Kliiniline metaboolne analüüs koos biosünteesiraja jälgitavusega: uus lähenemine Hiina Materia Medica kvaliteedimarkerile

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Esiletõstmised

"Kliiniliste aktiivsete koostisosade avastamine juhisena, metaboolsete transformatsioonide pöördanalüüs lülina ja biosünteesi radade jälgitavus kui võtmetähtsusega", uus uurimisstrateegia Hiina materia medica (CMM) kvaliteedimarkeri avastamiseks, edendab CMM-i kvaliteedistandardit.

cistanchesaabravida neeruhaigustparandada neerufunktsiooni

Abstraktne

Hiina materia medica (CMM) kvaliteedimarker (Q-marker) mängib olulist rolliCMMtooted. Selle uurimisstrateegia ja tehnika jäävad aga ebaselgeks. Lähtudes asjaolust, et kvaliteedistandardCMMtuleb seostada kliinilise efektiivsusega. Võtke Jing1 Jiangtangi tablettravi2. tüüpi diabeetnäitena. avastatakse ja valideeritakse Q-marker, mis on seotud aktiivsusega ravimite metabolismi pöördanalüüsi kaudu kliinikutes ja botaaniliste biosünteesiradade jälgitavuse kaudu. Seetõttu pakkusime välja CMM-i Q-markeri uue uurimisstrateegia, mille eesmärk on "juhisena kliiniliste aktiivsete koostisosade avastamine, lülina metaboolsete transformatsioonide pöördanalüüs ja võtmetähtsusega biosünteesiradade jälgitavus", et parandada CMM-i kvaliteedikontrolli.CMMtooted.

Märksõnad: Hiina materjalimeditsiin, kvaliteedimarker, kliiniline metaboolne analüüs, biosünteesirada, Jinqi Jiangtangi tablett,2. tüüpi diabeet

Lühendid: Q-marker, Quality marker; CMMChiina materia medica; CAS,(S)-kanadiini süntaas; STOXX, (S)-tetrahüdroprotoberberiini oksüdaas; JOJTT, Jinqi Jiangtangi tabletid; UPLC, üliefektiivne vedelikkromatograafia; UPLC-MS/MS, üliefektiivne vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria; STZ, streptosotsiin; HFD, kõrge rasvasisaldusega dieet; FBG tühja kõhu veresuhkru tase; PBG söögijärgne vere glükoosisisaldus; OGTT, Suukaudne glükoositaluvuse test.

akteosiidsissecistancheavaldavad head mõjuneerud

Taust

KvaliteedikontrollHiina materia medica (CMM)on oluline alus CMM-i ohutuse ja efektiivsuse tagamisel ning see on ka pikka aega Hiina meditsiini standardimisuuringute võtmeküsimus ja keeruline. CMM-i kvaliteedimarker (O-marker) on traditsioonilises maailmas muutunud kuumaks probleemiksHiina meditsiinmillel on oluline roll CMM-i kvaliteedikontrollis [1]. Selle uurimisideest ja tehnikast on saanud võtmetähtsusega teaduslikud küsimused, mis nõudsid laiendamist ja täiustamist. Praegu on aktiivsete koostisosade eraldamise ja bioaktiivsuse test CMM-i Q-markeri avastamiseks peamine uurimisstrateegia. See lähenemisviis võib aga olla suures osas pime, ebakindel, aeganõudev ja töömahukas. CMM-i Q-markeri teooria, tehniliste meetodite ja uurimisteede rikastamiseks ja täiustamiseks on vaja edendada CMM-i kvaliteedi hindamise mudeli transformatsioone ja arendusi, mille tuumaks on Q-marker. Strateegia, mis põhineb ravimite metabolismi pöördanalüüsil kliinikutes ja botaaniliste biosünteetiliste radade jälgitavusel kuni CMM-i Q-markeri avastamiseni, on kasulik täiendus praeguste Hiina meditsiini Q-markeri uurimise ideede ja lähenemisviiside laiendamiseks.

Seetõttu pakume CMM-i Q-markeri kontseptsioonist, põhimõttest ja algsest kavatsusest välja uudse uurimisidee Q-markeri avastamiseks ja valideerimiseks, valides näidisravimiks märkimisväärse kliinilise efektiivsusega Jinqi Jiangtangi tabletid (JQJTT). [2,3]. Lähtudes asjaolust, et CMM-i kvaliteedistandard peaks olema korrelatsioonis kliinilise efektiivsusega, oleks tõhus alustada bioaktiivsete koostisosade tuvastamisest kliinilistes proovides (nt veri, uriin), millele järgneb bioaktiivse aine avastamiseks jälgitavus botaaniliste biosünteetiliste radade kaudu. ja omased peamised sekundaarsed metaboliidid, mis võivad olla potentsiaalne O-marker. Klassikalise hüpoglükeemilise hindamismudeli lõpliku valideerimisega saab kinnitatud O-markerit edastada ja jälgida, võimaldades selle kättesaadavust kogu JOJTT tootmisprotsessi kvaliteedikontrollis. See strateegia rõhutab "REVERSE" - kliinilisest ravimite metabolismi profiilist kuni peamiste botaaniliste vaheühenditeni biosünteesi radades -, mis tagab, et avastatud Q-marker on kliiniliselt ja botaaniliselt seotud, ühendades otseselt CMM-i loomuliku omaduse ja kliinilise tähtsuse. See CMM-i Q-markeri uus kontseptsioon koos "juhisena kliiniliselt aktiivsete koostisosade avastamine, metaboolsete transformatsioonide pöördanalüüs kui lüli ja biosünteesiradade jälgitavus kui võtmetähtsusega" pakub kasulikku strateegiat teoreetiliseks innovatsiooniks, tehnoloogiliseks läbimurdeks ja uurimistööks. idee laiendada CMM-i kvaliteedikontrolli.

JQJTT, klassikaline iidne valem, ilmus esmakordselt Qianjin Fangis, mis avaldati aastal 652 AD (Hiina Tangi dünastia), on salvestatud Hiina farmakopöa 2015. aasta väljaandesse (1. köide), mis koosneb Coptis Chinensisest, Astragalus membranaceusest ja Lonicerast. japonica). Hiina farmakopöa 2015. aasta väljaande (1. köide) kohaselt valmistati kolm keedutükki alkaloidiekstraktiks,

vastavalt saponiini ekstrakt ja orgaanilise happe ekstrakt; ja segatakse tablettide valmistamiseks. Topeltpimedas platseebokontrolliga randomiseeritud kliinilises uuringus kinnitati, et JQJTT-l on bioaktiivsused, nagu vere glükoosisisalduse alandamine, lipiidide metabolismi ja insuliinitundlikkuse parandamine, kindel terapeutiline toime II tüüpi diabeedile [4]. JQJTT kvaliteedistandard vajab aga veel parandamist.

CMN-i Q-markeri kontseptsioon ja praegused uuringud

CMM-i O-marker on toorravimile omased või töötlemise käigus tekkinud keemilised koostisosad, mis on tihedalt seotud CMM-i atribuudi ja CMM-i ohutust ja efektiivsust kliinikus kajastavate näitajatega. Q-marker peaks vastama neljale põhinõudele [1]: (1) Q-marker on olemas töötlemata ravimites, ekstraktides ja (või) preparaatides; (2) O-marker peaks olema kvalitatiivselt identifitseeritud ja kvantitatiivselt määratud ning olema tihedalt seotud CMM-i funktsionaalsed omadused;(3)Q-marker on kooskõlas traditsioonilise hiina meditsiini teooria ja praktikaga;(4)Q-markeril on ülekantavuse ja jälgitavuse omadused. CMM-i Q-markeri uuenduslikul akadeemilisel kontseptsioonil on oluline akadeemiline väärtus ja praktiline tähendus CMM-i kvaliteedistandardite uurimisel. Selle uurimisideest ja tehnilistest meetoditest on saanud võtmetähtsusega teadusküsimused, mis nõudsid täiustamist.

Peamine uurimistee CMM-i Q-markeri kohta

Peamine uurimistee Q-markeri leidmiseks on keemilise koostisosa tuvastamine, eksklusiivse koostisosa avastamine ja selle bioaktiivsuse valideerimine, millega saavutati mitmel juhul edu [5,6]. Kuna tegemist on selle valdkonna levinud uurimisteega, on sellisel meetodil siiski mõningaid paratamatuid puudusi. Tavalise CMM-i keemilisi koostisosi on juba suures osas uuritud ning uute koostisainete leidmine on raske ja töömahukas. Siiani pole teada, kas eksklusiivne koostisaine on väljaselgitav või on need seotud bioaktiivsusega, pealegi on tavaliselt raske kinnitada, kas leitud koostisaine on tõesti ainulaadne, et ainukomponent oleks fütokeemia arengus mittevälistav. . Näiteks koptisiini peetakse üldiselt C. Chinensise ainueks koostisosaks, kuid on teatatud, et koptisiini saab eraldada ka Corydalis yanhusuo WT Wangist[7]. Peale selle võib ainukomponendi bioaktiivsust olla raske hinnata, kui see on madal või raskesti kontsentreeritav. Seetõttu uurime CMM-i Q-markeri põhimõtte kohaselt uut uurimismeetodit, mis põhineb Q-markeri konnotatsioonil, et seda tuleks seostada kliinilise efektiivsusega ja seda saab kasutada CMM-i kvaliteedi hindamiseks, mis rõhutab põhiatribuute. "seotud kliiniline efektiivsus, botaaniliselt omane, töötlemisel jälgitav ning kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt tuvastatav".

Nagu kõigile teada, tuleks pärast suure hulga koostisosade (potentsiaalne Q-marker) saamist fütokeemilise eraldamise teel kinnitamiseks järgida nende bioaktiivsuse hindamist. Kuid lisaks asjaolule, et kõigi isoleeritud koostisosade bioaktiivsust on võimatu hinnata, on rakkude või loomadega tehtud uuringute ja kliinilise efektiivsuse vaheline seos halvasti selgitatud, mis viib "pseudo-Q-markeri" avastamiseni, mida on raske tuvastada. kontrolli kvaliteeti ja seosta kliinikuga [8-11]. Seetõttu võis aktiivsed koostisosad välja selgitada terminaalse kliinilise toime põhjal. Tegelikult saab nende metabolismi reegli selgitamist in vivo ja ülesvoolu prototüüpi või metaboliite vastupidiselt analüüsida, mis on kliinikuga seotud potentsiaalse Q-markeri uurimiseks ülioluline.

Sekundaarsete metaboliitide sisemine omadus ja bioaktiivsuse seos annavad olulise vihje Q-markeri uurimiseks

Taimede biosünteesiteede sekundaarsed metaboliidid on CMM-i aktiivsete koostisosade peamine allikas, mida mõjutavad pinnas, kliima, sümbiootilised organismid, kultiveerimismeetodid ja muud tegurid taimede kasvu ja arengu ajal, moodustades oma ainulaadsed biosünteesirajad [12]. . Ehkki samast allikast pärit taimede keemilised koostisosad (prekursorid, vahesaadused ja sekundaarsed metaboliidid) on erineva struktuuriga, koosnevad nad enamasti teatud põhistruktuuriüksusest ja moodustuvad erinevatest olemuslikest koostisosadest. Lisaks on saavutatud piisavaid saavutusi tavalise CMM-i [13-15] aktiivsete koostisosade (sekundaarsete metaboliitide) biosünteesi radadel. Näiteks berberiini, ühe C. Chinensise aktiivse koostisosa, biosünteesi rada kuulub bensüülisokinoliini alkaloidide sünteesirada. Bensüülisokinoliini alkaloidide süntees algab L-türosiinist, mis moodustab mitmeastmelise ensümaatilise reaktsiooni kaudu kaks peamist vaheühendit, sealhulgas (S)-scoreliin ja (S)-tetrahüdrokolumbamiin. Seejärel muudetakse (S)-tetrahüdrokolumbamiin berberiiniks (joonis 1), aga ka struktuurilt sarnasteks aktiivseteks koostisosadeks, nagu koptisiin, palmatiin, kolumbamiin ja magnofloriin [16], mis viib teadusliku küsimuseni, kas C. Chinensise kvaliteedikontroll suudab teostada kontrollides (S)-tetrahüdrokolumbamiini või (S)-scoreline'i, mis on C. Chinensise teadaolevate aktiivsete koostisosade ühine ülesvoolu võtmevaheühend. Kui see nii on, on CMM-i kvaliteedi hindamiseks võimalik korreleerida ja kontrollida mitut sarnase struktuuri ja toimega allavoolu aktiivset koostisosa. Seetõttu on uue lähenemisviisi strateegia – "aktiivsed koostisosad avastatakse kliinikust, aktiivsete koostisosade ülesvoolu prototüüpe või metaboliite analüüsitakse in vivo metaboolse reegli järgi vastupidiselt ja need olemuslikud koostisosad toimivad potentsiaalse Q-markerina" on uuenduslik arendus laienemiseks. CMM-i Q-markeri praegused uurimisteed (joonis 2).

JQJTT Q-markerit saab uurida integratsioonistrateegia abil - "Kliiniliste aktiivsete koostisosade avastamine, metaboolsete transformatsioonide pöördanalüüs ja biosünteesi radade jälgitavus"

Praegu kontrollib JQJTT kvaliteeti osaliste koostisosade kvalitatiivne ja kvantifitseerimine ning preparaatidele esitatavad üldnõuded, mis ei ole piisavad, et kajastada koostise terviklikku kvaliteeti ning mida on raske ühendada toorravimite, keetmistükkide ja -jälgede kvaliteedi edastamise ja jälgimisega. ettevalmistused. Oma suhteliselt lihtsa koostise, suures osas uuritud bioaktiivsete koostisosade metabolismi in vivo ja botaaniliste biosünteesiradadega võib JQJTT olla mudel, mis edendab CMM-i Q-markeri avastamist ja valideerimist.

JQJTT esindusliku proovi tootmine ja kvaliteedikontroll ning JQJTT-ga manustatud patsientide seerumi kogumine

JQJTT preparaat on toodetud kvalifitseeritud Coptis Chinensis, Astragalus membranaceus ja Lonicera japonica abil, järgides Hiina farmakopöa 2015. aasta väljaandes (1. köide) kirjeldatud tehnikat. Riiklike kohustuslike standardite alusel saab mitme koostisosa määramist ja keemilist sõrmejälge rakendada toorravimite, keedutükkide ja preparaatide kvaliteedi terviklikumaks hindamiseks, mis tagab hilisemate uurimistulemuste võrreldavuse ja jälgitavuse. Pealegi, järgides meditsiinieetikat ning kaasamise ja välistamise kriteeriume, peavad patsiendid2. tüüpi diabeetneile antakse JQJTT ja nende seerumiproovid kogutakse.

JQJTT imendunud koostisosade ja ainevahetusproduktide tuvastamine ja nende pöördanalüüs vastavalt transformatsioonidele

Väljakujunenud metoodika alusel määratakse JQJTT imendunud koostisosad ja nende ainevahetusproduktid UPLC-QTOF/MSE või UPLC-Q-Orbitrap MS/MS abil ning võib oletada tundmatut ühendi struktuuri ja lahknevaid koostisosi. Järgmisena saab pöördanalüüsi strateegiat järgides oletada ja selgitada veres imendunud JOJTT koostisosi ja nende transformatsioonireeglit vastavalt koostisosade ja nende saaduste struktuursetele metaboolsetele omadustele (joonis 3).

JQJTT koostisosade muundamise reegel on jälgitav pärast "toorravimeid, keedutükke ja preparaate"

Verre imendunud koostisosade ja nende metaboliitide selgitamisel tuvastab UPLC või UPLC-MS/MS need JQJTT-ga seotud toorravimite, keedutükkide ja preparaatide koostisosad, et jälgida ja analüüsida ning lõpuks tagada, millised sekundaarsed metaboliidid peaksid olema keskendunud töötlemata ravimitele või taimedele.

Verre imendunud koostisosade ja nende metaboliitide selgitamisel tuvastab UPLC või UPLC-MS/MS need JQJTT-ga seotud toorravimite, keedutükkide ja preparaatide koostisosad, et jälgida ja analüüsida ning lõpuks tagada, millised sekundaarsed metaboliidid peaksid olema keskendunud töötlemata ravimitele või taimedele.

JQJTT potentsiaalse Q-markeri avastamine botaaniliste biosünteetiliste radade abil

Selgitatud biosünteesiradade abil valitakse kvaliteetse ülekandevõimega ja jälgitavate omadustega imendunud koostisosad, et analüüsida nende ülesvoolu sekundaarseid metaboliite või peamisi vaheühendeid, mida saab määrata potentsiaalsete Q-markeritena, kui need on bioaktiivsed, omased ja suudab edastada kvaliteeti ning on jälgitav ja tuvastatav.

JQJTT Q-markeri valideerimine klassikalise hindamismudeli abil, mis on seotud terapeutilise toimega

JQJTT potentsiaalseid Q-markereid analüüsitakse kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt UPLC või UPLC-MSMS abil. Hiina farmakopöa järgi viiakse JQJTT erinevate partiide bioanalüüsid läbi kehtestatud hüpoglükeemilise mudeli järgi rakkudes (insuliiniresistentsuse rakkude mudel, mis on loodud HepG2 rakkudega)[17] ja loomadel (rotid, keda toidetakse rasvarikka dieediga, millele järgneb intraperitoneaalne süstimine). streptosotsiin)[18]. Mitme muutujaga statistilise analüüsi abil hinnatakse O-markeri ja hüpoglükeemilise aktiivsuse vahelist olulisust ning lõpuks kinnitatakse JQJTT Q-marker. Vajadusel saab kontrollimiseks kasutada retrospektiivset kliinilist vaatlust.

Kõike eelnevat silmas pidades ühendame ühised ideed ja tehnikad, et luua uus lähenemine CMM-i Q-markerile,

mis põhineb "Kliiniliste aktiivsete koostisosade avastamisel, metaboolsete transformatsioonide pöördanalüüsil ja biosünteesi radade jälgitavusel", et rikastada ja täiustada CMM'Q-markeri teooriat ja tehnilisi meetodeid (joonis 4).

Arutelu

Uuendusliku kontseptsiooni ettepanek Q-marker korvab praeguse kvaliteedikontrolli puudujäägi, millel on olulised akadeemilised väärtused ja praktiline tähendus. Ja selleks, et edendada CMM-i kvaliteedikontrolli revolutsiooni ja arengut, mille tuumaks on O-marker, tuleb uurimistöö ideed ja tehnikat laiendada ja täiustada.

Seoses asjaoluga, et CMM-i kvaliteedistandard peaks olema korrelatsioonis kliinilise terapeutilise toimega, pakume selles artiklis välja uudse ideoloogia, mille kohaselt O-markeri avastamine võib alata bioaktiivsete koostisosade tuvastamisest kliinilise vaatluse põhjal, millele järgneb pöördanalüüs. ravimite metabolismi kohta in vivo. See strateegia ületab puuduse, et tavapäraseid kvaliteedikontrolli uuringuid on raske seostada kliinilise ohutuse ja efektiivsusega, ning takistab tavapäraste uuringute pimedust ja juhuslikkust. Meie ettepanek soodustab CMM-i praeguse kvaliteedikontrolli ideaalset uuenduslikkust, mille eeltingimuseks on kindel terapeutiline toime ja selgitatud biosünteesi rada. Peale selle peame märkima, et uus strateegia on uus uurimine, mitte praeguse CMM-i Q-markeri uurimismeetodi eitamine. Kindlasti on meie CMM-i Q-markeri uurimismeetoditel vältimatud piirangud. Näiteks saab seda uurimisstrateegiat rakendada botaaniliste, mitte loomsete või mineraalsete ravimite puhul. Ja uuritavate botaanilised biosünteesirajad ja keemilised ained tuleks osaliselt välja selgitada. Lisaks võib kliiniliste proovide võtmine olla mõne labori jaoks ebamugav. Sellest hoolimata peaks uurimistee olema mitmekesine, järgides CMM-i O-markeri kontseptsiooni, põhimõtet ja algset eesmärki. Igal uurimisstrateegial on teatud rakendusala. Seda tuleks valida ja muuta vastavalt erinevatele uurimisobjektidele, et ühiselt edendada CMM-i Q-markeri teooria ja tehniliste meetodite innovatsiooni ning arendamist.

Viited

1. Liu CX, Cheng YY, Guo DA jt. Hiina ravimite kvaliteedi hindamise ja protsesside kontrollimise kvaliteedimarkeri uus kontseptsioon. Chin Herb Med, 2017. 9: 3−13.

2. Yue SJ, Liu J, Feng WW jt. Huangqi ja Huangliani sünergilise mehhanismi süsteemfarmakoloogial põhinev dissektsioon suhkurtõve korral. Front Pharmacol 2017. 8: 694.

3. Gao LH, Liu Q, Liu SN jt. Rafineeritud JinQi-JiangTang tablett leevendab diabeedieelset seisundit, vähendades insuliiniresistentsust ja parandades hiirte beeta-rakkude funktsiooni. J Ethnopharmacol 2014. 151: 675-685.

4. Chao M, Zou D, Zhang Y jt. Insuliiniresistentsuse parandamine traditsioonilise hiina meditsiiniga II tüüpi diabeediga patsientidel. Endocr, 2009. 36(2): 268.

5. Zhong Y, Zhu J, Yang Z jt. Q-markeril põhinev strateegia Hiina meditsiini CMC-uuringuteks: Panaxi notoginšenni saponiinide juhtumiuuring. Fütomeditsiin, 2018. 44: 129-137.

6. Liao M, Shang H, Li Y jt. Integreeritud lähenemisviis kvaliteedimarkerite avastamiseks, mis on aluseks Alisma Orientale'i mõjudele lipiidide metabolismile, kasutades keemilist analüüsi ja võrgufarmakoloogiat. Fütomeditsiin, 2018. 45: 93−104.

7. Shi JM, Han WL, Ye WC jt. Corydalis yanhusuo WTWangi keemiliste koostisosade uuring. Nat Prod Res Dev (Chin), 2011. 23: 647-651.

8. Feng WW, Zhang Y, Tang JF jt. Keemilise sõrmejälgede võtmise kombinatsioon biotestiga, eelistatav lähenemisviis safloori süstimise kvaliteedikontrolliks. Anal Chim Acta, 2018. 1003:56−63.

9. Yan D, Xiong Y, Ma LN jt. Ettepanek Hiina materia medica kvaliteedi hindamise mustri ja õige režiimi kehtestamise kohta kliinilise efektiivsuse põhjal. Chin Tradit Herbal Drugs (Chin), 2013. 44(1): 1−5.

10. Reardon S. Hiiremaja võib katsed rikkuda. Paljude kordumatute näriliste katsete taga on keskkonnategurid. Loodus, 2016. 530: 264.

11. Yan D, Liu J, Wang AT jt. Traditsioonilise hiina meditsiini domineerivate haiguste mehhanismi uurimisideede uurimine tõenduspõhise meditsiini põhjal. Chin J Chin Mater Med (Chin), 2018. 13: 2633−2638.

12. Zi J, Mafu S, Peters RJ. Giberelliinidele ja kaugemalegi! (Di) terpenoidide metabolismi evolutsiooni uurimine. Annu Rev Plant Biol, 2014. 65(1): 259−286.

13. He SM, Liang YL, Cong K jt. Coptis liikide bensüülisokinoliini alkaloidide biosünteesis osalevate geenide tuvastamine ja iseloomustamine. Front Plant Sci, 2018. 9: 731.

14. Kojima M, Uritani I. Klorogeenhappe biosünteesi uuringud maguskartuli juurekoes, pidades silmas klorogeenhappe vaheühendi eraldamist. Plant Physiol, 1973. 51: 768-771.

15. Moses T, Papadopoulou KK, Osbourn A. Saponiinide, biosünteetiliste vaheühendite ja poolsünteetiliste derivaatide metaboolne ja funktsionaalne mitmekesisus. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2014. 49: 439-462.

16. Ma Y, Guo J, Mao YP jt. Ravimtaimede aktiivsete koostisosade biosünteesiteede ja selle kättesaadavuse analüüs. Chin J Tradit Chin Med Pharm, 2017. 32: 2079-2083.

17. Song JJ, Wang Q, Du M jt. Kaseiinglükomakropeptiidist tuletatud peptiid IPPKKNQDKTE leevendab AMPK signaaliülekande aktiveerimise kaudu HepG2 rakkudes kõrget glükoosist põhjustatud insuliiniresistentsust. Mol Nutr Food Res, 2017. 61: 1600301.

18. Mansor LS, Gonzalez ER, Cole MA jt. Südame metabolism 2. tüüpi diabeedi uues rotimudelis, kasutades kõrge rasvasisaldusega dieeti koos väikese annuse streptozototsiiniga. Cardiovasc Diabetol, 2013. 12:136-136.