovide võtmisel järgiti juhuslikku põhimõtet ning valiti hea füsioloogilise seisundi ja ühtlase taimekõrgusega Cistanche tuberosa õied. Pekingi ülikooli farmaatsiakooli professor Tu Pengfei võttis kolm Cistanche deserticola tüve kolme õievärviga valge, punane ja lilla ning tuvastas need kui Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Need külmutati kiiresti vedelas lämmastikus, hoiti kuival jääl ja transporditi Pekingisse. E. coli DH5 keemiliselt pädevad rakud osteti ettevõttelt Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. ja E. coli BL21 (DE3) keemiliselt pädevad rakud osteti ettevõttelt Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor osteti ettevõttest Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonüül-CoA osteti ettevõttelt Sigma Company, 4-kumaroüül-CoA, naringeniin -kalkoon osteti ettevõttelt Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. ja naringeniin osteti ettevõttelt Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumendid

Nanodrop 2000C spektrofotomeeter (Thermo Fisher Company, USA); gradient-PCR instrument (Eppendorf Company, Saksamaa); CFX 96 fluorestsents-kvantitatiivne PCR-seade, UVP-geelkuvar, geelelektroforeesi seade, valguelektroforeesi instrument (BioRad Company, USA); EnSpire

Mikroplaadi lugeja (PerkinElmer Company, USA); konstantse temperatuuriga inkubaator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D suure võimsusega täistemperatuuri ostsillaator (Taicangi katseseadmete tehas); THZ-82Veevanni konstantse temperatuuriga ostsillaator (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ülipuhas töölaud (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); kõrgsurveauru sterilisaator (TOMY Company, Jaapan); Milli Q puhta vee instrument (Millipore, Ameerika Ühendriigid); LC-20Kõrgetõhus vedelikfaasi kromatograaf (Shimadzu Company, Jaapan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap kõrglahutusega massispektromeetria (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokaalne mikroskoop (Olympus Company, Jaapan).

2 Eksperimentaalsed meetodid

2.1 RNA ekstraheerimine ja cDNA süntees. Cistanche deserticola lilled jahvatati vedelas lämmastikus ja seejärel viidi läbi RNA ekstraheerimise test.

Kogu RNA ekstraheeriti komplekti (Norgen, Cat 17200) abil, RNA kontsentratsioon ja kvaliteet tuvastati NanoDrop 2000C abil ning cDNA pöördtranskriptsiooni sünteesiks valiti RNA proovid, mille A260/A280 suhe oli vahemikus 1,8 kuni 2,1. Kvalifitseeritud kogu-RNA cDNA-ks pöördtranskribeerimiseks kasutati M-MLV pöördtranskriptaasi (Promega, M170B). Eksperimentaalsed toimingud viidi läbi vastavalt juhistele.

2.2 CtCHS geeni kloonimine

Meie uurimisrühma Cistanche deserticola lillede transkriptsiooniandmete [16] põhjal sõeluti välja täieliku avatud lugemisraamiga CtCHS ja geenijärjestuse põhjal spetsiifiliste praimerite kujundamiseks kasutati tarkvara SnapGene (tabel 1). PCR amplifikatsioon viidi läbi, kasutades matriitsina Cistanche deserticola lille cDNA-d. Amplifikatsioonisüsteem oli 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, üles- ja allavoolu praimerid (10 μmol/L) kumbki 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super Fidelity

DNA polümeraas 1 μL, ddH2O 17 μL. Reaktsioonitingimused olid järgmised: eeldenatureerimine 95 kraadi juures 3 minutit; 25 denatureerimistsüklit 95 kraadi juures 15 sekundit, lõõmutamist 55 kraadi juures 15 sekundit ja pikendamist 72 kraadi juures 1 min; ja reaktsiooni pikendamine 72 kraadi juures 5 minutit. PCR saadus tuvastati 1% agaroosgeelelektroforeesiga ja geeli taastamiseks kasutati DNA puhastuskomplekti (Novizan, Cat DC301-01) ning seejärel puhastati saadud DNA kiirkloonimiskomplektiga (Novizan, Cat). C601-01). DNA fragment ligeeriti pCE2 TA/Blunt-Zero vektoriga, transformeeriti Escherichia coli DH5 kompetentsetesse rakkudesse ja pärast üleöö kultiveerimist 37 kraadi juures valiti välja üksikud kloontüved ja saadeti ettevõttele sekveneerimiseks.

Tabel 1 Praimeri järjestused

2.3 Bioinformaatika analüüs

Kasutage ProtParami võrgutarkvara valgu füüsikaliste ja keemiliste omaduste analüüsimiseks; kasutage valgu hüdrofiilsuse/hüdrofoobsuse analüüsimiseks võrgutööriista Prot Scale; kasutada võrgutööriista SOPMA, et ennustada valkude sekundaarset struktuuri; kasutada veebipõhise analüüsi tarkvara SWISS-MODEL valgu tertsiaarse struktuuri ennustamiseks; kasutada võrgutarkvara TMHMM Ennusta valgu transmembraanset struktuuri; kasutada DNAMAN tarkvara, et võrrelda CtCHS-i homoloogiat teiste liikide CHS-i aminohappejärjestustega; kasutage fülogeneetilise puu konstrueerimiseks MEGA-X tarkvara, kasutades naaberliitumist (NJ) ja Poissoni korrektsiooni. Evolutsiooniline kaugus arvutatakse Bootstrapi meetodil ja Bootstrapi korduste arv on 1000 korda.

Edasiseks tuvastamiseks kasutati UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS-i. Vedelfaasi tingimused olid Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolonn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonni temperatuur 40 kraadi, naringeniin , kalkoon ja naringeniin. Kontrollaine laadimismaht on 4 μL ja ensüümi reaktsiooniprodukti laadimismaht on 7 μL. Liikuva faasina kasutatakse vett (A)-atsetonitriili (B). Elueerimisgradient on: 0 kuni 5 min, 30% B; 5 kuni 15 min. , 30% ~ 60% B; 15-20 min, 60-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100-30% B. Mahuline voolukiirus on 0,3 ml/min. Massispektromeetria tingimused on elektropihustusiooni allikas, kandegaasina lämmastik, mantligaasi rõhk 3,5 MPa, lisagaasi rõhk 1,0 MPa, pihustusrõhk 3500 V, kapillaari temperatuur 350 kraadi, lisagaasi kuumutamise temperatuur 200 kraadi, positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimid, skaneerimine ioonivahemik m/z on 100-1500, MS täiseraldusvõime on 35 000, dd-MS2 eraldusvõime on 17 500, (N)

CE/astmeline nce on seatud väärtusele 35, 60.

2.6 CtCHS valgu subtsellulaarne lokaliseerimine

CtCHS järjestuse ja õmblusteta kloonimise põhimõtte alusel kavandati praimerid ensüümi lõikamissaitidega Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ ning vastavad sihtfragmendid amplifitseeriti PCR abil. Plasmiid pCAMBIA1300-35S-GFP lõigati restriktsiooni endonukleaasidega Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ ning sihtfragment ja vektor ühendati läbi õmblusteta kloonimiskomplekti (Novizan, Cat C115-01) ning seejärel kanti üle. E. coli DH5 kompetentsetesse rakkudesse. , valige järjestamiseks üksikud kloonitüved ja ekstraheerige plasmiidid õigetest tüvedest. Plasmiidid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ja pCAMBIA 1300-35S-GFP transformeeriti Arabidopsis thaliana protoplastideks, kasutades PEG4000, ja kultiveeriti nõrgas valguses 8–10 tundi. CtCHS valgu subtsellulaarset lokaliseerimist täheldati laserkonfokaalse mikroskoobi all.

2.7 CtCHS ekspressioonimustri analüüs

CtCHS järjestuse põhjal kasutati DNAMAN-i reaalajas fluorestsents-kvantitatiivsete praimerite kujundamiseks, kusjuures sisemise võrdlusgeenina oli F-box. Praimeri järjestused on näidatud tabelis 1. CtCHS suhteline ekspressioon erinevat värvi Cistanche deserticola lilledes tuvastati reaalajas fluorestsents-kvantitatiivse PCR abil. Kasutage TransStart Greeni qPCR SuperMixi (täiskuldne, AQ101-02), et mõõta SYBR Greeni fluorestsentsvärvimeetodiga, reaktsioonisüsteem: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, üles- ja allavoolu praimerid (10)

μmol/L) {{0}},2 μL kumbki, cDNA matriits 0,5 μL, nukleotidaasivaba vesi 4,1 μL, reaktsiooni läbiviimiseks kasutati kaheastmelist meetodit ja reaktsiooniprotseduur põhines meetodil Dong Xianjuani jt. [18]. Iga proov sisaldas 3 bioloogilist kordust ja katset korrati kolm korda. Katseandmeid analüüsiti Excel to 2 abil

CtCHS suhteline ekspressioon arvutati -ΔΔCt meetodi abil ja GraphPad Prism 8 kasutati olulisuse analüüsi tegemiseks ja histogrammide joonistamiseks.